Name: 집단 운동 특성을 분석하기 위해 1차 마우스 배아 성 성 메센키메 세포의 격리 및 시간 경과 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 학습하세요 1차 마우스 배아 구개 중간엽 세포 격리 및 시간 경과 이미징을 통해 집단 운동 특성을 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 구개판 상승 역학 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 국립 보건원 보조금 DE026172 (I.S.), GM102801 (A.C.)에 의해 부분적으로 지원되었다. I.S.는 또한 생물 의학 연구 우수성 센터 (COBRE) 보조금 (국립 일반 의학 연구소 P20 GM104936), 캔자스 IDeA 생체 의학 연구 우수 보조금 (국립 일반 의료 과학 P20 GM103418), 캔자스 지적 발달 장애 연구 센터 (KIDDRC) 보조금 (KIDDRC) 보조금 (KidDRC) 및 국립 보건 연구소 (키드 르 크)에 의해 부분적으로 지원되었다 HD090216).

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<li>Goering, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPECC1L-deficient+palate+mesenchyme+cells+show+speed+and+directionality+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1452(2021).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-mediated+PDGFRalpha+signaling+regulates+survival+and+proliferation+in+skeletal+development+through+p53-dependent+intracellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways.</a> Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).</li>
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성구 선반 고도는 수직에서 수평 리모델링 이벤트1,3,4,9,11을구성한다. 이 리모델링 과정은 성구 선반 중간엽 세포가 정성있게 행동하도록 요구한다고 가정합니다. 야생형 MEPM 세포를 가진 분석은 이 세포 행동이 본질적이고21의양수일 수 있다는 것을 보여줍니다. 따라서, 이러한 검사는 갈라진 입맛의 새로운 및 기존 마우스 모델에서 1 차성 성구 선반 고도 결함을 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 섹션 1과 2에 설명된 방법은 조사관이 기본 MEPM 세포의 알리쿼트분리, 배양 및 동결 알리쿼트하도록 허용해야 합니다. 이러한 세포는 여기에 설명된 2D 배양 및 상처 수리 어설션을 포함한 다양한 용도...

미각 발달은 성기사 발생에 결함이 갈라진 입맛-고립된 케이스에서 또는 증후군1의수백의 일환으로 생기는 일반적인 출생 결함으로 이끌어 내면서 광범위하게 연구되고 있다1,2. 배아 입맛의 발달은 배아 조직의 운동과 융합을 수반하는 동적 과정입니다. 이 과정은 네 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다 : 1) 성술 선반의 유도, 2) 혀 옆에 있는 성구 선반의 수직 성장, 혀 위의 성구 선반의 3) 고도, 그리고 4) 중간선1,3,4에서성구 선반의 융합. 지난 수십 년 동안 많은 마우스 돌연변이체가갈라진 구개5,6,7,8을나타내는 것으로 확인되었습니다. 이러한 모델의 특성화는 성구 선반 유도, 증식 및 융합 단계의 결함을 나타내고 있습니다. 그러나, 성구 선반 고도 결함은 드물다. 따라서, 성구 선반 고도의 역학을 이해하는 것은 연구의 흥미로운 영역입니다.
성병 선반 고도 결함이있는 일부 마우스 돌연변이체의 신중한 분석은 성병 선반의 매우 전방 영역이 뒤집는 것처럼 보이는 것을 보여주는 현재 모델로 이어졌으며, 성골 선반의 수직적 또는 "리모델링"은 입맛1,3,4의중간에서 후방 부위로발생합니다. 9,10,11. 성구 선반의 내측 가장자리 상피는 이 리모델링에 필요한 신호를 시작하고, 이는 그 후 성구 선반 mesenchyme에 의해 구동됩니다. 최근, 많은 연구자들은 태아 선반(12,13)과관련된 일시적인 경구 접착력을 보여 마우스 모델에서 성구 선반 고도 지연을 확인했다. 중간엽 리모델링은 수평 방향으로 벌지를 만드는 세포의 재구성을 포함하며 동시에 수직 방향9,10,14에서성구 선반을 후퇴시킵니다. 성병 선반 고도 및 근본적인 중간엽 리모델링에 영향을 미치기 위해 제안된 여러 메커니즘 중세포증식(15,16,17,화학작용성 그라데이션18,및 세포외 매트릭스 구성요소19,20)이있다. 중요한 질문이 발생: Specc1l-결핍마우스에서 관찰된 성환 선반 고도 지연은 또한 부분적으로 성병 선반 리모델링의 결함으로 인해, 그리고 이 리모델링 결함은 1차 MEPM 세포의 행동에 본질적인 결함에서 나타날 수있는 21?
1차 MEPM 세포는 유전자 발현22,23,24,25,26, 27,28,29,및증식(30,31) 및 이주를 포함하는 몇 가지 연구를 위해 두개안면 분야에서 사용되어왔다. 그러나 집단 세포 행동 분석에 대한 것은 없습니다. MEPM 세포의 시간 경과 이미징은 MEPM 세포가 집단운동(21)의방향 이동 및 형성된 밀도 의존세포 스트림-특성을 표시한다는 것을 보여주기 위해 2D 배양 및 상처 수리 소약으로 수행되었다. 더욱이, Specc1l 돌연변이 세포는 더 좁은 세포 스트림을 형성하고 높게 가변적인 세포 이주 궤적을 보여주었습니다. 이러한 조정된 운동성의 부족은 Specc1l 돌연변이배아(13,21)의미각 고도 지연에 기여하는 것으로 여겨진다. 따라서, 1차 MEPM 세포를 이용한 이러한 비교적 간단한 작용체는 성술 선반 고도 동안 중간엽 리모델링을 연구하기 위한 프록시역할을 할 수 있다. 이 논문은 2D 및 상처 복구 분석을 위한 1차 MEPM 세포의 격리 및 배양뿐만 아니라 시간 경과 이미징 및 분석을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>비커, 250mL(x2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Matheson Gas</td><td>UN1013</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 15mL(x1)</td><td>Midwest Scientific</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Debian 운영 체제</td><td></td><td></td><td>타임랩스 이미지의 컴퓨터 분석</td></tr><tr><td>Dulbecco의 Modified Eagles 중/고 포도당(4mM) L-글루타민 및 피루브산나트륨</td><td>싸이티바 생명과학</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>EtOH, 100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Auto</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS 온스테이지 인큐베이터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMC1000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS 온스테이지 용기 홀더, 멀티웰 플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEPVH028</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>파인 포인트 #5 스테인리스 스틸 집게 (x2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>해부</td></tr><tr><td>기기 살균기 비드 욕조</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Microcetrifuge 튜브, 1.5mL</td><td>Avant</td><td>2925</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Dissecting 스테인리스 스틸 가위, 스트레이트</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>해부</td></tr><tr><td>NucBlue (Hoechst) 라이브 레디 프로브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 용액, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 인서트, 2-웰</td><td>Ibidi</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>소형 천공 스테인리스 스틸 스푼</td><td>미세 과학 도구</td><td>MC17C</td><td>해부</td></tr><tr><td>스프링 가위, 4mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>멸균 10cm 접시Corning</td><td></td> <td>430293</td><td></td></tr><tr><td>멸균 12웰 플레이트</td><td>PR1MA</td><td>667512</td><td></td></tr><tr><td>멸균 6웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>멸균 PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>멸균 플라스틱 전구 이송 피펫</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>202-1S</td><td></td></tr><tr><td>트립신, 0.25%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

집단 운동 특성을 분석하기 위해 1차 마우스 배아 성 성 메센키메 세포의 격리 및 시간 경과 이미징

Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

입맛의 발달은 혀 옆에 있는 양측 의 성술 선반의 수직 성장을 수반하는 역동적인 과정이며 혀 위의 고도 와 융합이 뒤따릅니다. 이 프로세스에 있는 결점은 갈라진 구개, 일반적인 출생 결함으로 이끌어 내습니다. 최근 연구에 따르면 성구 선반 고도에는 선반의 방향을 수직에서 수평으로 변환하는 리모델링 프로세스가 포함됩니다. 이 동적 리모델링에서 성구 선반 중간엽 세포의 역할은 연구하기 어려웠습니다. 시간 경과-이미징 기반 정량 분석은 최근 1차 마우스 배아 성 구종 중간엽(MEPM) 세포가 집단 운동으로 자가 조직할 수 있음을 보여주기 위해 사용되었습니다. 정량적 분석은 미각 고도 결함이있는 마우스 모델에서 돌연변이 MEPM 세포의 차이를 식별 할 수 있습니다. 이 논문은 E13.5 배아에서 MEPM 세포를 분리하고 배양하는 방법을 설명하며, 특히 시간 경과 이미징을 위해- 그리고 스트림 형성, 모양 정렬 및 방향의 지속성을 위한 측정을 포함하여 집단 운동의 다양한 세포 특성을 결정합니다. 그것은 MEPM 세포고도의 동적 과정에서 구성 선반 mesenchyme의 역할을 연구하기위한 프록시 모델 역할을 할 수 있음을 posit. 이러한 정량적 방법을 사용하면 두개골 면안면 분야의 조사관이 대조군 및 돌연변이 세포의 집단 운동 특성을 평가하고 비교할 수 있으며, 이는 팔성 선반 고도 동안 중간엽 리모델링에 대한 이해를 증대시깁니다. 더욱이, MEPM 세포는 일반적으로 집단 세포 운동의 조사를 위한 희소한 중간엽 세포 모형을 제공한다.

성구 선반의 해부는 그림 1에설명되어 있습니다. 절개 순서는 조직의 미끄러짐을 최소화하도록 설계되었습니다. 머리제거(도 1A,B)에따라 아래턱이 제거됩니다(도1B,C). 머리의상부(도 1C,D)의절개는 거꾸로 배치할 때 조직을 안정화하기 위해 수행된다(도1E,점선),핀치(도1F),및 소비세(도1G)팔성 선반.
단일 배아의 절제된 성구 선반...

우리는 2차원 (2D) 성장 및 상처 복구 분석의 시간 경과 화상 진찰을 위한 1 차적인 마우스 배아 성 구형 중간엽 세포의 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 세포 스트림 형성 및 방향 운동성을 결정하기 위하여 시간 경과 화상 진찰 데이터의 분석을 위한 방법론을 제공합니다.

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and ...

이 프로토콜을 통해 두개골 면안면 분야의 조사관은 태아 선반 고도 동안 중간엽 리모델링을 이해하기 위한 수단으로 제어 및 돌연변이 세포의 집단 운동 특성을 정량적으로 비교할 수 있습니다. 1 차마우스 배아 성 구형 중간엽 세포 및 시간 경과 화상 진찰의 사용은 성구 선반 고도 역학을 평가하기위한 접근 가능한 프록시 방법을 제공합니다. 마우스 배아에서 사발 껍질을 수확하려면 멸균 천공 숟가락을 사용하여 배아 일 13.5 배아를 스테레오 현미경으로 멸균 MEPM 배양 배지로 채워진 멸균 10 센티미터 접시에 넣습니다.참수 후, 살균 된 미세 한 No.5 의 한 쪽 끝을 뺨 안쪽에 입에 넣고 두개골 뒤쪽을 나갈 때까지 집게 끝을 밀어 넣습니다. 다른 팔이 외이도 바로 위에 마우스를 가져가도록 집게를 방향을 조정한 후 집게를 꼬집어 조직을 잘라냅니다. 머리 의 반대편에 절개를 반복, 아래턱까지 핀치 컷 절차를 계속, 혀, 두개골의 열등한 부분이 제거 될 때까지, 구체 선반을 노출.머리를 옆으로 놓고, 작은, 멸균, 스테인레스 스틸 가위 한 쌍의 팁을 태아의 눈 수준에 대한 두개골 앞과 뒤에 배치하고 두개골의 두개골을 제거하기 위해 눈 바로 위에 잘라, 평평한 표면을 만듭니다. 다음으로, 접시 의 바닥에 평평하게 놓여있는 우수한 측면으로 머리를 거꾸로 놓고 머리의 앞쪽 절반에 있는 중앙 홈의 양쪽에 두 개의 제기 된 다리로 볼 수있는 팔성 선반을 찾습니다. 머리에 머리를 접시에 고정하려면 머리 앞쪽의 비강 부위 근처의 조직을 통해 미세 한 집게의 한 쪽 끝을 성골 선반에 삽입하고 다른 한쪽은 두개골 후방의 베이스를 통해 성술 선반에 삽입합니다.선반의 측면 표면의 기지에서 조직에 매우 날카롭고 미세한 집게의 두 번째 쌍의 두 점을 삽입하고 천천히 조심스럽게 꼬집어 조직을 잘라냅니다. 선반의 내측 표면 의 기저와 선반의 전방 및 후방 끝에서 선반을 머리에 부착한 다음 부드럽게 선반을 들어 올려 주변 조직에서 껍질을 완전히 풀어주도록 필요에 따라 추가 핀치를 만듭니다. 두 번째 성술 선반이 동일한 방식으로 제거되면 멸균 플라스틱 전구 이송 파이펫을 사용하여 선반을 얼음에 약 500 마이크로 리터의 멸균 1.5 밀리리터 미세 센트심분리기 튜브로 옮깁니다.MEPM 세포 배양을 설정하려면 모든 선반이 수집되었을 때 조직을 방해하지 않고 PBS를 흡입하고 즉시 성구 선반 조직의 각 튜브에 섭씨 0.25 %의 37도 의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 조직을 몇 번 피펫하고 5분 후에 잠시 파이펫을 피우며 37도에서 10분 동안 조직을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 튜브에 MEPM 배양 배지의 800 마이크로리터를 추가하고 세포를 수집하기 위해 튜브를 원심분리하기 전에 조직을 다시 피펫.상체를 심은 후, 튜브 당 신선한 MEPM 배양 배지의 1 밀리리터에 펠릿을 회수하고, 우물 당 2 밀리리터를 포함하는 6 웰 조직 배양 처리 플레이트의 개별 우물에 세포를 플레이트, 다음 세포가 살균 세포 배양에서 12 시간 동안 플라스틱 표면에 부착 할 수 있도록. 2D 집단 이동 분석기를 설정하려면, 각 시료에 대해 약 1밀리미터의 높이로 멸균 2웰 실리콘 인서트의 상단을 제거하고 멸균 집게를 사용하여 6웰 플레이트의 개별 우물의 중앙에 멸균 2웰 인서트를 플레이트에 플레이트한다. 모든 가장자리를 따라 누릅니다.상처 수리 분석서를 설정하려면 멸균 집게를 사용하여 수정되지 않은 멸균 2웰 실리콘 인서트를 샘플 당 6웰 플레이트의 중앙에 배치하고 인서트 가장자리를 단단히 눌러 배양 판에 삽입을 부착하십시오. 그런 다음 각 삽입배지내의 100마이크로리터에서 평방 밀리미터당 1, 400세포를 종자1, 400세포로 배양하고 세포 배양 배지에서 48시간 동안 세포를 배양한다. 2D 집단 이동 분석서를 수행할 때, 큰 배양 접시에 있는 2웰 실리콘 인서트에 세포를 파종하는 것은 일반적으로 화상 진찰을 위한 더 나은 세포 밀도를 제공합니다.35mm 접시에 놓인 작은 3D 프린팅 링은 2D 운동성 분석에도 사용할 수 있습니다. 상처 수리 해석의 경우, 세포는 높은 합류까지 두 웰 실리콘 인서트에서 재배됩니다. 그런 다음 삽입을 제거하고 상처가 닫을 때까지 이미지화됩니다.MEPM 궤적은 지속적이고 세포 운동성의 방향은 몇 시간 동안 유지됩니다. 평균 변위 대 시간 분석은 변위 형태의 지속성이 경과된 시간에 비례한다는 것을 나타냅니다. 운동성 데이터의 유동 분석은 공동 움직이는 MEPM 세포 클러스터가 약 300미크론 크기임을 보여준다.야생 유형과 돌연변이 MEPM 세포 사이의 심오한 운동성 차이도 관찰됩니다. 이 절차는 각종 형질전환 마우스 라인에 이용되고 세포 운동에 그들의 효력을 공부하기 위하여 각종 생화확적인 시약으로 MEPM 세포를 취급하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 우리는 1 차적인 성구 mesenchyme 세포에 집중했습니다, 그러나 시간 경과 화상 진찰 및 정량 분석은 또한 동적 발달 프로세스에 있는 어떤 motile 세포 모형의 이주 속성을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

우리는 축 발달과 병행하여 자기 조직화, 대칭 파괴 및 신장을 표시하는 마우스 배아 줄기 세포의 응집체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 기술을 사용하면 축 방향 발달 과정과 단층 배양에서 수행하기 어려운 세포 유형의 생성을 연구할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포의 집계의 세대 대칭 속보, 양극화 및 응급 집단 행동은보기가<em&gt; 체외</em

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

여기, 우리는 공 촛점 현미경을 사용하여 마우스 보조 입천장 융합의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 형광 기자 마우스 라인과 기계적 통찰력을위한 경로 억제제와 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 발달 시스템의 라이브 이미징에 적용 할 수 있습니다.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

형광 라벨 tangentially 마이그레이션에 대 한 방법을 설명 셀 electroporation, 그리고 마이그레이션 시각화 하기 위해 플랫-마운트 문화에서 레이블이 지정 된 셀 이동의 시간 경과 영상 셀 개발 병아리 광섬유 tectum에 동작 .

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쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.

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배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

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집단 운동 특성을 분석하기 위해 1차 마우스 배아 성 성 메센키메 세포의 격리 및 시간 경과 이미징

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