Name: 체외 형광 현미경 검사법 기반 운동성 검사의 Myosin 특이적 적응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 학습하세요 체외 형광 현미경 검사법을 활용한 비근육성 myosin 운동성 분석 방법을. 이 기술은 단일 분자 및 앙상블 수준에서 질병 유발 돌연변이의 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 데이터 수집에 사용되는 시약의 준비와 함께 기술 지원을 준 Fang Zhang 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 NHLBI / NIH 교내 연구 프로그램 기금 HL001786J.R.S.에 의해 지원되었다.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 미오신 5a 및 비근육 미오신 2b의 정제 및 체외 특성화를 위한 워크플로우가 있습니다. 이 실험 세트는 정제된 myosin 구조의 메카노케미컬 특성을 빠르고 재현 가능한 방식으로 정량화하는 데 유용합니다. 여기에 표시된 두 개의 myosins는 많은 가능성에서 단지 두 가지 특정 예이지만, 조건과 기술은 대부분의 myosins및 다른 많은 모터 단백질에, 일부 재단과 함께 적용 될 수있다.
여기에서 설명하는 프로토콜은 실험실 및 실험의 개별 요구에 따라 변형될 수 있습니다. 예를 들어, 발현 및 분자 생물학 섹션에서 설명한 바와 같이, 이 논문에 사용된 단백질은 두 개 이상의 바이러스의 공동 감염으로부터 생성되었다; 그러나, 성공적인 단백질 발현은 p-FastBac 이중 발현 벡터 또는 BiGBac 발현시스템(53)과같은 다발성 벡터로달성될 수 있다.
몇몇 요인은 재조합 ...

묘신은 아데노신 삼위산염(ATP) 가수분해1에서유래한 에너지를 이용하여 액틴 필라멘트에 힘을 발휘하는 모터 단백질이다. 미신에는 머리, 목 및 꼬리 도메인이 포함되어 있습니다. 헤드 도메인에는 액틴 결합 영역뿐만 아니라 ATP 바인딩 및 가수 분해 사이트가 포함되어 있습니다. 목 도메인은 광 사슬, 칼모둘린 또는 칼모둘린과 같은 단백질2,3에결합하는 IQ 모티브로 구성됩니다. 상기 tail 영역은 두 개의 무거운 사슬의 이압, 화물 분자의 결합, 헤드 도메인과의 자동 억제 작용을 통한 미신의 조절을 포함하되 이에 국한되지 않는 미오신의 각 클래스에 특정한 여러 기능을갖는다.
미오신의 운동 특성은 클래스마다 크게 다릅니다. 이러한 특성 중 일부는 듀티 비율(myosin이 액틴에 바인딩되는 myosin의 기계적 사이클의 일부)과 처리성(분리 전에 트랙에서 여러 단계를 하는 모터의 능력)을 포함한다.4. 미신의 40개 이상의 클래스는 서열 분석5,6,7,8에기초하여 결정되었다. 2급 묘신은 가장 먼저 연구되었기 때문에 "종래"로 분류됩니다. 따라서 다른 모든 묘신 은 "틀에 얽매이지 않는" 것으로 분류됩니다.
미신 5a (M5a)는 클래스 5 묘신이며, 해리하기 전에 액틴을 따라 여러 단계를 취할 수 있음을 의미 가공 모터입니다. 그것은 높은 관세 비율을가지고, 그것은 액틴9,10,11,12,13,14에바인딩 되는 기계적 사이클의 큰 부분을 보낸다는 것을 나타내는. 다른 묘신과 공통적으로, 헤비 체인은 액틴 결합 및 ATP 가수분해 부위를 모두 포함하는 N 단말 모터 도메인을 포함하고 있으며, 레버 암 역할을 하는 넥 영역이 있으며, 에센셜 라이트 체인(ELC)과 칼모둘린(CaM)15에결합하는 6개의 IQ 모티브가 있습니다. 꼬리 영역에는 분자를 분화하는 α-헬리칼 코일, 결합화물을 위한 구형 꼬리 영역이 포함됩니다. 그것의 운동은 멜라노세포와 Purkinje뉴런16,17의폐래 망상에 있는 멜라노좀의 수송에 그것의 관여를 반영합니다. M5a는 프로토 타입화물 운송 모터(18)로간주됩니다.
클래스 2 묘신, 또는 종래의 묘신은, 비근육 myosin 2 (NM2) 등방형, NM2a, 2b 및 2c19이외에 골격, 심장 및 부드러운 근육의 수축을 전력하는 myosins를 포함한다. NM2 동위원소는 모든 세포의 세포질에서 발견되며 사이토카네시스, 접착, 조직 형태 발생 및 세포 이동19,20,21,22에서공유된 역할을 갖는다. 본 논문은 비근육 미오신 2b(NM2b)23의맥락에서 종래의 묘신 프로토콜에 대해 설명한다. NM2b는 M5a에 비해 낮은 관세율을 가지며 M5a의 V최대 치인 ≈18s-124에비해 V최대 0.2 s-1 -123으로 효소적으로 느립니다. 특히 두 개의 헤드가 있는 잘린 NM2b 구문은 actin에서 쉽게 처리하지 않습니다. 오히려, 액틴과의 각 만남은분자(25)의해리에 이어 파워 스트로크를 초래한다.
NM2b에는 두 개의 미신 중형 체인이 포함되어 있으며, 각 체인은 1개의 구형 헤드 도메인, 1개의 레버 암(1개의 ELC 및 하나의 규제 라이트 체인(RLC)을 포함하며, α 백리향 코일 로드/꼬리 도메인, 약 1,100개의 아미노산이 이 두 개의 무거운 사슬을 이산화합니다. NM2b의 효소 활성 및 구조 상태는 RLC23의인산화에 의해 조절된다. ATP 및 생리이온 강점(약 150mMM염)이 있는 NM2b는 두 머리가 비대칭 상호 작용에 참여하고 꼬리가23개소에서 머리 위로 다시 접는 컴팩트한 변형을 채택한다. 이 상태에서, 미신은 actin과 강하게 상호 작용하지 않으며 매우 낮은 효소 활동을 가지고 있습니다. 칼모둘린의존성 미오신 광사슬 키나아제(MLCK) 또는 로-관련 단백질 키나아제에 의한 RLC 인산화시, 분자는 꼬리 부위를 통해 다른 미오신과 연결하여 약 30개의 근신분자(23)의양극성 필라멘트를 형성한다. 앞서 언급한 RLC의 인산화는 또한 NM2b의 액틴 활성화 ATPase 활성을 약 4배26,27,28로증가시키는 것으로 이어진다. 양극성 필라멘트 배열은 양쪽 끝에 많은 미오신 모터를 특징으로하며, 수축 및 장력 유지 보수의 역할에 최적화되어 있으며, 반대극성을 가진 액틴 필라멘트는 서로 비교하여 움직일 수 있습니다23,29. 이에 따라 NM2b는 액틴과 상호작용할 때 모터의 앙상블 역할을 하는 것으로 나타났다. 이 필라멘트 내의 많은 수의 모터를 통해 NM2b 필라멘트가 액틴 필라멘트에서 공정하게 움직일 수 있으므로29개의특징을 나타내는 시험관 내 필라멘트 공정성을 가능하게 합니다.
세포에서 미신의 역할을 이해하는 과정에서 진전이 있었지만, 단백질 수준에서 그들의 개별적인 특성을 이해할 필요가 있다. 간단한 단백질 단백질 상호 작용 수준에서 actomyosin 상호 작용을 이해 하려면, 세포의 내부 보다는, 우리는 표현 하 고 체 외 연구에 사용 하기 위해 재조합 myosins를 정화할 수 있습니다. 그러한 연구의 결과는 궁극적으로 복잡한 세포 과정을 구동 특정 myosins의 생물학적 특성에 대해 mechano생물학자에게12,13,14,25,29를알려줍니다. 전형적으로, 이것은 전체 길이 또는 잘린 미오신 구조에 친화성 태그를 추가하고 친화성 크로마토그래피(29,30,31)를통해 정화함으로써 달성된다. 추가적으로, 생성은 합성 불소호로 단백질 라벨링을 위한 유전으로 응응가능한 형광또는 태그를 포함하도록 설계될 수 있다. 이러한 형광 라벨을 추가함으로써, 단일 분자 이미징 연구는 myosin 역학 및 운동학을 관찰하기 위하여 수행될 수 있습니다.
정제 후, 미신은 여러 가지 방법으로 특징지어질 수 있다. ATPase 활동은 색법 방법으로 측정할 수 있으며, 상이한 조건 하에서 모터의 전반적인 에너지 소비 및 액틴 친화성에 대한 통찰력을제공한다(32). 그것의 운동성의 mechanochemistry에 관하여 배우기 위하여는, 추가 실험이 필요합니다. 이 논문은 정제된 myosin 단백질의 운동특성을 특성화하는 데 사용할 수 있는 두 가지 체외 형광 현미경-현미경 기반 방법을 자세히 설명합니다.
이러한 방법의 첫 번째는 미오신 모터의 앙상블 특성을 정량적으로 연구하고 정제 된 단백질(33)의배치의 품질을 질적으로 연구하는 데 사용할 수있는 글라이딩 액틴 필라멘트 분석입니다. 이 논문은 이 분석법에 대한 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경의 사용에 대해 논의하지만, 이러한 실험은 많은 실험실34에서흔하게 발견되는 디지털 카메라를 탑재한 광야 형광 현미경을 사용하여 효과적으로 수행될 수 있다. 이 분석에서, 미오신 모터의 포화 층은 커버 슬립에 부착된다. 이는 니트로셀룰로오스, 항체, 막, SiO 2-유도표면(예: 트리메틸클로로실레인)을 이용하여 달성될 수있으며,그 중 에서도29,33,35,36,37, 38을이용하여 달성할 수 있다. 형광으로 표지된 액틴 필라멘트는 커버슬립 챔버를 통과하며, 이 챔버는 표면에 부착된 미오신에 결합한다. ATP (및 NM2 의 연구에서 키나아제)를 추가하면 챔버는 표면에 묶인 myosins에 의한 액틴 필라멘트의 전좌를 관찰하도록 이미지화됩니다. 추적 소프트웨어를 사용하여 각 글라이딩 액틴 필라멘트의 속도와 길이를 상호 연관시킬 수 있습니다. 분석 소프트웨어는 또한 주어진 미오신 제제의 품질을 결정하는 데 유용 할 수있는 이동 및 고정 액틴 필라멘트의 수를 측정 할 수 있습니다. 정체된 필라멘트의 비율은 또한 의도적으로 다른 단백질에 actin의 표면 테더링에 의해 변조될 수 있고근신(39)의부하 의존성을 결정하기 위하여 측정될 수 있다. 각 액틴 필라멘트는 다수의 사용 가능한 모터에 의해 추진될 수 있기 때문에, 이 분석법은 매우 재현가능하며, 최종 측정 속도는 시작 묘신 농도의 변경 또는 솔루션에 추가 인자의 존재와 같은 변투로 견고하다. 이는 변성, 온도, 이온 강도, 용액 점도 및 표면 테더에 의해 유도되는 부하의 효과와 같은 상이한 조건하에서 근신 활성을 연구하기 위해 쉽게 수정될 수 있다는 것을 의미한다. ATP 가수분해가 불가능한 강한 결합미오신 "죽은 머리"와 같은 요인이 지연된 액틴 필라멘트를 유발할 수 있지만, 이러한 문제를 완화하고 정확한 측정을 허용하는 여러 가지 방법이 존재합니다. 미신의 운동 특성은 클래스마다 크게 다르며, 사용되는 특정 묘신에 따라 이 분석에서 액틴 필라멘트의 글라이딩 속도는 20nm/s(미신 9)40,41,최대 60,000nm/s(샤라산 미신 11)42미만에서 다를 수 있다.
두 번째 분석법은 글라이딩 액틴 필라멘트분석12의형상을 반전시다. 여기서, 액틴 필라멘트는 표지슬립 표면에 부착되어 M5a 또는 NM2b의 개별 양극성 필라멘트의 단일 분자의 움직임이 시각화된다. 이 분석법은 액틴에 대한 단일 미오신 분자 또는 필라멘트의 실행 길이 및 속도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 커버슬립은 비특이적 결합을 차단하고 비오틴 폴리에틸렌 글리콜(biotin-PEG)과 같은 표면을 동시에 기능화하는 화학 화합물로 코팅됩니다. 수정된 아비딘 유도체의 첨가는 표면을 프라이밍하고 생체개화 액틴이 챔버를 통과하여 챔버의 바닥에 안정적으로 결합된 F-actin층을 초래한다. 마지막으로, 활성 및 형광표 미오신(전형적으로 1-100 nM)은 챔버를 통해 흐르고, 그 후 고정액소필라멘트를 통해 미오신 움직임을 관찰하도록 이미지화된다.
이 양식은 비근육과 근육 myosins 둘 다의 역학을 검토하기 위하여 이용될 수 있는 빠르고 재현가능한 방법을 나타냅니다. 이 보고서는 M5a와 NM2b를 각각 정화하고 특성화하는 절차를 각각 설명합니다. 다음은 두 가지 유형의 분석에서 모션을 성공적으로 캡처하기 위해 수행 될 수있는 일부 myosin 특정 적응에 대한 논의에 선행됩니다.
발현 및 분자 생물학 관심있는 myosin에 대한 cDNA는 M5a-HMM을 표현하는 경우 C 단말플래그 태그 (DYKDDDDK) 또는 N-단말 플래그 태그NM23,43,44, 44,45, 46, 46의전체 길이 분자를 표현하는 경우 인코딩 수정 된 pFastBac1 벡터에 복제되어야합니다. NM2b의 C-단말 플래그 태그는 플래그 친화성 컬럼에 대한 단백질의 선호도가 약화됩니다. 대조적으로, N 단자 플래그 태그 단백질은 일반적으로 FLAG 선호도열(23)에잘 결합한다. N-말단 태그 단백질은 효소 활성, 기계적 활성 및 인산화 의존성조절(23)을유지한다.
이 논문에서는, 마우스 M5a 무거운 메로미신 (HMM)와 같은 구조가 플래그 태그와 myosin 무거운 사슬의 C-종점 사이에 GFP와 같은 구조를 사용하였다. NM2b와 달리 M5a-HMM은 N 또는 C 단말 FLAG 태그로 태그를 성공적으로 지정하고 정제할 수 있으며 두 경우 모두 결과 구성이 활성화됩니다. M5a 헤비 체인은 아미노산 1090에서 잘렸으며 GFP와 M5a47의코일 코일 영역 사이의 3개의 아미노산 링커(GCG)를 함유하고 있다. GFP와 플래그 태그 사이에 추가 링커가 추가되지 않았습니다. M5a-HMM은 칼모둘린과 공동 표현되었다. 전신 인간 NM2b 구조는 ELC 및 RLC와 공동 표현되었다. RLC의 N-termini는 5개의 아미노산 (SGLRS)의 링커를 통해 GFP와 융합되었다. 플래그 태그에 직접 부착된 것은 할로태그였습니다. HaloTag와 미신 헤비 체인의 N-종자 사이에는 두 개의 아미노산 (AS)으로 만든 링커가 있었습니다.
두 myosin 제제는 약 2 x 106 세포/mL의 밀도로 바쿨로바이러스에 감염된 Sf9 세포 배양의 1리터로부터 정제되었다. 각 하위 단위에 대한 baculovirus의 볼륨은 제조업체의 지침에 의해 결정된 바이러스의 감염의 복합성에 의존합니다. M5a의 경우, 세포는 칼모둘린을 위한 2개의 다른 바쿨로바이러스-1, M5a 무거운 사슬을 위해 1개로 공동 감염되었다. NM2b의 경우, 세포는 ELC에 대한 3개의 다른 바이러스-1, RLC용, NM2b 중형 체인에 대해 하나씩 공동 감염되었다. myosins의 다양성으로 작업 하는 실험실에 대 한 (또는 다른 다 복합 단백질), 이 방법은 무거운 빛 사슬의 많은 조합을 허용 하 고 칼모둘린 등 일반적으로 사용 되는 라이트 체인 많은 다른 myosin 무거운 사슬과 공동 변환될 수 있기 때문에 이 접근 은 효율적입니다. 모든 세포 작업은 오염을 피하기 위해 적절한 멸균 기술을 가진 생물 안전 캐비닛에서 완료되었습니다.
M5a와 NM2b의 발현을 위해, 재조합 묘신을 생산하는 Sf9 세포는 원심분리를 통해 2-3일 후 감염 후, 원심분리를 통해 수집하고-80°C에 저장하였다. 세포 펠릿은 2,800 x g에서 30 분 동안 4 °C에서 공동 감염된 Sf9 세포를 원심분리하여 수득하였다. 단백질 정제 과정은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>2 M CaCl2 Solution</td><td>VWR</td><td>10128-558</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2 Solution</td><td>VWR</td><td>10128-298</td><td></td></tr><tr><td>27 게이지 니들</td><td>Becton Dickinson</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl 용액</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3270</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>984303</td><td></td></tr><tr><td>Amyl Acetate</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdfATP</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated G-Actin</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Millipore 시그마</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>bPEG-실란</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>비오틴-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 시약 농축액</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulin</td><td></td><td>PMID: 2985564</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Millipore Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf</td></tr><tr><td>원형 여과지 - 글라이딩 분석</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001125</td><td></td></tr><tr><td>원형 여과지 - Inverted Assay</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001090</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets</td><td>Millipore Sigma</td><td>5056489001</td><td>이것은 4°C에서 보관해야 합니다. 정제는 직접 사용하거나 1 정제를 2mL의 증류수에 용해시켜 25x 스톡 용액으로 재구성할 수 있습니다. 결과 용액은 4°C에 저장할 수 있습니다. C 1-2주 동안 또는 최소 12주 동안 -20 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Concentrating Tubes (100,000 MWCO)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>UFC910024</td><td>MWCO가 정제되는 단백질의 총 분자량보다 작은 한, 튜브의 MWCO가 반드시 "모든 사람에게 적합한" 것은 아닙니다. 본원의 NM2b는 100,000 MWCO 튜브로 농축되었고, M5a는 30,000 MWCO 튜브로 농축되었다.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip Rack</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z688568-1EA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Coverslips: Gliding Acting Filament Assay</td><td>VWR International</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips: Inverted Motility Assay </td><td>Azer Scientific</td><td>ES0107052</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜브(3500 Dalton MCWO)</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-670-5A</td><td>투석 튜브의 직경은 다를 수 있지만 MWCO는 동일해야 합니다. 본원에 사용된 NM2b는 18mm 투석관에서 투석되었습니다. 튜브는 4°C에서 20% 알코올 용액에 보관할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>Office Depot</td><td>909955</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK 펩타이드</td><td>GenScript</td><td>RP10586</td><td>이는 0.1M NaCl, 0.1mM EGTA, 3mM NaN3 및 10mM MOPS(pH 7.2)를 포함하는 완충액에 용해되어 최종 농도 50mg/mL까지 용해될 수 있습니다. 이것은 -20 &deg에 저장할 수 있습니다. C as 300 &마이크로; L 분취량.&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Elution Column</td><td>Bio-Rad</td><td>761-1550</td><td>재사용이 가능합니다. 청소하려면 2-3 컬럼 부피의 PBS와 증류수로 컬럼을 헹굽니다. 열을 4&deg에서 식히십시오. C 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>G-actin</td><td></td><td>PMID:</td><td>4254541 G-actin 재고는 200 &mu; 액체 N2의 M.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Oxidase</td><td>Millipore Sigma</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-295018</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag</td><td>Promega</td><td>G100A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fischer Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Large-Orifice Pipet Tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin 프로테아제 억제제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78435</td><td></td></tr><tr><td>Mark12 염색되지 않은 표준 사다리</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC5677</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Millipore Sigma</td><td>MX0482</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-553-10</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>PEG-silane</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Myosin Light Chain Kinase</td><td></td><td>PMID: 23148220</td><td>FLAG-tagged MLCK는 본 명세서에서 FLAG-tagged myosin이 정제된 것과 동일한 방식으로 정제될 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Millipore Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31050</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10800</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323PK2</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 시료 완충액(4X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>78830</td><td>PMSF는 이소프로판올에서 0.1M 원액으로 만들 수 있으며 4°C에 저장할 수 있습니다. 이소프로판올을 첨가하면 결정 침전이 발생하며, 이는 실온에서 교반하여 용해될 수 있습니다. 사용 직전에 PMSF를 빠르게 교반하는 용액에 최종 농도 0.1mM까지 적가할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Office Depot</td><td>397492</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R415</td><td>스톡은 100% 메탄올에 최종 농도 200μm까지 희석할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Sf9 Media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12658-027</td><td>이것은 4°C에서 보관해야 합니다. 유통 기한은 제조일로부터 18개월입니다.</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish - Gliding Assay</td><td>Corning</td><td>353025</td><td>각 조직 배양 접시는 약 9개의 커버슬립을 담을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish - Inverted Assay</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>각 조직 배양 접시는 약 4개의 커버슬립을 담을 수 있습니다.</td></tr><tr><td><강한>부드러운 양면 200 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158U38</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75006590</td><td></td></tr><tr><td>T현미경</td><td>Nikon</td><td>모델: 100x TIRF 대물렌즈가 있는 H-TIRF 시스템을 사용한 Eclipse Ti(N.A. 1.49)</td><td></td></tr><tr><td>Microscope 카메라</td><td>Andor</td><td>모델: iXon DU888 EMCCD 카메라 (1024 x 1024 센서 형식)</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Environmental Control Box</td><td>Tokai HIT</td><td>Custom Thermobox</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Laser Unit</td><td>Nikon</td><td>LU-n4 4 레이저 유닛 405nm, 488nm, 561nm, 640nm</td><td></td></tr><tr><td>용 고체 레이저가 있는Mid Bench Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>모델: CR3i</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP 탁상용 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Cleaner</td><td>Diener electronic GmbH + Co. KG</td><td>시스템 유형 : Zepto</td><td></td></tr> <tr><td>Sonicator 프로브 (3.2mm) </td> <td>Qsonica</td><td>4418</td><td></td></tr> <tr><td> 표준 인큐베이터 </td> <td>바인더</td><td>모델 : 56</td><td></td></tr> <tr><td> Waverly 튜브 믹서 </td> <td>Waverly</td><td>TR6E</td><td></td></tr> <tr><td>< > SOFTWARE </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ FIJI</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FAST(버전 1.01)</td><td>http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements</td><td>FAST는 Mac OSX 및 Linux 기반 시스템에서 사용할 수 있습니다.</td><td></td></tr><tr><td>이미지 스태빌라이저 플러그인</td><td>https://imagej.net/Image_Stabilizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ TrackMate</td><td>https://imagej.net/TrackMate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>NIS 요소(AR 패키지)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> File:TrackMate-manual.pdf <td>https://github.com/turalaksel/FASTrack</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

체외 형광 현미경 검사법 기반 운동성 검사의 myosin 특이적 적응

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin 단백질 결합 하 고 필라멘트 액 틴 (F-actin)와 상호 작용 하 고 phylogenetic 나무를 통해 유기 체에서 발견 된다. 그들의 구조와 효소 특성은 셀에서 실행하는 특정 기능에 맞게 조정됩니다. Myosin 5a 는 세포에서 멜라노솜과 소포를 수송하기 위해 F-actin을 가공적으로 걷습니다. 반대로, 비근육 미오신 2b는 약 30개의 분자를 포함하는 양극성 필라멘트로 작동합니다. 그것은 근신 분자가 액틴을 결합하고, 파워 스트로크를 부여하고, 주기를 반복하기 전에 해리하기 위해 비동기적으로 작동하는 필라멘트의 중심으로 반대 극성의 F-actin을 이동합니다. 비근육 근신 2b는 다른 비근육 근신 2 동종포형태와 함께 세포 접착, 세포키네시스 및 장력 유지를 포함하는 역할을 합니다. 미신의 메카노케미케는 정제된 단백질을 사용하여 체외 운동성 작용을 수행하여 연구할 수 있습니다. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석에서, myosins는 현미경 커버슬립 표면에 묶여 있고 형광으로 표지된 F-actin을 변환합니다, 이는 추적될 수 있습니다. 단일 분자/앙상블 운동성 분석에서, 그러나, F-actin은 F-actin에 형광표지 된 미신 분자의 커버슬립 및 운동에 결합된다. 본 보고서에서, 친화성 크로마토그래피를 이용한 Sf9 세포로부터의 재조합 묘신 5a의 정제가 설명되어 있다. 이 다음, 우리는 두 형광 현미경 기반 분석법을 설명합니다: 글라이딩 액틴 필라멘트 분석및 반전된 운동성 분석. 이러한 분석에서 액틴 전좌 속도 및 단일 분자 실행 길이 및 속도와 같은 매개 변수는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 추출될 수 있다. 이러한 기술은 또한 비근육 근신 2 동종의 단일 필라멘트의 움직임을 연구하기 위해 적용될 수 있으며, 비근육 근신 2b의 맥락에서 본원에 논의된다. 이 워크플로우는 비근육 myosins의 단일 분자 및 앙상블 역학을 연구하는 데 사용할 수 있는 프로토콜 및 정량적 도구 집합을 나타냅니다.

미오신의 정제는 도2에 도시된 바와 같이 나트륨 도데딜 황산염-폴리아크라이글라미드(SDS-PAGE) 겔-전기포아를 감소시킴으로써 평가될 수 있다. 이 수치는 최종, 투석 후 myosin을 나타내지만, SDS-PAGE는 상체에 손실된 모든 제품을 식별하기 위해 정화 절차의 다양한 단계에서 알리쿼트에서 수행될 수 있다. 묘신 5a HMM은 120-130 kDa 범위에서 밴드를 가지고 있으며, 전체 길이 무근육 미오신 2b는 200-230 kDa 범위에서 밴드가 있으며, 중형 체인29,44에해당한다. 미신 5a는 또한 칼모둘린을 표시하는 17 kDa 마크 근처에 밴드가 있습니다. 비근육 미오신 2b는 ELC를 나타내는 약 17 kDa의 밴드가 있습니다. GFP 태그RLC는 이 NM2b 준비에 존재하기 때문에 RLC는 약 47 kDa에 나타납니다. 그러나, 표호되지 않은 RLC는...

여기에 제시된 미오신 5a를 발현하고 정화하는 절차이며, 체외 형광 현미경 기반 의 앙상블 과 단일 분자를 모두 사용하여 이러한 방법이 비근육 근신 2b의 특성화를 위해 어떻게 수정될 수 있는지에 대한 논의가 뒤따릅니다.

체외 형광 현미경 검사법 기반 운동성 검사의 Myosin 특이적 적응

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

이 프로토콜은 단백질 수준에서 비 근육 myosin 역학을 특성화하는 데 사용할 수 있으며, 이는 세포에서자신의 역할에 기여하는 motile 특성을 알릴 수 있습니다. 이것은 그들의 세포 행동을 알리는 myosin 운동성에 각종 규제 조건의 효력을 연구하기 위하여 이용될 수 있는 빠르고 재현가능하고, 높게 통제된 방법입니다. 이 기술은 비 근육 myosins에 있는 질병을 일으키는 돌연변이가 단 하나 분자 및 앙상블 수준에 그들의 행동에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.그 방법론의 일반적인 접근은 마이크로 투부로 정제 된 키네신과 다인의 특성화와 같은 다양한 다른 사이토스켈레탈 시스템에 적용 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 다재다능함은 어떤 형광과 화학 조건이 가장 적합한지에 대한 의문을 제기할 수 있지만 이 방법은 비교적 빠르게 최적화될 수 있습니다. 유동 챔버를 설정하고 코팅하는 방법을 이해하면 이러한 실험에 대한 다양한 조건에 적응할 수 있는 강력한 토대가 됩니다.시작하려면 아밀 아세테이트에 1% 니트로셀룰로오스 용액을 준비하고 조직 배양 판 바닥에 125밀리미터 직경의 원형 필터 용지를 놓습니다. 8 평방 커버를 랙에 적재하고 200개의 에탄올을 약 2~5밀리리터로 철저히 세척한 다음 증류수 2~5밀리리터를 세척합니다. 그런 다음 여과 된 공기 라인이나 질소 라인을 사용하여 덮개 전표를 완전히 운전하십시오.1% 니트로셀룰로오스 용액의 10 마이크로리터가 하나의 커버 슬립의 가장자리를 따라 천천히 파이펫 10 마이크로리터. 200 마이크로리터 파이펫 팁의 측면을 사용하여 커버 슬립의 나머지 부분을 한 번의 부드러운 동작으로 얼룩지게 합니다. 그런 다음 니트로 셀룰로오스 측으로 조직 문화 접시에이 커버 슬립을 놓습니다.나머지 덮개 전표에 대해 이 것을 반복하고 건조시키십시오. 광학 렌즈 용지로 현미경 슬라이드를 닦아 큰 이물질을 청소합니다. 양면 테이프 2장, 길이 약 2cm를 자르고 현미경 슬라이드의 긴 가장자리를 따라 한 조각을 놓습니다.두 번째 테이프를 테이프의 첫 번째 조각 아래에 약 2밀리미터 아래에 두 어두워서 두 개가 평행하게 하여 약 10 마이크로리터의 용액을 보유할 수 있는 유량 챔버를 생성합니다. 니트로셀룰로오스로 코팅된 측면이 테이프와 직접 접촉하도록 테이프에 니트로셀룰로오스 커버 슬립 중 하나를 조심스럽게 붙입니다. 파이펫 팁을 사용하여 슬라이드 테이프 인터페이스를 부드럽게 눌러 커버 슬립이 슬라이드에 적절하게 부착되도록 합니다.그런 다음 면도날로 슬라이드 가장자리에 걸려있는 여분의 테이프를 잘라냅니다. 묘신 5a용 솔루션을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 미오신 5a의 마이크로리터 10개에서 슬라이드 플로우 챔버를 통과하여 1분간 기다립니다.그런 다음 DTT를 사용하면 운동성 버퍼에서 밀리리터 BSA당 1밀리그램의 10 마이크로리터로 흐르고 있습니다. 이 두 번 반복하고 세 번째 세척 후 1 분 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 필터 용지의 모서리를 사용하여 용지 모서리를 유동 챔버 출구에 부드럽게 배치하여 채널을 통해 용액을 심지합니다.그런 다음 DTT로 10 마이크로리터의 운동성 버퍼로 세척하십시오. 1 밀리리터 주사기와 27 게이지 바늘로 블랙 액틴 용액을 피펫하여 챔버에 해당 솔루션을 도입하기 전에 액틴 필라멘트를 전단합니다. 1 밀리머 DTT와 50 밀리머 MB에 하나의 밀리머 ATP의 존재챔버에 검은 액틴을 추가합니다.다음으로, DTT와 1 밀리머 ATP를 사용하여 50 마이크로리터의 운동성 버퍼로 흘러 들어와 무료 액틴 필라멘트의 챔버를 고갈시다. DTT로 10 마이크로리터의 운동성 버퍼로 세척하여 ATP의 챔버를 고갈시다. DTT와 운동성 버퍼를 포함하는 20 나노 몰라 RH 액틴 용액의 10 마이크로 리터로 플로우하고 커버 슬립의 표면에 부착 된 Myosin 5a에 actin 필라멘트의 엄격한 결합을 허용하기 위해 1 분 동안 기다립니다.DTT로 50 밀리머 운동 완충제 10마이크로리터로 세척하여 언바운드 RH 액틴 필라멘트를 제거합니다. 최종 버퍼의 30 마이크로리터로 플로우합니다. 561 나노미터의 난초 파장을 사용하여 형광 현미경에 이미지를 기록하여 RH 액틴을 시각화합니다.Myosin 5a 반전 운동성 분석에 대한 솔루션을 준비하고 얼음에 보관하십시오. DTT로 10 마이크로리터의 운동성 완충제로 챔버를 세척합니다. DTT를 사용하는 운동성 버퍼에서 밀리리터 BSA당 1밀리그램의 10마이크로리터로 플로우합니다.세 번째 세척 후 1분 동안 기다리며 두 번 반복하십시오. 조직 또는 필터 용지를 사용하여 용지 모서리를 유동 챔버 출구에 부드럽게 배치하여 채널을 통해 용액을 심지합니다. 그런 다음, DTT로 운동완충제 10마이크로리터로 챔버를 세 번 세척한다.DTT를 사용하는 운동성 버퍼에서 NeutrAvidin 용액의 10 마이크로리터를 플로우하고 1분 동안 기다립니다. 그런 다음 10 마이크로리터의 용액을 세 번 으로 씻으시면 됩니다. 큰 지루한 파이펫 팁을 사용하여 DTT와 운동성 버퍼를 포함하는 BRH 액틴의 10 마이크로 리터에 흐름.그리고 1 분 동안 기다립니다. 그런 다음 DTT로 10 마이크로리터의 운동성 버퍼로 세워주세요. 10 나노 몰러 Myosin 5a와 최종 버퍼의 30 마이크로 리터에 흐름.그리고 즉시 총 내부 반사 형광 현미경에 로드합니다. TIRF 이미징에 대한 최적의 초점이 발견되면 녹화를 시작합니다. 비근육 묘신 2b, 필수 광체인, 규제 광사슬, 묘신 5a 및 칼모둘린의 정제는 SDS-PAGE를 수행하여 평가하였다.글라이딩 액틴 필라멘트 분석법은 라벨이 붙은 액틴 필라멘트의 매끄러운 움직임을 특징으로 하는 이상적이고 추적 가능한 영화의 특징을 보여줍니다. 블랙 액틴 워시는 죽은 미오신 헤드가 측정 분야에서 제거되어 액틴 필라멘트의 전반적인 매끄러운 움직임에 더욱 기여했습니다. 빠른 트랙 프로그램에서 필라멘트 추적 출력 이미지는 비 근육 Myosin 2b와 Myosin 5a에 대한 얻어졌다.대표적인 히스토그램은 Actomyosin 2b 글라이딩 속도가 초당 77 나노미터임을 보여줍니다. 그리고 Actomyosin 5a의 것은 초당 515 나노미터입니다. 메틸셀룰로오스가 없는 경우, 액틴 필라멘트는 미오신 코팅 된 표면에 의해 밀접하게 연관되어 있지 않아 근육이 아닌 Myosin 2b 코팅 커버 슬립의 표면에 가깝게 펄럭입니다.미신 운동은 반전된 운동성 분석법을 사용하여 표면에 테더링된 형광액트인 필라멘트에서 관찰되었다. 라벨이 부착되지 않은 액틴을 전단하는 것이 중요하며, 이를 블랙 액틴 세척용 유동 셀에 도입하여 액틴의 원활한 전좌를 허용하는 것이 중요합니다. 추가 실험은 myosin 운동성 근신 돌연변이, 하중 유도 단백질, 이온 강도 및 규제 단백질에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사할 수 있습니다.다양 한 세포 조건 미래 연구에 대 한 재구성 될 수 있습니다. 이러한 방법은 단일 분자 및 앙상블 수준에서 다양한 myosin 등류가 어떻게 변하는지에 대한 생화학적 및 생물리학적 조사를 허용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 액틴-미오신 상호작용을 분석하기 위해 체외 운동성 분석을 수행합니다. 고정된 미오신 분자에 대한 액틴 필라멘트의 활공 운동은 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

Gliding Actin Filament Assay: 고정된 Myosins에 대한 Actin 필라멘트의 전좌를 연구하기 위한 In Vitro Motility Assay

Inverted Motility Assay: An In Vitro technique to visualize myosin movement on immobilized actin filaments(반전 운동성 분석: 고정된 액틴 필라멘트에서 미오신 이동을 시각화하는 In vitro 기술)

여기에서, 프로토콜은 키네신 -1-화물을 식별하기 위해 제시된다. 키네신-1 중쇄 (KIF5B)의 모터리스 돌연변이는 세포질에 집계 및화물의 응집을 유도한다. 모두 집계는 형광 현미경에서 검출된다. 유사한 전략이 다른 모터 단백질화물을 식별하기 위해 사용될 수있다.

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

최근의 연구 결과에 따르면 박테리아 편모 모터는 다양한 환경 신호를 감지하고 이에 반응하여 리모델링을 합니다. 여기에서 논의된 비드 분석은 환경 스트레스 요인에 대한 세포 적응에서 리모델링의 역할을 설명하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

이 프로토콜은 MultiBac Baculovirus 시스템을 사용하여 인간 myosin-7a holoenzyme을 재조합 생산하고 맞춤형 in vitro 필라멘트 글라이딩 분석을 사용하여 운동성을 연구하는 절차를 자세히 설명합니다.

인간 Myosin-7a의 MultiBac 시스템 기반 정제 및 생물물리학적 특성 분석

여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

학습하세요 체외 형광 현미경 검사법을 활용한 비근육성 myosin 운동성 분석 방법을. 이 기술은 단일 분자 및 앙상블 수준에서 질병 유발 돌연변이의 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

체외 형광 현미경 검사법 기반 운동성 검사의 Myosin 특이적 적응

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