집단 운동 특성을 분석하기 위해 1차 마우스 배아 성 성 메센키메 세포의 격리 및 시간 경과 이미징
2021년 2월 13일
우리는 2차원 (2D) 성장 및 상처 복구 분석의 시간 경과 화상 진찰을 위한 1 차적인 마우스 배아 성 구형 중간엽 세포의 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 세포 스트림 형성 및 방향 운동성을 결정하기 위하여 시간 경과 화상 진찰 데이터의 분석을 위한 방법론을 제공합니다.
이 프로토콜을 통해 두개골 면안면 분야의 조사관은 태아 선반 고도 동안 중간엽 리모델링을 이해하기 위한 수단으로 제어 및 돌연변이 세포의 집단 운동 특성을 정량적으로 비교할 수 있습니다. 1 차마우스 배아 성 구형 중간엽 세포 및 시간 경과 화상 진찰의 사용은 성구 선반 고도 역학을 평가하기위한 접근 가능한 프록시 방법을 제공합니다. 마우스 배아에서 사발 껍질을 수확하려면 멸균 천공 숟가락을 사용하여 배아 일 13.5 배아를 스테레오 현미경으로 멸균 MEPM 배양 배지로 채워진 멸균 10 센티미터 접시에 넣습니다.
참수 후, 살균 된 미세 한 No.5 의 한 쪽 끝을 뺨 안쪽에 입에 넣고 두개골 뒤쪽을 나갈 때까지 집게 끝을 밀어 넣습니다. 다른 팔이 외이도 바로 위에 마우스를 가져가도록 집게를 방향을 조정한 후 집게를 꼬집어 조직을 잘라냅니다. 머리 의 반대편에 절개를 반복, 아래턱까지 핀치 컷 절차를 계속, 혀, 두개골의 열등한 부분이 제거 될 때까지, 구체 선반을 노출.
머리를 옆으로 놓고, 작은, 멸균, 스테인레스 스틸 가위 한 쌍의 팁을 태아의 눈 수준에 대한 두개골 앞과 뒤에 배치하고 두개골의 두개골을 제거하기 위해 눈 바로 위에 잘라, 평평한 표면을 만듭니다. 다음으로, 접시 의 바닥에 평평하게 놓여있는 우수한 측면으로 머리를 거꾸로 놓고 머리의 앞쪽 절반에 있는 중앙 홈의 양쪽에 두 개의 제기 된 다리로 볼 수있는 팔성 선반을 찾습니다. 머리에 머리를 접시에 고정하려면 머리 앞쪽의 비강 부위 근처의 조직을 통해 미세 한 집게의 한 쪽 끝을 성골 선반에 삽입하고 다른 한쪽은 두개골 후방의 베이스를 통해 성술 선반에 삽입합니다.
선반의 측면 표면의 기지에서 조직에 매우 날카롭고 미세한 집게의 두 번째 쌍의 두 점을 삽입하고 천천히 조심스럽게 꼬집어 조직을 잘라냅니다. 선반의 내측 표면 의 기저와 선반의 전방 및 후방 끝에서 선반을 머리에 부착한 다음 부드럽게 선반을 들어 올려 주변 조직에서 껍질을 완전히 풀어주도록 필요에 따라 추가 핀치를 만듭니다. 두 번째 성술 선반이 동일한 방식으로 제거되면 멸균 플라스틱 전구 이송 파이펫을 사용하여 선반을 얼음에 약 500 마이크로 리터의 멸균 1.5 밀리리터 미세 센트심분리기 튜브로 옮깁니다.
MEPM 세포 배양을 설정하려면 모든 선반이 수집되었을 때 조직을 방해하지 않고 PBS를 흡입하고 즉시 성구 선반 조직의 각 튜브에 섭씨 0.25 %의 37도 의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 조직을 몇 번 피펫하고 5분 후에 잠시 파이펫을 피우며 37도에서 10분 동안 조직을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 튜브에 MEPM 배양 배지의 800 마이크로리터를 추가하고 세포를 수집하기 위해 튜브를 원심분리하기 전에 조직을 다시 피펫.
상체를 심은 후, 튜브 당 신선한 MEPM 배양 배지의 1 밀리리터에 펠릿을 회수하고, 우물 당 2 밀리리터를 포함하는 6 웰 조직 배양 처리 플레이트의 개별 우물에 세포를 플레이트, 다음 세포가 살균 세포 배양에서 12 시간 동안 플라스틱 표면에 부착 할 수 있도록. 2D 집단 이동 분석기를 설정하려면, 각 시료에 대해 약 1밀리미터의 높이로 멸균 2웰 실리콘 인서트의 상단을 제거하고 멸균 집게를 사용하여 6웰 플레이트의 개별 우물의 중앙에 멸균 2웰 인서트를 플레이트에 플레이트한다. 모든 가장자리를 따라 누릅니다.
상처 수리 분석서를 설정하려면 멸균 집게를 사용하여 수정되지 않은 멸균 2웰 실리콘 인서트를 샘플 당 6웰 플레이트의 중앙에 배치하고 인서트 가장자리를 단단히 눌러 배양 판에 삽입을 부착하십시오. 그런 다음 각 삽입배지내의 100마이크로리터에서 평방 밀리미터당 1, 400세포를 종자1, 400세포로 배양하고 세포 배양 배지에서 48시간 동안 세포를 배양한다. 2D 집단 이동 분석서를 수행할 때, 큰 배양 접시에 있는 2웰 실리콘 인서트에 세포를 파종하는 것은 일반적으로 화상 진찰을 위한 더 나은 세포 밀도를 제공합니다.
35mm 접시에 놓인 작은 3D 프린팅 링은 2D 운동성 분석에도 사용할 수 있습니다. 상처 수리 해석의 경우, 세포는 높은 합류까지 두 웰 실리콘 인서트에서 재배됩니다. 그런 다음 삽입을 제거하고 상처가 닫을 때까지 이미지화됩니다.
MEPM 궤적은 지속적이고 세포 운동성의 방향은 몇 시간 동안 유지됩니다. 평균 변위 대 시간 분석은 변위 형태의 지속성이 경과된 시간에 비례한다는 것을 나타냅니다. 운동성 데이터의 유동 분석은 공동 움직이는 MEPM 세포 클러스터가 약 300미크론 크기임을 보여준다.
야생 유형과 돌연변이 MEPM 세포 사이의 심오한 운동성 차이도 관찰됩니다. 이 절차는 각종 형질전환 마우스 라인에 이용되고 세포 운동에 그들의 효력을 공부하기 위하여 각종 생화확적인 시약으로 MEPM 세포를 취급하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 우리는 1 차적인 성구 mesenchyme 세포에 집중했습니다, 그러나 시간 경과 화상 진찰 및 정량 분석은 또한 동적 발달 프로세스에 있는 어떤 motile 세포 모형의 이주 속성을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
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개요
이 프로토콜은 시간차 이미징을 위한 1차 마우스 배아 구개 중간엽 세포의 분리 및 배양을 설명합니다. 이는 두개안면 연구에서 집단 이동 속성을 연구하는 데 도움이 됩니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 두개안면 생물학
- 세포 운동성
- 중간엽 세포 역학
배경
- 구개 선반 상승을 이해하는 것은 두개안면 발달에서 중요합니다.
- 1차 마우스 배아 구개 중간엽 세포는 이러한 과정을 연구하기 위한 모델로 사용됩니다.
- 시간차 이미징을 통해 시간 경과에 따른 세포 행동을 관찰할 수 있습니다.
- 대조군과 돌연변이 세포 간의 비교 분석을 통해 중간엽 재형성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
연구 목적
- 구개 중간엽 세포의 집단 이동을 정량적으로 평가하기 위함입니다.
- 세포 스트림 형성 및 운동성 분석 방법을 제공하기 위함입니다.
- 구개 선반 상승에 관여하는 역학에 대한 이해를 향상시키기 위함입니다.
사용된 방법
- 배아 13.5일째 마우스 배아에서 구개 선반의 분리.
- 현미경 하에서 정밀한 해부를 위해 멸균 도구 사용.
- 최적의 성장을 위해 MEPM 배지에서의 세포 배양.
- 상처 복구 분석 중 세포 행동을 모니터링하기 위한 시간차 이미징.
주요 결과
- 1차 구개 중간엽 세포의 성공적인 분리 및 배양.
- 집단 이동 속성에 대한 정량적 데이터 획득.
- 방향성 운동성 및 세포 스트림 형성에 대한 통찰력.
- 두개안면 생물학의 향후 연구를 위한 방법론 확립.
결론
- 이 프로토콜은 구개 선반 역학 연구를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 시간차 이미징은 세포 행동을 분석하는 데 효과적입니다.
- 연구 결과는 중간엽 재형성에 대한 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative assessment of collective cell movement in a disease-relevant system, providing a proxy model for studying mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation. By isolating primary mouse embryonic palatal mesenchymal cells and applying time-lapse imaging, researchers can measure stream formation, shape alignment, and directional persistence to compare control and mutant phenotypes. The approach supports mechanistic de-risking in target validation by linking cellular behavior to developmental defects, offering predictive value for craniofacial disorder research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying collective movement attributes in control versus mutant MEPM cells.
- Operational Value: Provides a reproducible method to assess mesenchymal cell dynamics as a functional readout for target engagement.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by identifying motility differences associated with palate elevation defects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative outputs such as mean displacement over time and cluster size (~300 microns) for assay standardization.
- Operational Value: Establishes a scalable 2D collective migration assay using silicone inserts for consistent cell seeding and imaging.
- Scientific Value: Enables wound repair assay adaptation to measure closure kinetics as a functional readout of cell motility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses primary MEPM cells as a disease-relevant system to model mesenchymal remodeling in craniofacial development.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by allowing comparison across genetic or pharmacological perturbations.
- Scientific Value: Supports predictive confidence in lead identification by correlating cellular phenotypes with developmental outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early biology and enabling quantitative screening for motility-modulating compounds or genetic perturbations.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by analyzing how genetic mutations alter collective movement in palatal mesenchymal cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized isolation, culture, and time-lapse imaging protocols for reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides trajectory-based measurements including persistence of direction and flow analysis of co-moving clusters for objective comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using a proxy model that reflects in vivo mesenchymal dynamics during palate elevation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying collective cell movement in other dynamic developmental systems beyond craniofacial biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mesenchymal remodeling processes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized cell isolation, plating density (300–1,400 cells/mm²), and imaging conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of motility defects linked to developmental pathology.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in a physiologically relevant mesenchymal model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and sterile tissue handling under microscopy.
- Dependent on access to time-lapse imaging systems and environmental control for long-term culture.
- Necessitates standardization of silicone insert preparation and cell seeding densities across laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending the model to other mesenchymal or migratory cell types.
- Limited by the embryonic stage specificity (E13.5) and viability of primary palatal shelf tissue post-dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Embryonic Palatal Shelf Dissection
2:54
Mouse Embryonic Palatal Mesenchymal (MEPM) Cell Culture
4:07
2D Collective Migration Assay Setup
4:52
Wound Repair Assay Setup
5:28
Results: Representative MEPM Imaging and Collective Movement Analysis
6:33
Conclusion
