Name: 제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 제브라피쉬 눈 형성 과정의 실시간 4차원 이미징 방법을 Danio rerio 배아에서. 레이저 공초점 현미경을 활용한 이 기술은 세포 역학과 조직 발달을 정밀하게 분석할 수 있게 합니다.

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관랩의 과거와 현 멤버들에게 타임랩스 접근법과 이 프로토콜에 대한 논의에 감사드립니다. 이 작품은 NIH (R01 EY025378 및 R01 EY025780에서 KMK에 의해 지원되었습니다. F31 EY030758 - SL; 및 T32 GM007464 ~ MAC).

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<li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+eye+development+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).</li>
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<li>Martinez-Morales, J. R., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Shaping the vertebrate eye.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 19 (5), 511-517 (2009).</li>
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<li>Bogdanovic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb%2FNumbl-Opo+antagonism+controls+retinal+epithelium+morphogenesis+by+regulating+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Numb/Numbl-Opo antagonism controls retinal epithelium morphogenesis by regulating integrin endocytosis.</a> Developmental Cell. 23 (4), 782-795 (2012).</li>
<li>Bryan, C. D., Casey, M. A., Pfeiffer, R. L., Jones, B. W., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+cup+morphogenesis+requires+neural+crest-mediated+basement+membrane+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Optic cup morphogenesis requires neural crest-mediated basement membrane assembly.</a> Development. 147 (4), (2020).</li>
<li>Bryan, C. D., Chien, C. B., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+laminin+alpha+1+results+in+multiple+structural+defects+and+divergent+effects+on+adhesion+during+vertebrate+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of laminin alpha 1 results in multiple structural defects and divergent effects on adhesion during vertebrate optic cup morphogenesis.</a> Developmental Biology. 416 (2), 324-337 (2016).</li>
<li>Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2FEphrin+signalling+maintains+eye+field+segregation+from+adjacent+neural+plate+territories+during+forebrain+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis.</a> Development. 140 (20), 4193-4202 (2013).</li>
<li>England, S. J., Blanchard, G. B., Mahadevan, L., Adams, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+fate+map+of+the+forebrain+shows+how+vertebrate+eyes+form+and+explains+two+causes+of+cyclopia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A dynamic fate map of the forebrain shows how vertebrate eyes form and explains two causes of cyclopia.</a> Development. 133 (23), 4613-4617 (2006).</li>
<li>Gordon, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+cell+motility+and+optic+fissure+and+stalk+formation+during+vertebrate+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates cell motility and optic fissure and stalk formation during vertebrate eye morphogenesis.</a> Development. 145 (22), (2018).</li>
<li>Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+acquisition+of+neuroepithelial+character+in+the+eye+field+underlies+the+onset+of+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis.</a> Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139 (2), 359-372 (2012).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ojoplano-mediated+basal+constriction+is+essential+for+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis.</a> Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).</li>
<li>Miesfeld, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+regulate+retinal+pigment+epithelial+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz regulate retinal pigment epithelial cell fate.</a> Development. 142 (17), 3021-3032 (2015).</li>
<li>Nicolas-Perez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cellular+behavior+and+cytoskeletal+dynamics+reveal+a+constriction+mechanism+driving+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Analysis of cellular behavior and cytoskeletal dynamics reveal a constriction mechanism driving optic cup morphogenesis.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Picker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+coupling+of+pattern+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000214(2009).</li>
<li>Rembold, M., Loosli, F., Adams, R. J., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+cell+migration+serves+as+the+driving+force+for+optic+vesicle+evagination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination.</a> Science. 313 (5790), 1130-1134 (2006).</li>
<li>Sidhaye, J., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+action+of+neuroepithelial+basal+shrinkage+and+active+epithelial+migration+ensures+efficient+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+issue+of+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish issue of Development.</a> Development. 139 (22), 4099-4103 (2012).</li>
<li>Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR-Cas9-based+methods+for+generating+deletion+mutations+and+F0+embryos+that+lack+gene+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR-Cas9-based methods for generating deletion mutations and F0 embryos that lack gene function in zebrafish.</a> Developmental Cell. 51 (5), 645-657 (2019).</li>
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<li>Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+is+the+main+driver+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina.</a> Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).</li>
<li>Suzuki, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+marginal+zone+of+the+zebrafish+retina%3A+clonal+and+time-lapse+analysis+of+a+continuously+growing+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ciliary marginal zone of the zebrafish retina: clonal and time-lapse analysis of a continuously growing tissue.</a> Development. 143 (7), 1099-1107 (2016).</li>
<li>Yoshimatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+partner+selection+during+retinal+circuit+reassembly+varies+with+timing+of+neuronal+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo.</a> Nature Communications. 7, 10590(2016).</li>
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<li>Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+visualization+tool+for+multi-channel+confocal+microscopy+data+in+neurobiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Visualization+and+Computer+Graphics%22%5BJournal%5D)">An interactive visualization tool for multi-channel confocal microscopy data in neurobiology research.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 15 (6), 1489-1496 (2009).</li>
<li>Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoRender%3A+an+application+of+2D+image+space+methods+for+3D+and+4D+confocal+microscopy+data+visualization+in+neurobiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Pacific+Visualization+Symposium%22%5BJournal%5D)">FluoRender: an application of 2D image space methods for 3D and 4D confocal microscopy data visualization in neurobiology research.</a> IEEE Pacific Visualization Symposium. , 201-208 (2012).</li>
<li>Carney, K. R., Bryan, C. D., Gordon, H. B., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LongAxis%3A+a+MATLAB-based+program+for+3D+quantitative+analysis+of+epithelial+cell+shape+and+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">LongAxis: a MATLAB-based program for 3D quantitative analysis of epithelial cell shape and orientation.</a> Developmental Biology. 458 (1), 1-11 (2020).</li>
</ol>

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여기에서, 우리는 광학 컵 형태 발생의 toto 라벨링 및 4D 타임랩스 이미징에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 상이한 세포구를 표시하기 위하여 형광성 단백질을 코딩하는 캡된 RNA를 생성하는 과정을 단계; 제브라피시 1세포 배아 주입; 멀티플렉스 이미징을 위해 아가로즈에 11hpf 배아를 포함; 및 광학 컵 형태 발생 기간 동안 다중 배아의 4D 데이터 세트를 획득 (12-24 hpf).

이러한 정보 밀도데이터 집합을 통해 무수한 질문에 답할 수 있습니다. 4D 데이터는 다양한 방법으로 시각화하고 정량적으로 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜의 범위를 벗어나지만, 여기에 우리의 목표와 표준 응용 프로그램의 일부를 수행할 수 있는 유형의 예로 포함합니다. 물론 정량적 이미지 분석 방법이 지속적으로 개발되고 있으며, 상용 및 맞춤형 도구 모두를 사용할 수 있습니다. 이전에 이러한 메서드를 사용하지 않은 경우 획득한 데이터 집합이 선택한 정량적 분석 접근 방식에 적합한지 확인하기 위해 일부 최적화를 통해 작업할 준비가 되어 있어야 합니다.

파일 크기로 인해 4D 데이터 집합을 시각화하고 정량적으로 평가하는 것은 어려울 수 있습니다. 획득 소프트웨어는 데이터 집합을 개별 배아로 분리하는 데 사용할 수 있으며 ImageJ/Fiji는 공초점 파일을 상용 형식에서 보다 표준 tif 스택으로 변환하는 데 사용할 수 있으며 각 타임포인트는 별도의 파일로 저장됩니다. 이렇게 하면 파일 크기가 줄어들고 파일 형식을 표준화합니다. 각 시점의 개별 광학 섹션은 ImageJ/Fiji를 사용하여 2D(XY) 타임랩스로 조립할 수 있어 데이터의 신속한 2D 시각화 및 평가를 가능하게 합니다. 영화 1은 정확하게 이것의 예입니다: 그림 4I에표시된 최적의 샘플의 타임랩스로 조립 시간이 지남에 따라 하나의 광학 섹션-I''. 거기에서 3D 및 4D 시각화의 경우 일반적으로 자유롭게 사용할 수 있지만 특정 그래픽 카드 요구 사항이있는 FluoRender35,36을사용합니다. FluoRender를 사용하면 모든 축에서 3D 렌더링 된 데이터를 회전하고, 시간이 지남에 따라 데이터 집합을 시각화하고, 모든 평면에서 컷어웨이를 생성하고, 회전 및 시각화를 영화 또는 일련의 tif 이미지로 저장할 수 있습니다.

정량적 분석의 관점에서, 대답 할 수있는 많은 질문이 있습니다. 우리는 광학 컵 형태 신생의 기본 세포 행동을 이해하는 우리 자신의 특정 목표를 돕기 위해 사내 소프트웨어를 개발했습니다. 우리의 프로그램, 롱 트래커, 셀을 추적 하는 위치에 대 한 프록시로 핵 신호를 사용 하 여13. 이러한 데이터를 통해 셀이 언제, 어디서, 어떻게 움직이는지 결정할 수 있습니다. 얼마나 빠르고 얼마나 멀리 세포가 이동하는지; 그리고 세포가 얼마나 자주 분열되는지. 자체 소프트웨어 외에도 4D 셀 추적을 위한 여러 상용 및 맞춤형 옵션이 있습니다. 우리는 또한 세포 분할을 수행하고 신경 망막(37)내에서 세포 모양과 조직을 정량화하는 프로그램 LongAxis를 개발했다. 그러나 LongAxis에 입력하는 데이터 집합은 고해상도로 가져온 단일 Z 스택입니다. 지속적인 과제는 세포가 자신있게 분할될 수 있고 그들의 형태가 추정될 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도로 타임랩스 데이터 집합을 생성하고 있습니다. 한 가지 대안은 우리 등다른 사람들이 발달 눈8,11,13에서수행한 바와 같이, 세포 모양의 직접 시각화를 위해 Kaede와 같은 광변환형 형광을 사용하여 표지하는 모자이크(스파스)이다. 이렇게 하면 셀 세분화 문제가 단순화되고 FluoRender에서 3D 렌더링을 통해 셀 모양과 크기를 쉽게 정량화할 수 있습니다.

이 프로토콜의 각 단계는 당사의 목적을 위해 특별히 최적화되었습니다. 이 프로토콜의 특이성은 몇 가지 한계를 초래합니다: 프로토콜은, 기록된 대로, 제브라피시 눈 발달의 그밖 양상 (망막 신경 발생등), 그밖 눈 구조물, 그밖 발달 단계, 또는 그밖 세포극 구획의 화상 진찰에 최적화되지 않습니다. 포함의 방향, 이미징 속도 및 라벨은 모두 생물학적 질문에 대답 할 수 있도록 설계되었습니다. 망막 신경 발생을 이미지하기 위하여는, 예를 들면, 여기에서 기술한 바와 같이 태아의 등쪽 배향은 관심의 특정 특징의 시각화를 허용하지 않을 수 있고, 화상 진찰의 속도는 적절하지 않을 수 있습니다. 프로토콜의 많은 측면은 특정 관심사와 목표에 따라 다양한 요구에 맞게 조정및 수정할 수 있습니다. 첫째, RNA 주사를 사용하면 라벨링 공정이 매우 유연하게 만듭니다. 형광 단백질 융합 구조는 관심의 세포 전 구조를 표지하는 데 사용될 수 있으며 RNA 주사량은 라벨링을 최적화하기 위해 다양할 수 있다. 광변환 형광펜 카에데와의 작업을 바탕으로 RNA 주사는 12hpf11,13로끝난 번역의 파열을 지원하는 것으로 보인다. RNA 주입에서 형광 단백질 발현의 높은 수준은 광표백에 대항할 수 있었습니다, 그러나 그러한 접근은 관심의 형광 레이블의 지속적인 발현을 지원하지 않습니다. 추후 단계에서 배아를 이미징할 때와 같이 지속적인 발현이 필요한 경우, 형질전환선은 선택사항이며, 제브라피시에 새로운 선을 구성하는 것은 간단합니다24.

다음으로 프로토콜은 개발의 후반 단계에 맞게 조정할 수 있습니다. 안료는 나중에 화상 진찰을 방해할 수 있기 때문에, 태아는 안료 형성을 억제하기 위하여 페닐티오레아 (PTU)로 취급될 수 있고, 또는 안료 합성을 위한 유전 돌연변이를 이용될 수 있습니다. 배아 경련을 방지하기 위해, 트리카인은 아가로즈 및 배아 미디어 오버레이 솔루션에 첨가될 수 있으며, 필요에 따라 아가로즈를 조정할 수 있다. 눈이 성장함에 따라 마운팅 방향을 변경해야 할 수도 있습니다. 여기서는 배아를 등쪽으로 장착하지만, 후기 단계에서관심구조에 따라 측면 또는 전방으로 장착하는 것이 더 합리적일 수 있다. 서로 다른 공간 및 시간 적 척도에서 서로 다른 프로세스가 발생하기 때문에 이미지 수집의 Z 단계 및 시간 단계를 최적화할 수도 있습니다. 이러한 기능은 각 랩의 요구에 대해서만 경험적으로 결정할 수 있습니다.

마지막으로, 이 프로토콜은 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 위해 특별히 개발되었으며, 배아는 눈 발달 초기 단계에서 상대적으로 높은 비율의 아가로즈에 내장되어 있습니다. 하나는 눈 발달 동안 다른 시간 또는 다른 위치에서 이미징하는 경우,이 프로토콜은 관심의 과정에 맞게 조정해야합니다. 많은 다른 이미징 접근 방식은 현재 가능하며 광학 엔지니어가 더 많이 개발되고 있습니다. 각 접근 방식은 이미징을 위해 배아를 포함시키고 장착하는 다양한 방법에서부터 다양한 파일 크기와 형식에 이르기까지 고유한 과제 집합을 제공합니다. 최대 공간 및 시간적 해상도가 포토표백, 광독성 및 방대한 파일 크기와 균형을 이루는 최적화 프로세스를 안내하기 위한 도입에 대한 고려 사항을 간략하게 설명합니다. 우리는 위에서 설명한 실제 적인 정보 이외에, 이 일반적인 원리가, 눈 발달에 있는 많은 열린 질문을 공부하기 위하여 타임랩스 화상 진찰 접근을 설치하는 다른 사람들을 도울 것이라는 점을 희망합니다.

척추 동물 눈 발달은 미래의 뇌 신경 피상성에서 광학 소포의 출현, 또는 질화로 시작됩니다. 그런 다음 광학 소포는 일련의 조직 모양 변화를 겪고, 길어진 다음 질질을 하여 광학 컵을 생성합니다. 광학 컵에서, 신경 망막과 망막 안료 상피, 둘 다 신경 에피톨륨에서 파생된, 표면 ectoderm에서 파생되는 초기 렌즈를 감싸는. 전체 과정은 신경 피상성, 자궁 절제술 및 중간 엽 세포 인구 사이에서 조정된 세포 및 조직 운동 및 분자 신호의 복잡한 시리즈를 요구합니다. 이러한 초기 이벤트는 눈의 기본 구조를 확립하고, 홍채와 각막 형성을 포함한 눈 발달의 후반 단계는 초기 조직에 정교하다. 초기 눈 발달 및 형태 발생에 중단은 아노프탈미아, 미세 절혈증 및 coloboma를 포함하여 인간에 있는 수많은 시각 손상 조건을 기초로 합니다. 광학 컵 형태 발생을 지배하는 세포 및 분자 메커니즘의 잠금을 해제하는 것은 시각 시스템 개발과 이러한 프로세스가 엉망이 될 때 발생하는 병리학 적 조건을 더 이해하는 데 중요합니다.
척추 동물 눈 발달 및 형태 발생에 대한 우리의 이해는 마우스, 병아리, 개구리 및 물고기1,2,3,4,5를포함한 다양한 모형 유기체에서 배아 및 유전 적 접근법에 대한 고전적인 조직학적 연구를 아우르는 엄청난 양의 작업에서 나타났습니다. 이 작업 본체는 초기 눈 발달을 조절하는 분자 메커니즘을 확립했지만, 역사적으로 눈의 형태 발생에 대한 이해가 좋지 않습니다: 3D 구조의 출현. 이 사실 인정의 대부분은 개별적인 시간 점에 화상 진찰 단면 태아에서 왔습니다. 이것은 2 차원에서 조직 형태에 대한 보기를 제공하기에 충분하지만, 형태 발생은 동적 3D 과정입니다. 조직의 모양이 시간이 지남에 따라 3 차원에서 어떻게 변하는지, 단일 세포가 어떻게 동작하는지, 그리고 그 행동이 3D 조직 모양의 변화에 어떻게 기여하는지 결정하기 위해서는 다른 접근법이 필요합니다.
지식에 있는 이 중요한 격차를 해결하기 위하여 1개의 해결책은 기관이 모양을 취함에 따라 세포와 조직의 동적 관측을 실시간으로 가능하게 하는 살아있는 화상 진찰입니다. 불행히도, 이것은 배아 발달의 제약 때문에 많은 모형 유기체에서 쉽게 실현 가능하지 않습니다. 예를 들어, 마우스와 병아리 배아(자궁 내 또는 달걀 껍질 내)는 쉽게 접근할 수 없으며, 많은 살아있는 배아는 광학적으로 투명하지 않아 상당한 광 분산을 일으키고 이미지를 획득할 수 있는 깊이를 제한합니다. Zebrafish는 외부 발달 및 투명한 배아를 통해 안구형태발생6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19의라이브 이미징을 수행할 수 있는 독특한 기회를 제공한다. 충분한 형질전환 및 돌연변이 선도 사용할 수 있으며, 새로운 트랜스제닉 및 돌연변이를 생성하는 도구도20,21,22,23,24를사용할 수 있습니다. 또한, 광학컵 형태발생은 제브라피시에서 급속히 발생하며, 12시간(12-24시간 후 수정, hpf)을 통해 전체 공정의 이미징을 실현가능하게 합니다.
살아있는 화상 진찰 노력은 현미경 법에 개선 그리고 혁신뿐만 아니라, 세포 외 구조의 유전적으로 인코딩 된 중요한 라벨링을 허용하는 형광 단백질 의 가족의 확장 및 최적화에 의해 가속화되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법을 사용하며, 이는 회전 디스크 공초점 현미경 검사법, 선택적 평면 조명 현미경 검사법(SPIM 및 그 변이체), 및 기타 보다 전문적인 현미경 검사법을 포함하여 제브라피시 배아 발생에 대한 다른 현재접근법보다 더 많이 사용된다. 개발 얼룩말 눈의 경우, 우리는 회전 디스크 공초점 현미경 검사법은 조직에서 더 깊은 이미징에 충분하지 않다는 것을 발견했다. SPIM은 매우 빠른 이미징 시간을 자랑하며 점점 더 널리 사용되고 있지만 시각화 및 분석을 위해 대규모 데이터 집합을 처리하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 대조적으로, 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법은 쉽게 접근할 수 있습니다, 특히 광학 하드웨어조립에 있는 전문지식이 부족한 개별을 위해. 우리는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법의 광범위한 가용성이 많은 실험실에 대한 우리의 프로토콜을 유용하게 할 수 있기를 바랍니다.
여기서는 막과 크로마틴을 위한 배아의 토토 라벨링, 이미지 수집을 위한 레이저 스캐닝 공초점 현미경(도 1에서스키마화)을 사용하여 광학컵 형태발생의 4D 데이터 집합을 캡처하는 방법을 설명합니다. 여기에서 사용되는 형광 단백질 (EGFP-CAAX 및 H2A. F/Z-mCherry)는 단일 세포 분해능을 가진 조직 라벨링을 제공하기 위해 선택되었다. 다양한 이미지 분석 및 시각화 기능에 이 프로토콜로 생성된 데이터 집합을 사용합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 전 체형 구조가 원하는 경우 쉽게 적응할 수 있습니다. 혈장 막 라벨링은 세포 형상의 시각화를 위해 선택되었다: 우리는 EGFP-CAAX를 사용하며, H-ras의 마지막 21개의 아미노산이 예일화 신호 서열로 사용되며, EGFP13의C-terminus에 융합된다. 다른 혈장 막 표적 형광 단백질 (예를 들어, 막 간 융합 또는 myristoylated)은 똑같이 작동 할 가능성이 있습니다. 핵을 표시하기 위해 H2A를 선택했습니다. F/Z-mCherry, mCherry는 히스톤 단백질에 융합되어있다 13. 이를 통해 미토틱 스핀들 방향을 포함한 세포 분열이 쉽게 시각화될 수 있습니다.
모든 라이브 이미징 접근 방식을 사용하면 신호 대 잡음 비율, 축 해상도 및 샘플 보존을 극대화하면서 이미징 속도 증가 사이의 절충점을 고려해야 합니다. 우리는 한 번의 실행으로 이미지 품질과 배아수를 최대화하는 방법을 최적화했습니다. 종종, 목표는 동종 가성 돌연변이 배아에서 광학 컵 형태 발생을 이미지하는 것입니다, 이는 광학 컵 형태 발생의 발병과 이종구의 자손에서 야생 유형과 표현할 수 없을 수 있습니다 (배아의 25 %는 원하는 유전자형입니다). 이미지 수집을 최적화한 다음 멀티플렉스를 설정함으로써 동종 자구균 돌연변이 배아의 데이터 집합을 캡처할 가능성이 증가합니다.
시간적 해결 또는 볼륨 데이터(Z-스택)를 획득하는 빈도는 타임랩스 이미징의 핵심 측면입니다. 이러한 데이터 집합의 목적에 따라 속도에 대한 요구 사항이 다릅니다. 처음에 이 프로토콜은 수동 4D 셀 추적을 위해 개발되었습니다. 균일하게 표지된 조직 내의 개별 세포를 추적하는 것은 어떤 한 세포가 지속적으로 시간이 지남에 따라 추적되고 있다는 확신을 제공하기 위하여 충분히 높은 시간적 해결을 요구합니다. 우리는 제브라피시 광학 컵 형태 발생의 Z 스택이 12 h 이상 적어도 3.1 분마다 획득되어야한다는 것을 발견했습니다. 여기에서, 우리는 우리가 매 2.5 분마다 4-5 배아의 Z 스택을 취득할 수 있도록 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 우리의 취득을 최적화했습니다.
Z 단계 크기를 설정하는 것은 프로토콜 최적화에서 중요한 단계였습니다: 3D 렌더링 및 시각화를 위해 Isotropic 데이터는 Z 단계 크기가 XY 픽셀 치수와 동일한 이상적인 값입니다. 실제로 화상 진찰 시간 및 광표백에 대한 제약을 감안할 때 라이브 샘플로 이러한 timelapse 데이터를 획득하는 것은 매우 어렵습니다. 따라서 실험의 렌더링 및 시각화 요구에 적합한 Z 단계 크기를 결정하는 것이 중요하며, 특히 속도를 유지하고 광표백을 방지하면서 축 정보를 최대화하기 위해 X:Y:Z 복셀 비율이 필요한 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 경우, 확립된 복셀 비율은 1:1:3.5(0.6 μm x 0.6 μm x 2.1 μm Z-step 크기)로 40배 의 장거리 근거리 침수 목표를 사용하여 설정하였다. 130-140 μm의 Z 깊이를 획득하면 적절한 시간적 해상도와 약간의 광표백으로 볼륨 데이터를 생성합니다.
위에서 설명한 바와 같이, 이 프로토콜은 플라즈마 막과 크로마틴에 표지된 토토의 배아를 사용하여 제브라피시 광학 컵 형태 발생의 4D 이미징, 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 특이적입니다. 아래 프로토콜은 다양한 실험과 요구에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다. 첫째, 세포 전체 구조와 관련하여 살아있는 세포 마커가 존재하는 모든 구조를 이미지화할 수 있습니다. 다음으로, 여기서 초점은 광학컵 형태발생에만 국한되어 있지만, 타임랩스 이미징은 신경발생25,26,27,28,29,30,31,32,33등 다른 눈 발달 단계에 적응할 수 있다. 이미징 후 개발을 위해, 하나는 배아 고정 (자발적인 근육 활동이 약 24 hpf시작으로), 색소 침착 (약 24 hpf 등장하기 시작), 조직 크기 (눈은 신경 발생 시 볼륨에서 크게 증가), 및 이미징 속도 (관심의 과정의 속도에 따라 조정되어야함)을 고려해야 할 수도 있습니다. 이러한 모든 고려 사항은 쉽게 관리할 수 있습니다. 프로토콜은 매우 유연합니다. 여기에 특정 프로토콜의 세부 사항 외에도, 눈 발달의 라이브 이미징 다른 측면에 관심이있는 사람들을 도울 것입니다 일반적인 원칙이있다.

<table><tbody><tr><td>Delta TPG Dish 0.17mm 투명</td><td>Bioptechs</td><td>0420041500C</td><td>광학 호환성을 위한 커버 글라스 바닥</td></tr><tr><td>일회용 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>전체 길이 14.6cm(53/4")</td></tr><tr><td>Dumont #5, #55 또는 #5SF 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>스타일 #5: 스트레이트 팁, 0.05 x 0.01mm 팁, 이녹스, 11cm 길이의</td></tr><tr><td>화염/갈색 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Immersol W</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>4449690000000</td><td>수분 방출 목표, 할로겐 프리, 저형광</td></tr><tr><td>미세 사출 금형</td><td>적응형 과학 도구</td>용 침지 유체 <td>TU-1</td><td>6개의 경사로, 1개는 90도 및 1개는 45도 경사면.</td></tr><tr><td>Microloader 팁</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Microloader, 유리 마이크로 캐필러리 주입용 팁, 0.5 &ndash; 20 & 마이크로; L</td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 전사 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td>은 SP6 효소 혼합물, 10X 반응 버퍼, 2XNTP&frasl; CAP 솔루션, GTP 솔루션, pTRI-Xef, TURBO DNase, 암모늄 아세테이트 정지 솔루션, 염화리튬 침전 솔루션 및 겔 로딩 버퍼는 모두 &ndash에 저장됩니다. 20°C. 뉴클레아제가 없는 물은 모든 온도에서 저장할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Nikon SMZ645 실체 현미경</td> 배아 주입에 사용되는 <td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>(그림 2B 참조)</td></tr><tr><td>NotI-HF 효소</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td>는 겔 로딩 염료, 보라색 (6X)</td></tr> <tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>미세 해상도, 저융점 아가로 오스</td></tr><tr><td>대물렌즈 LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27</td><td>Carl Zeiss 현미경 421867-9970-000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 SZX16 실체 현미경</td><td>올림푸스</td><td>SZX2-ZB16</td><td>배아 스크리닝, 임베딩에 사용됨(그림 3A 참조)</td></tr><tr><td>페놀 레드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>DPBS 0.5%, 멸균 여과, 내독소 테스트, 세포 배양 테스트</td></tr><tr><td>Pico-liter Microinjector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td>펨토 리터에서 마이크로 리터 주사; 주입 횟수, 시간 및 압력에 대한 디지털 판독값; 주입, 균형, 지우기, 채우기 및 유지를 포함한 5가지 압력 포함</td></tr><tr><td>피펫 펌프 피펫 SP</td><td>Bel-Art</td><td>F37898</td>은 <td>일회용 파스퇴르 피펫에 적합하며, 흡입 또는 분배를 위한 측면에 썸휠이 포함되어 있으며, 빠른 비우기를 위한 플런저가 있습니다.</td></tr><tr><td>프리미엄 얇은 벽 붕규산 유리 모세 필러리</td><td>Warner Instruments</td><td>G100T-4</td><td>1.0 x 0.78 mm</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>QIAquick 스핀 컬럼, 버퍼, 수집 튜브(2ml)</td></tr> <tr><td>포함RNase-free H2O</td><td>Invitrogen</td><td>AM9906</td><td>DNase-Free, 분자생물학 등급, RNase-Free</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>에는 RNeasy Mini Spin Columns, 수집 튜브(1.5ml 및 2ml), RNase-free 시약 및 완충액이 포함되어 있습니다</td></tr>. 스테이지 <tr><td>부착물 Z PIEZO WSB 500</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>432339-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 인서트 Z PIEZO WSB Universal</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>432339-9030-000</td><td></td></tr><tr>Airyscan <td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>포함 Zeiss LSM 880</td><td>N/A</td><td>도립 Axio Observer 현미경</td></tr><tr><td>Zen Black 2.3 SP1 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>N/A</td><td>Zeiss Efficient Navigation(ZEN)은 Zeiss의 모든 광학 현미경 시스템을 제어합니다</td></tr></tbody></table>.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

시각 시스템 기능은 정확한 조직 및 장기 구조의 확립이 필요합니다. 척추 동물 눈에서 구조적 결함은 시각 장애의 일반적인 원인이지만 눈 형태 발생 메커니즘은 여전히 제대로 이해되지 않습니다. 배아 눈의 기본 조직은 척추 동물 전체에 걸쳐 보존된다, 따라서 제브라피시 배아의 라이브 이미징은 정상 및 병리학 적 조건하에서 실시간으로 눈 발달을 직접 관찰하는 강력한 접근 방식이되고있다. 운동, 형태학, 상호 작용, 분열 및 죽음을 포함한 동적 세포 과정은 배아에서 시각화 될 수 있습니다. 우리는 제브라피시의 초기 눈 발달의 세포 체형 및 시간 경과 공초점 현미경 검사법의 균일한 라벨링을 위한 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 1세포 제브라피시 배아로 주입하기 위한 캡된 mRNA를 생성하고, 광학 소포 단계(~12시간 후 수정, hpf)에서 배아를 장착하고, 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 대한 광학컵 형태발생의 다차원 타임랩스 영상을 수행하며, 이러한 다중 데이터셋이 동일한 이미징 세션에서 순차적으로 획득되는 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 셀 추적, 볼륨 측정, 3차원(3D) 렌더링 및 시각화를 포함하여 다양한 목적으로 사용될 수 있는 데이터를 산출합니다. 우리의 접근은 우리가 야생 모형 및 유전 돌연변이 조건 둘 다에서, 광학 컵 발달을 유도하는 세포 및 분자 기계장치를 정확하게 찾아내는 것을 허용합니다. 이러한 방법은 다른 그룹에서 직접 사용하거나 제브라피시 눈 발달의 많은 추가 측면을 시각화하도록 조정할 수 있습니다.

형광 RNA의 주입은 세포 전 라벨을 가능하게 합니다 세포의 혈장 막과 히스톤에 라벨을 붙이는 RNA는 광학 컵 형태 발생의 기초가 되는 개별 세포 형태와 움직임을 포착하기 위해 주입됩니다. 도 2는 1세포 단계에서 제브라피시 배아를 마이크로주입하는 과정의 각 단계를 시연한다. 간단히, 제브라피쉬는교제(도 2E)이며,배아는 사출 몰드(도2J)에채취되어 적재된다. 미세 주입 바늘은 백필(도2H)이며,배아는 균일한 라벨링을 얻기 위해 필요한 단일세포(도 2K-M)에직접 주입된다(도2M, 도 4I-I',Movie 1). 균일한 라벨링 외에도 견고한 형광이 관찰되고 개발이 흔들리지 않고진행됩니다(그림 3B-B').
유효 마운팅은 12-24hpf의 타임랩스 이미징 OCM에 필수적입니다. 장시간 동안 발생하는 광학 컵 형태 발생을 이미지하기 위해 이상적인 배아를 선택하고 각 샘플을 포함시키면서 적절하게 배치하는 것이 중요합니다. 도 3은 11hpf 배아의 성공적인 장착에 대한 자세한 설명을 나타낸다. 주입된 배아는 먼저 충분한 형광을 위해선별된다(그림 3B',B',F',F',F')). 개별 배아는 아가로즈(도3C,C')에침지되고 아가로즈의 개별 낙하에 등등장착된다(도3D,D'). 모든 샘플은 아가로즈의 집단 디스크에 장착된다(도 3E-F'). 배아가 올바르게 준비되고 충분히 형광및 적절하게 장착(그림 3G)샘플은 전체 장기를 이미지 할 수 있도록 타임랩스 기간 동안 이미징 프레임에 머무를 것입니다(그림 4G-G'', I-I'',Movie1). 이러한 단계를 수행하지 못하면 타임랩스 이미징에 최적 샘플이 아닌 장착 된 배아가 발생할 수 있습니다. 회전 정도의 사소한 변화는 타임랩스 동안 배아 성장의 방향에 극적인 영향을 미칠 것이다. 최적 회전은 도 3에서도시되며, 과도하게 회전되는 배아(도3I)를포함하여 보다 후방 타임랩스를 초래하고, 가장 전방 조직만 관찰할 수 있는 배아(도 3J)가 과소 회전되는 배아(도3J)를관찰할 수 있다. 장착 시 적절한 회전 외에도 프레임의 방향에 대해 장착된 샘플은 성공적인 타임랩스를 얻을 가능성이높습니다(그림 4G-G',I-I',Movie 1). 최적의 샘플은 시계 면에 12 및 6시 방향의 전방 후방 축(그림 3G)과 일치하는 접시에 수직으로 지향되는샘플입니다. 최적 이하의 샘플은 수평 또는 대각선(도3H)과같이 이 축에서 지향되지 않는 샘플입니다. 이러한 샘플은 타임랩스가 진행됨에 따라 이미징 프레임에서 자라며 추가 분석을 위해 사용할 수없습니다(그림 4H-H''J-J').
향후 분석에 적합한 타임랩스 데이터 집합 획득 정확하게 주입, 제기 및 장착되는 배아는 성공적인 공초점 이미지 샘플을 만들 것입니다. 도 4는 타임랩스에 대한 최적의 샘플을 나타낸다: 형광도 있고, 견본은 12 hpf입니다. 이미징용 z-스택은 첫 번째 슬라이스가 광학 소포에 불과 하도록 할당되고, 마지막 조각은 12hpf 광학 소포의 복부 경계를 넘어 여러 조각을 남깁니다(도4G-G'). 복부 측을 향한 이러한 편견은 복부 방향에서 조직 성장을위한 과도한 공간을 제공합니다. 이러한 요소는 충족되면 최적의 타임랩스(그림4I-I'I',Movie1)를생성합니다. 최적 이하의 시료는 모자이크 또는 희미한 형광을 가지고 있으며, 이미 12hpf(광학컵 형태발생이 진행 중일 때) 또는 Z 스택 또는 XY 프레임에 제대로 위치하게됩니다(도 4H-H'). 이러한 기준이 충족되지 않을 때, 타임랩스는 더 이상 조직의 전체 3D 부피를 포착하지 않으며 추가 분석에 사용할 수없습니다(그림 4J-J'').
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62155/62155fig01.jpg"> 도 1: 제브라피시 시그컵 형태발생의 4D 타임랩스 이미징의 워크플로우. (A)관심의 세포 전체 구조를 형광라벨로 표시하려면 적절한 캡된 mRNA를 합성한다. (B)1세포 단계에서 제브라피시 배아로 마이크로인젝트 mRNA(들). (C)배아는 광학 소포 단계에서 반전된 공초점 현미경을 위해 등쪽 또는 헤드다운, ~11h 후 수정 또는 3개의 소미트 스테이지를 장착한다. (D)다중 배아는 단일 타임랩스 이미징 세션 동안 순차적으로 배아를 배분할 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62155/62155fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62155/62155fig02.jpg"> 그림 2: 1세포 제브라피시 배아를 마이크로주입하는 시각적 가이드. (A)주사 키트(시계 방향)에 포함시키는 항목: 일회용 니트릴 장갑으로 키트 전체를 보유할 수 있는 중간 크기의 상자; 미세 주입 바늘을 함유 한 요리; 집게; 미네랄 오일의 알리쿼트와 파라필름의 사각형을 잘라; 마이크로 로딩 팁; 얼음에 희석 RNA; 아가로즈 사출 금형; 마커; 롤러/이송 파이펫; 및 P10 파이펫. (B)미세 주입 설정: 외부 압축 가스 원에 연결된 피코 인젝터 옆에 해부 현미경. 발 페달과 마이크로 조작기는 피코 인젝터에 부착됩니다. 마이크로 조작기는 바늘 홀더를 갖추고 현미경 단계 위에 위치에 위치. (C)한쪽에 90도 각도와 다른 쪽에 45도 각도로 6줄의 홈을 포함하는 아가로즈 사출 몰드. (D)피코 인젝터 전면 패널. 압력 디스플레이는 7.8 PSI를 읽습니다. 이 노브 레이블 P주입으로조정할 수 있습니다. 아래에는 주입 압력을 수동으로 트리거하거나 주입 시간을 변경하거나 바늘에 액체를 지우거나 채우거나 보유하는 푸시 버튼이 있습니다. 주입 시간은 08로 설정됩니다(8 x 10 msec에 해당). 출력 호스는 P아웃에 연결되어 주입 바늘에 부착됩니다. 압력 미터 소스 스위치는 주입 압력을 설정하는 동안 P주입으로 설정되며 주사가 이루어지지 않을 때 바늘에 가해지는 기저 압력을 조정하기 위해 P밸런스로 전환 될 수 있습니다. P잔액 레귤레이터는 P주입 레귤레이터 옆에 있습니다. 전원 버튼이 켜져 기기가 켜져 있음을 나타냅니다. (E)성인 얼룩말피쉬는 성인용 생선을 수정란과 분리하고 쉽게 수집할 수 있는 메쉬 바닥이 있는 중첩 된 탱크를 포함하는 작은 사육 탱크에 결합됩니다. 얕은 물 조건을 모방하기 위해 수위가 낮아지고 탱크 칸막이가 제거되어 짝짓기 동작을 시작합니다. (F)마이크로피펫(바늘) 풀러 전면 패널: 바늘을 당기는 데 사용되는 특정 조건을 나타내는 디스플레이가 포함되어 있다. 압력 설정은 P = 500이며, 프로그램이 편집된 마지막 날짜와 시간, 프로그램 번호, HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 및 TIME = 90이 뒤따릅니다. (G)유리 모세관 1개를 마이크로피펫(바늘) 풀러에 삽입하여 제자리에 고정한다. 각 프로그래밍된 풀 런은 두 개의 긴 테이퍼 바늘(빨간색 화살표헤드)을 생성합니다. (H)RNA 희석은 바늘로 역장된다; 페놀 레드 염료는 용액의 쉽게 시각화 할 수 있습니다. (I)바늘의 끝을 부러뜨린 후, RNA의 볼루스는 해부 범위에 안구 망상을 사용하여 측정된다. 이 스테레오현미경의 경우, 30배 총 배율 6 해시 마크는 1nL 부피와 동일하다. (J)수정란은 아가로즈 사출 몰드에 적재되어 롤러 파이펫을 사용하여 금형의 쓰루를 따라 분배된다. (K)1세포 단계 배아를 함유하는 사출몰은 현미경으로 배치되고 배아는 순차적으로 주입된다. (L)주사 바늘은 단일 세포를 대상으로 각 배아에 삽입된다. (M)일단 세포에 들어가면, 발 페달은 조절된 양의 압력과 1nL의 RNA방출을 배아의 세포로 방출하는 데 사용된다(페놀 레드에 의해 시각화된 바와 같이). 스케일 바: I = 0.1mm; L, M = 0.5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62155/62155fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62155/62155fig03.jpg"> 도 3: 이미징용 배아 장착을 위한 시각적 가이드입니다. (A)장착 설정(왼쪽에서 오른쪽으로): 42°C로 프로그래밍된 열 블록, 저용아가로즈의 가열 튜브; 롤러 파이펫; 한 쌍의 집게; 성진 배아를 함유한 아가로즈 코팅 접시; 금속 할라이드 형광램프에 연결된 해부 스테레오현미경. (B,B', B'') EGFP-CAAX mRNA 및 mCherry-H2A mRNA를 주입한 11hpf 배아는 각각 밝은 필드, GFP 형광 및 mCherry 형광으로 나타났다. (C,C') 아가로즈와 끝에 앉아있는 배아를 포함하는 유리 파스퇴 피펫; C'는 확대된 뷰입니다. (D,D') 한 배아는 현미경의 단계에서 현미경 안구를 통해 모두 볼 수있는 유리 바닥 접시에 저용 아가로즈의 액적에 장착. (E,E')12 개의 배아는 유리 바닥 접시에 저용 아가로즈의 개별 방울에 장착, 현미경의 단계에서 현미경 의 단계에서 현미경 의 안구를 통해 모두 볼 수 있습니다. (F,F',F',F', F'') 모든 장착 된 배아는 현미경의 단계에서 와 밝은 필드에 표시된 현미경 눈살에서 모두 볼 수있는 접시의 바닥을 채우기 위해 아가로즈의 완전한 층으로 오버레이됩니다. F'' GFP 형광; 그리고 F'mCherry 형광. (G)12hpf에서 최적의 샘플은 같은 평면에 두 개의 광학 소포와 함께 12 및 6시에 맞춰 등쪽으로 장착되고 수직으로 지향됩니다. (H)최적 이하의 샘플: 등쪽 및 광학 소포가 서로 평면에 장착되어 있지만,이 샘플은 대각선 축을 지향하며 개발이 진행됨에 따라 프레임 크기에서 자랍니다. (I)최적 이하 샘플: 이 샘플은 등쪽 마운트가 아닌 과도하게 회전되며, 그 결과, 광학 소포의 전방 부분이 타임랩스에서 포획되지 않습니다. (J)최적 이하 샘플: 이 샘플은 등쪽 마운트가 아닌 회전이 아니며, 결과적으로 광학 소포의 후방 부분이 타임랩스에서 포획되지 않습니다. 점선은 각 광학 소포를 나타냅니다. 스케일 바: B = 0.1mm; D' = 1.5 mm; E', F' = 2.5 mm; G = 0.1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62155/62155fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62155/62155fig04.jpg"> 그림 4: 여러 위치 타임랩스 및 잠재적 인 결과를 설정합니다. (A) 레이저 스캐닝 공초점 현미경. (B) 피에조 Z 단계 인서트가 있습니다. (C) 아가로즈에 내장된 배아를 함유한 유리 바닥 접시의 바닥은 굴절성 물질과 일치하는 침수 매체로 코팅된다. (D) 침지 배지의 액적은 40x W 목표(장거리 작업 거리)에 배치됩니다. (E) 접시는 무대 인서트와 함께 제자리에 고정되고, E3는 아가로즈 층 위에 첨가되고, 뚜껑은 모델링 점토로 고정된다. (F) 획득 소프트웨어 설정 : 원하는 레이저 라인은 드롭 다운 메뉴에서 켜져 있습니다. EGFP-CAAX RNA 및 H2A-mCherry RNA로 주입된 배아의 경우 아르곤 과 DPSS 561-10 레이저가 켜져 있습니다. 빨간색 강조 표시는 아르곤 레이저가 예열되고 있음을 나타냅니다. 목표 위에 샘플을 찾으려면 현미경 제어판을 통해 전달된 빛이 켜집니다. EGFP와 mCherry 는 트랙 1(동시 이미징용)에 할당되며 각 검출기의 범위가 설정됩니다. 여기서 EGFP 제품군은 494-545 nm로 설정되어 있으며 mCherry 제품군은 598-679 nm로 설정됩니다. 아래 채널 메뉴, 레이저 전원을 설정할 수 있습니다. 레이저가 워밍업한 후, 전력을 최대 5.0까지 증가시킬 수 있으며 게인(master)을 조정할 수 있다. 핀홀은 60.2로 설정되어 있으며, 이는 1.63 개의 에어리 유닛 또는 1.6 μm 섹션과 같습니다. 아래 획득 메뉴, 프레임 크기는 512 x 384로 설정되고, 스캔 속도는 9.0이고, 평균은 양방향이며, 줌은 0.7로 설정됩니다. 아래 Z-스택 공초점이 스캔하는 동안 Z축의 첫 번째 및 마지막 위치가 설정됩니다. 간격(단계 크기)은 2.1 μm로 설정됩니다. 첫 번째 및 마지막 Z 위치를 선택하는 동안, 63 슬라이스의 표준 번호는 일반적으로 유지관리; 이것은 눈의 전반적인 성장을 수용합니다. "사용 압경" 옵션이 선택됩니다. 아래 위치 메뉴, 각 선택한 위치는 할당 된 번호와 X, Y 및 Z 위치를 포함 하 여 나열 됩니다. 추가, 업데이트 또는 제거를 포함하여 이미지에 배아(별도 위치)의 수를 제어하는 추가 버튼이 있습니다. 아래 타임 시리즈 메뉴, 사이클은 300(획득될 Z 스택 수)으로 설정되고 간격(시간 단계)은 2.5분으로 설정됩니다. 설정이 완료되면 시작 시 타임랩스 수집이 시작됩니다. 소프트웨어는 Z 스택의 조각, 주기 및 현재 스캔하는 위치를 표시합니다. 타임랩스가 완료되면 파일의 플로피 디스크 아이콘을 클릭하여 파일이 저장됩니다. 이미지 및 문서 패널. (G-J) 세포막 (green) EGFP-CAAX 및 세포 핵(크로마틴, magenta)는 H2A-mCherry RNA로 표시되어 있습니다. (G,G',G'') 최적으로 장착된 시료에 대한 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스를 설정하는 예입니다. 첫 번째 Z 슬라이스 (등쪽에서)는 등쪽 외형의 비용으로 제공되며, 마지막 Z 슬라이스 (복부 측)는 복부 방향으로의 성장을 수용하기 위해 광학 소포보다 훨씬 낮습니다. (H,H',H'') 최적 이하 의 샘플의 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스를 설정하는 예입니다. 샘플은 약한 mCherry 형광을 가지고 있으며, 개발 광학 컵이 타임랩의 기간 동안 프레임에 머물 가능성이 있도록 대각선으로 장착된다. (나,',',','') 최적의 샘플에서 타임랩의 예. Z 스택 의 중간에서 단일 슬라이스 이미지는 4 시간 지점 (T 값)에서 전체 63 슬라이스 볼륨에서 가져온다. Br, 뇌; NR, 신경 망막; RPE, 망막 색소 상피; 르, 렌즈. (J,J', J',J', J'') 최적이 아닌 샘플에서 타임랩스의 예. 이 경우 샘플은 Z-평면에서 이동하여 전방 광학 컵의 경사 부분만 캡처되었습니다. 스케일 바: G, I = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62155/62155fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
영화 1: 최적의 야생형 배아에서 광학컵 형태발생의 시간 경과. EGFP-CAAX(플라즈마 멤브레인, 녹색)및 H2A로 표지된 야생형 배아의 등쪽 보기. F/Z-mCherry (크로마틴, 마젠타). 타임랩스는 ~12-24hpf이며 전체 4D 데이터 집합의 단일 공초점 섹션을 포함합니다. 시간 간격은 z 스택 사이에 2.5 분이며 초당 22.5 프레임으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62155/Movie1.mov" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

눈 형태 발생에 대한 우리의 이해는 이전 고정 조직 연구에서 비롯됩니다. 그러나, 이러한 연구는 세포와 조직 역학 부족. 시간 경과 이미징을 사용하여 시각화 및 분석을 위해 이 전체 프로세스를 캡처할 수 있습니다.라이브 이미징을 용이하게 하는 제브라피시 배아의 광학 선명도의 외부 개발을 활용하고 대부분의 연구 캠퍼스에서 쉽게 구할 수 있는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사를 사용하는 당사의 방법. 이 방법을 새로 사용하는 연구원은 사용 가능한 데이터 집합을 얻기 전에 몇 가지 시행 착오를 예상해야 합니다. 많은 단계, 특히 주사와 포함, 성공을 위해 잘 가야한다, 그래서 인내심을 가지고.얼룩말물고기가 번식하기 시작하면, 계란이 수정될 수 있도록 15~20분을 기다리는 동안 P10 파이펫과 P10 마이크로리터 팁을 사용하여 RNA 희석의 2.5~5 마이크로리터를 가진 당겨진 유리 모세관 마이크로 주입 바늘을 다시 로드합니다. 계란이 준비되면, 이송 파이펫과 해부 현미경을 사용하여 계란을 사출 몰드에 조심스럽게 로드하고, 집게를 사용하여 배아를 굴려 단일 세포가 필요에 따라 볼 수 있도록 하십시오. 그런 다음 1 세포 단계에서 모든 배아를 주입하여 노른자가 아닌 세포를 표적으로 하여 개발 중인 배아의 균일한 라벨링을 보장합니다.약 11시간 후 수정시, E3 배지에서 1~5밀리리터 알리쿼트의 1.6% 낮은 용융 아가로즈를 42도의 열 블록에 넣고 형광 현미경을 사용하여 전체적인 식물성 밝기를 가진 성공적으로 주입된 배아를 검사합니다. 소미를 세어 배아를 올바르게 무대에 올수 있습니다. 수정 후 11시간에서 3개의 소미트를 관찰해야 합니다.이상적인 샘플은 강력한 EGFP 및 mCherry 신호를 가지고 있으며 올바른 개발 단계에 있을 것입니다. 장착하기 전에 배아를 한천 코팅 접시에 놓고 집게를 사용하여 각 배아에서 초리온을 제거합니다. 모든 배아가 비약되었을 때 유리 롤러 파이펫을 사용하여 하나의 배아를 흡입하십시오.배아가 유리 파스퇴 피펫의 끝에 앉아 열 블록에서 아가로즈의 튜브에 배아를 떨어 뜨리기 위해 가능한 한 많은 E3를 배출합니다. 배아가 배아와 함께 소량의 아가로즈를 심기 전에 몇 초 동안 아가로즈안으로 가라앉게 하고, 배아가 파이펫 끝에 남아 있다는 것을 주의하십시오. 배아와 아가로즈를 유리 바닥 접시에 있는 아가로즈 액적으로 배출하고 재빨리 하지만 조심스럽게 집게를 사용하여 아가로즈 액적경화전에 배아 등쪽을 방향을 지정합니다.동일한 방식으로 10-12개의 배아를 장착한 후, 단일 아가로즈 디스크에 모든 액적을 감싸는 접시의 바닥을 완전히 덮을 수 있는 충분한 아가로즈를 추가합니다. 아가로즈가 경화되면, 아가로즈 위에 E3층을 층으로 레이어하여 샘플을 수화시켰다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 시간 경과 이미징에 적합한 매개 변수로 설정한 후, 유리 바닥 접시의 밑면을 물의 굴절률과 일치시키는 침수 매체로 자유롭게 코팅하고, 기포를 피하기 위해 주의를 기울이고, 40X 물 목표에 작은 침지 배지를 적용한다.단계 삽입에서 유리 바닥 접시를 고정하고 배아를 밤새 촉촉하게 유지하기 위해 추가 E3 배지를 추가합니다. 모델링 점토를 사용하여 접시 위에 플라스틱 뚜껑을 밀봉하고 요리와 접촉하는 목표를 높입니다. 현미경 소프트웨어의 위치 아래, 클릭 추가를 클릭하여 첫 번째 샘플의 XYZ 정보를 저장하여 시간 경과를 하고 강한 형광과 최적의 장착을 갖춘 샘플을 선택합니다.찾기 탭에서 다음 샘플을 검색하고 위치를 클릭하고 추가하여 설명된 대로 샘플을 선택합니다. 모든 샘플을 선택한 경우 첫 번째 위치를 강조 표시하고 이동을 클릭합니다. 지속적으로 스캔하는 동안, 프레임 내에서 광학 소포를 정렬, 광학 소포와 뇌에 비해 전방 및 탈구 영역에 충분한 공간을 떠나.첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스를 할당하려면 먼저 세트를 선택하고 미세 포커스 노브로 Z 방향을 통과하는 동안 마지막으로 설정하여 광학 컵의 성장을 수용하기 위해 총 63의 슬라이스 수를 유지합니다. 성장을 위한 공간을 확보할 수 있도록 광학 소포의 복부 쪽에 여분의 공간을 포함시키실 수 있습니다. 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스가 설정되면 C를 클릭하여 Z 스택의 중심으로 이동하고 레이저 전원을 조정하고 두 레이저 모두에 대한 게인을 조정합니다.레이저 전원과 게인이 설정된 경우 스캐닝을 중지하고 업데이트를 클릭하여 위치 정보를 업데이트합니다. 다음 위치로 이동하려면 두 위치를 클릭합니다. 첫 번째 및 마지막 Z 슬라이스가 모두 설명된 대로 정의되면 타임 시리즈 제목을 열고 사이클 수를 300으로 설정하고 시간 간격을 2.5분으로 설정합니다.모든 것이 완료되었는지 확인하기 위해 설정을 검토한 후 시작하여 시간 경과를 시작하고 첫 번째 이미징 라운드가 올바르게 캡처되었는지 확인한 후 시간 경과가 하룻밤 사이에 실행되도록 합니다. 단일 셀내 직접 주입은 균일한 라벨링과 견고한 형광에 필요합니다. 아가로즈에 침지되면 배아는 접시 전체에 고르게 간격을 두어야 합니다.배아가 올바르게 준비되고, 충분히 형광되고 적절하게 장착되면, 그들은 시간 경과 중에 이미징 프레임에 남아 전체 장기를 이미지화 할 수 있게합니다. 수평 또는 대각선과 같은 등쪽 축을 따라 지향되지 않는 샘플은 시간 경과가 진행됨에 따라 이미징 프레임에서 자라며 추가 분석에 사용할 수 없습니다. 과도하게 회전하는 배아는 더 후방 시간 경과를 초래할 것입니다.회전이 저조한 배아는 대부분의 전방 조직만 관찰할 수 있습니다. 또한 프레임 의 방향에 대해 장착된 샘플은 성공적인 시간 경과를 얻을 가능성이 높습니다. 복부 측을 향한 이러한 편견은 복부 방향의 조직 성장을 위한 여분의 공간을 제공하여 최적의 시간 경과를 초래합니다.이러한 기준이 충족되지 않을 때, 시간 경과는 더 이상 조직의 전체 3D 부피를 포착하지 않으며 추가 분석을 위해 사용될 수 없습니다. 이러한 정보 풍부 데이터 집합은 세포 속도 및 궤적 정량화, 세포 및 조직 부피 측정 및 3 및 4D 시각화를 통한 4D 세포 추적을 포함하여 여러 가지 방법으로 분석될 수 있다.

4-dimensional-imaging-of-zebrafish-optic-cup-morphogenesis

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

배우세요 제브라피쉬 눈 형성 과정의 실시간 4차원 이미징 방법을 Danio rerio 배아에서. 레이저 공초점 현미경을 활용한 이 기술은 세포 역학과 조직 발달을 정밀하게 분석할 수 있게 합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

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