Name: 호스트-병원균 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 항체를 사용하여 면역 형광을 이중 표지합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 학습하세요 동일 종에서 제조된 다클론성 및 모노클론성 항체를 사용하여 이중 및 삼중 면역 형광을 수행하는 방법을. Trypanosoma cruzi에 감염된 LLC-MK2 세포에서 교차 반응을 방지하면서 숙주-병원균 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 Fundação 드 Amparo à Pesquisa do Estado de 상파울루 (FAPESP 2010/19547-1)에 의해 지원되었다; 2018/03677-5) MMAB, Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência-FAEPA에서 MMAB및 Coordenaçãamento de Aperfeiçoamento 데 페소알 드 니벨 슈페리어- 브라질 (CAPES) - 금융 코드 001. CG-C는 CAPES로부터 석사 및 박사 펠로우십을 받았고, LAMT-S는 CNPq로부터 박사 학위를 받았습니다. 우리는 공초점 현미경 검사법을 위한 엘리자베트 R. 밀라노와 LLC-MK2 세포를 제공한 다리오 잠보니 박사(리베이라오 프레토 의과 대학, USP)에 감사드립니다.

1. 세포 및 기생충 배양
<ol><li>10% 열 불활성으로 보충된 RPMI 배지에 함유된 25cm2 세포 배양 플라스크에서 미국형 배양 컬렉션(CCL-7)에서 LLC-MK2(Rhesus 원숭이 신장 상피) 세포를 성장 FBS(태아 소 혈청) 및 항생제(U/mL 페니실린 100개 및 100μg/mL 연쇄절제술)에서 37°C에서 5% CO2 17.</li>
	<li>이전 프로토콜(18)에 따라 트리파노종 크루지(Y 균주)로 LLC-MK2 세포를 감염시다.</li>
	<li>15mL 세포 배양 원심분리기 튜브 및 원심분리기에서 10분 및 22°C에서 LLC-MK2 감염된 세포(5mL)의 상체를 수집하여 세포 이물질을 낮춥니다. 37°C에서 10분간 튜브를 유지하여 시험대고가 상체로 수영할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>22°C에서 15분 동안 2500 x g에서 새로운 원심분리기및 원심분리기에서 상퍼를 수집합니다. 초신자를 버리고 완전한 RPMI 배지에서 기생충을 함유한 펠릿을 회수하여 노이바우어 챔버에서 세포를 계수하여 세포 밀도를 결정한다.</li>
</ol>2. 면역 형광 프로토콜 제어
참고: 일단 고정되면, 1주일 동안 1x PBS(pH 7.2)에 4°C의 커버립이 들어 있는 플레이트를 보관할 수 있다. 저장하려면 세포가 투과성 화 단계를 거치지 않는 것이 중요합니다.
<ol><li>16시간 동안 RPMI 매체에 UV 살균 둥근 커버립을 함유한 24개의 웰 플레이트에 LLC-MK2 셀(2 x 104)을 세정한다.</li>
	<li>감염된 세포의 경우, T. cruzi (항목 1.4)를 포함하는 상체를 각 우물에 비례 (MOI 10:1)를 추가하고 감염의 6 h를 둡니다. 워시 커버립은 PBS 용액으로 감염 및 비감염 세포를 5회 포함하고 실온(RT)에서 10분 동안 1x PBS(pH 7.2)로 파라포름알데히드2%로 고정한다.</li>
	<li>커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS(pH 7.2)로 세척합니다.</li>
	<li>1x PBS(PH 7.2)에서 0.2%의 IGEPAL CA-630으로 커버립을 10분 동안 페메아빌라이징합니다.</li>
	<li>커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.</li>
	<li>차단 용액으로 RT에서 30 분 동안 커버립을 큐베이션합니다 (1 x PBS에서 2 % BSA, pH 7.2).</li>
	<li>인큐베이션 커버립은 마우스 모노클론 항hnRNPA1(희석 1:200) 또는 차단 용액에서 희석된 마우스 폴리클론 안티-TcFAZ(희석 1:100) 항체로 RT에서 30분 동안 커버립을 커버합니다.</li>
	<li>커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.</li>
	<li>염소 안티 마우스 IgG F (ab')2 (H +L)와 RT에서 30 분 동안 커버립을 배양 알렉사 플루어 488 (1:600)에 접목 한 Phalloidin과 함께 알렉사 594 (1:300)를 펜주하여 주조 용액의 소염 필라멘트 (F act-in)를 사용하여 주용 세포 차단에 있습니다.</li>
	<li>1x PBS(pH 7.2)로 3회 세척하여 각각 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>DAPI 배지를 사용하여 소량의 ProLong Gold 안티페이드 장착 시약을 슬라이드 표면에 적용합니다.</li>
	<li>집게를 사용하여, 부드럽게 거품이 형성되지 않도록 장착 매체에 커버 슬립을 기울. 일단 건조하면, 원하는 경우 커버 슬립을 밀봉.</li>
</ol>3. 동일한 호스트에서 자란 단일 클론 및 다각성 항체를 사용하여 면역 형광 프로토콜을 이중 라벨링
<ol><li>위에서 설명한 2.1 ~ 2.6 단계를 반복합니다.</li>
	<li>인큐베이트는 RT에서 30분 동안 차단용액에서 희석된 사내 마우스 폴리클론 항TcFAZ 항체(1:100)를 함유한 감염 및 비감염 세포를 함유하고 있다.</li>
	<li>커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.</li>
	<li>인큐베이트는 RT에서 30분 동안 염소 안티마우스 IgG F(ab')2(H+L)를 블로킹 용액에서 희석한 알렉사 플루어 647(1:600)으로 접합한다.</li>
	<li>커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.</li>
	<li>RT에서 30분 동안 차단 용액에서 아피니퓨어 토끼 안티마우스 IgG(H+L) 희석(0.12 mg/mL)으로 두 번째 차단 단계를 수행한다.</li>
	<li>커버립을 1x PBS(pH 7.2)로 각각 5분 동안 세 번 씻습니다. 그런 다음 마우스 모노클론 항hnRNP A1 IgG2b 항체(1:200)로 RT에서 30분 동안 배양한다.</li>
	<li>커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.</li>
	<li>알렉사 플루어 488 (1:600)에 컨쥬게이드 염소 안티 마우스 IgG2b 항체와 블로킹 용액에서 희석 된 알렉사 594 (1:300)로 접합 된 플라코로이드와 함께 30 분 동안 커버립을 배양합니다.</li>
	<li>커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.</li>
	<li>위에서 설명한 2.8 ~ 2.10 단계를 반복합니다.</li>
</ol>4. 다른 숙주 종으로부터 제3 폴리클론 항체를 첨가한 삼중 라벨링 면역 형광 프로토콜
참고: 추가 라벨링의 경우 IgG 하위 클래스, 항체 동소형을 기록하고 항체 순서를 따릅니다: 1. 마우스 폴리클로날, 2. 토끼 폴리클로날, 3. 두 번째 블록 및 4. 마우스 모노클로날. 올바른 불소 공조 -공수 이차 항체를 선택하기 위해 공초점 현미경에서 사용할 수있는 레이저의 유형을 고려하십시오.
<ol><li>위에서 설명한 2.1 ~ 2.6 단계를 반복합니다.</li>
	<li>3.2 ~ 3.5 단계 (세척 단계)를 마친 후 RT에서 30 분 동안 차단 용액에 토끼 폴리클론 항체로 새로운 인큐베이션을 시작합니다.</li>
	<li>커버립을 1x PBS(pH 7.2)로 각각 5분간 세 번 씻습니다.</li>
	<li>30분 동안 차단용액에서 알렉사 647(1:600)에 공주된 염소 안티래빗 항체 IgG로 커버립을 배양한다.</li>
	<li>커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.</li>
	<li>RT에서 30분 동안 차단용액에서 아피니퓨어 토끼 안티마우스 IgG(H+L)를 블로킹(0.12 mg/mL)으로 차단단계를 수행한다.</li>
	<li>커버립을 1x PBS(pH 7.2)로 각각 5분간 세 번 세척하고 차단 용액에서 희석된 마우스 단일 클론 IgG 서브클래스 항체로 30분 동안 배양한다.</li>
	<li>커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.</li>
	<li>30분 동안 차단용액에서 알렉사 594(1:600)에 공주된 특정 염소 안티마우스 IgG 서브클래스 항체로 30분 동안 커버립을 배양한다.</li>
	<li>커버립을 각각 5분간 3회 세척하여 PBS 1회를 조리합니다.</li>
</ol>5. 공초점 이미징 인수
<ol><li>공초점 현미경을 사용하여 면역 불피성 샘플을 분석하고 63X 오일 침지 목표를 달성하고 광증 관(PMT) 및 하이브리드 검출기(HyD)로 형광을 감지합니다. 참고 : 우리는 공초점 현미경 검사의 다중 사용자 실험실에서 설정을 사용 - LMMC, 리베이라오프 프레토 의과 대학, 상파울루 대학.</li>
	<li>분리된 채널로 모든 공초점 이미지를 획득합니다. Adobe 포토샵을 사용하여 이미지 처리를 수행합니다.</li>
</ol>

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<li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67(2004).</li>
<li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197(1999).</li>
<li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331(1996).</li>
<li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47(1985).</li>
<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li>
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<li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1%2C+LLC-MK2%2C+and+LLC-MK2+%28NCTC-3196%29+and+their+utility+in+virus+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li>
<li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li>
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<li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li>
<li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hnRNP+A1%3A+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li>
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</ol>

저자는 경쟁또는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

여기서, 우리는 동일한 숙주 종으로부터 2개의 상이한 항체를 사용하여 Trypanosoma cruzi 감염한 세포에 있는 이중 면역 라벨링을 능력을 발휘하는 프로토콜을 제시합니다. 연구하기 위하여는, 더 자세히, 감염의 연루, 핵 또는 세포소기관과 같은 호스트 세포에 있는 구조물이 프로토콜을 사용하여 표지될 수 있습니다. 또한, 배후 임베딩 씬 섹션 면역골드 라벨링 방법에 사용될 수 있다. 이 접근은 trypanosomatids 및 그밖 기생충을 공부하기 위하여 유효한 몇몇 항체가 있는 장애물을 극복하는 것을 돕습니다.
추가적으로, 우리의 프로토콜은 세포내 기생충이 호스트 세포와 함께 표지되는 것을 보여주었습니다, 동일한 면역 형광에 있는 2개의 진핵생물, 조직의 다른 종류에서 실현된 그 프로토콜과 다른 7,8,9,10,12,13,14 ...

세포 수준에서 숙주 세포와 병원체의 상호 작용을 연구하기 위해 바이러스, 박테리아 및 원생동물과 같은 다른 그룹이 대부분의 숙주 세포 유형을 감염시킬 수 있기 때문에 질병의 근본 원인에 대한 필수 정보를 제공한다1,2,3,4. 그것은 또한 개발 하 고 병원 체의 성장을 느리게 하거나 억제할 수 있는 잠재적인 치료 목표를 식별 하는 데 도움이 수 있습니다. 살아있는 조건에서, 생성된 항체는 자기 성분, 바이러스, 세균성 성분 또는 제품, 곰팡이, 기생충 및 그 외5에서 항원을 인식하는 책임이 있습니다5.
이러한 목적을 위해, 항체는 주로 세포 구조 및 단백질의 위치와 기능을 이해하기 위한 도구로 널리 사용된다. 다중 항체 라벨링을 이용한 여러 연구는 추가 차단 단계가 면역 지역화의 특이성에 기여한다는 것을 보여준다. 또한, 대부분의 기량 프로토콜은 동일한 숙주 종에서 항체를 포함하는 특정 상업적 단일 클론 항체를 사용하며 6,7,8,9,10,11,12,13,14를 사용한다.
일반적으로, 이중 표지 면역 형광은 관심의 세포 구조 또는 병원균 및 숙주 세포 사이의 상호 작용을 보기 위해 다른 종에서 제기 된 두 개의 항체를 사용합니다. 그러나, 이는 일부 병원체에 특이적인 상업적 단일클론 또는 폴리클론 항체가 이중 라벨링을 수행할 수 없을 때 문제가 될 수 있다. 또한, 시판되는 항체 컨쥬게이션 키트가 있으며, 1차 항체를 수치니미딜 에스테르 반응15에 의해 플루오로포레에 직접 접목할 수 있다. 문제는 이러한 키트는 종종 비싸며 라벨을 붙일 충분한 항체가 필요하다는 것입니다. 이를 알고, 우리는 성공적으로 Trypanosoma brucei16에서 단백질 국소화를 연구하기 위하여 동일 종에서 제기된 2개의 다른 항체를 사용하여 이중 면역 형광 방법을 개발했습니다. 그러나, 세포 내 기생충에 대 한, Trypanosoma cruzi를 포함 하 여, 이 접근 은 입증 되지 않았습니다. 여기서, 우리는 교차 반응 없이 동일한 종에서 제기된 1차 항체를 사용하여 세포내 T. cruzi 기생충 및 숙주 세포를 연구하기 위하여 이중 표지 면역 형광을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 방법 외에도, 다른 종으로부터 제3 항체를 첨가하여 삼중 면역 형광 라벨링이 확립되었다. 이러한 접근법은 항체의 근원이 제한되고 모든 세포 모형에서 사용될 수 있을 때 도움이 됩니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 - IgG2b 항체</td><td>Life technologies, USA</td><td>A21141</td><td>염소 안티 마우스</td></tr><tr><td>AffiniPure Rabbit 안티 마우스 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch, USA</td><td>315-005-003</td><td>안티 마우스 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) 항체</td><td>Life technologies, 미국</td><td>A11017</td><td>염소 안티 마우스</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 IgG1 항체</td><td>Life technologies, 미국</td><td>A21125</td><td>염소 안티 마우스</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) 항체</td><td>Life technologies, USA</td><td>A21237</td><td>염소 안티 마우스</td></tr><tr><td>Anti-hnRNPA1 항체 IgG2b</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>R4528</td><td>마우스 항체</td></tr><tr><td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) 항체</td><td>우리 연구실</td><td>사내</td><td>마우스 항체</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A2153-10G</td><td>알부민 단백질</td></tr><tr><td>세제 Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>I3021</td><td>비이온성 세제</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco, Thermo fisher scientific, 미국</td><td>12657-029</td><td>혈청</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibco, Thermo fisher scientific, 미국</td><td>15140-122</td><td>항생제</td></tr><tr><td>팔로이딘 Alexa Fluor 594</td><td>Life technologies, 미국</td><td>A12381</td><td>Actin marker</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade with DAPI</td><td>Life technologies, 미국</td><td>P36935</td><td>마운팅 배지 시약</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td><td>Corning, USA</td><td>10-040-CV</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>트립신-EDTA 용액</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T4049-100ML</td><td>바이오시약</td></tr></tbody></table>

호스트-병원균 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 항체를 사용하여 면역 형광을 이중 표지합니다

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

요즘, 기생충 호스트 세포 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수있는 분자 도구의 넓은 범위를 찾을 수 있습니다. 그러나, 기생충에 있는 특정 세포 구조 및 단백질을 인식하는 상업적인 단클론 또는 다각성 항체를 얻기 위하여 몇몇 한계가 존재합니다. 게다가, trypanosomatids를 표시하기 위하여 유효한 몇몇 상업적인 항체가 있습니다. 일반적으로 기생충에 대한 다발성 항체는 사내에서 제조되며 동일한 종에서 생산되는 다른 항체와 함께 사용하기가 더 어려울 수 있습니다. 여기서, 이 프로토콜은 숙주 세포 및 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 이중 표기 면역 형광을 수행하기 위해 동일한 종에서 자란 폴리클론 및 단일 클론 항체를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이중 라벨링 면역형광을 달성하기 위해, 마우스 폴리클론 항체를 먼저 배양한 다음 임의의 플루오로크롬에 컨쥬게이트된 이차 마우스 IgG 항체로 인큐베이션을 따르는 것이 중요하다. 그 후, 1차 항체의 흔적이 다음 이차 항체에 의해 인식되는 것을 막기 위해 추가 차단 단계가 필요하다. 이어서, 마우스 단일클론 항체 및 상이한 플루오로크롬에 공주되는 특정 IgG 서브클래스 이차 항체가 적절한 시기에 시료에 첨가된다. 또한, 상이한 종에서 자란 제3 항체를 사용하여 면역형광을 삼중 라벨링수행이 가능하다. 또한, 핵 및 액틴과 같은 구조는 특정 화합물 또는 라벨로 이후에 염색될 수 있다. 따라서, 여기에 제시된 이 접근은 1차 항체의 근원이 제한되는 어떤 세포든지에 대해 조정될 수 있다.

여기서, 우리는 항체의 근원이 trypanosomatids에 있는 특정 구조물 및 단백질을 인식하는 상업적인 항체의 가용성 때문에 제한될 때 면역 형광에 의하여 호스트 기생충 상호 작용을 공부하는 방법을 보여줍니다.
트리파노소마티드 중 T. cruzi는 척추동물과 무척추 동물 호스트 19 사이의 다양한 개발 단계를 포함하는 가장 복잡한 수명 주기 중 하나입니다. T. cruzi 수명 주기 동안, 포유류 감염의 초기 단계에서, 대사 시험포마티고스는 기생충과 척추 동물 숙주 세포19,20에 존재하는 분자의 다양한 관련시키는 과정을 통해 세포를 침략합니다. 이러한 과정을 연구하기 위해, 우리의 실험실은 정기적으로 T. cruzi, T. 브루시, 리슈매니아 sp16,21...

여기서, 프로토콜은 숙주 병원체 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 제기된 1 차적인 항체를 사용하여 이중 표지면역형광을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 본 프로토콜에서 상이한 숙주에서 제3 항체를 포함할 수 있다. 이 접근은 어떤 세포 모형 및 병원체든에서 할 수 있습니다.

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

이 프로토콜에서, 동일한 숙주에서 2개의 항체는 숙주 세포 및 병원체 상호 작용을 연구하기 위하여 면역 형광 분석에서 함께 이용될 수 있다. 기생충에 있는 특정 세포 구조 및 단백질을 인식하기 위하여 유효한 몇몇 상업적인 항체가 있기 때문에, 이 프로토콜은 아주 유용할 수 있습니다. 이것은 동일한 종에서 제기된 다각성 및 단일 클론 항체를 사용하는 이중 라벨링 면역 형광 프로토콜입니다.많은 연구원은 이것이 가능하다는 것을 인식하지 못할 지도 모릅니다. 이 접근법은 항체의 근원이 제한될 때 돕습니다. 감염된 숙주 세포에서 숙주 세포 단백질에서 병원균을 검출하는 데 사용할 수 있으며 자유로운 살아있는 유기체에도 적용될 수 있다.이것은 간단한 프로토콜이며, 항체의 첫 번째 와 두 번째 쌍 사이의 하나의 차단 단계를 필요로한다. 절차는 박사 카밀라 Gachet-카스트로와 박사 과정 학생 레이스 Trajano-Silva 내 실험실에서 시연 될 것이다. Trypanosoma cruzi로 LLC-MK2 세포를 감염한 지 3일 후, 15 밀리리터 세포 배양 원컬 튜브에서 감염된 세포로부터 상류체를 수집한다.원심 분리는 세포 파편을 낮추기 위해 샘플을 한심분리한 다음, 시험포마스티고가 상체로 수영할 수 있도록 튜브를 실온에 놓습니다. 10 분 후, 새로운 원적 튜브에서 상체를 수집 한 다음 샘플을 원심 분리하고 완전한 RPMI 매체에서 기생충을 포함하는 펠릿을 다시 중단하기 전에 상체를 폐기하십시오. UV 살균 둥근 커버립을 포함하는 24웰 플레이트에 LLC-MK2 셀을 추가하고 16시간 동안 정착할 수 있도록 합니다.그런 다음 세포를 감염시키기 위해 T.Cruzi를 포함하는 상체를 각 우물에 추가하고 6 시간 동안 배양하십시오. 다음으로, 감염된 세포와 비감염세포를 PBS로 5회 세척한 다음 PBS에서 2%의 파라포름알데히드로 세포를 수정합니다. 10분 후 PBS로 5분 동안 커버립을 세 번 씻은 다음 이온이온세제로 커버립을 10분 간 세척합니다.3개의 5분 PBS 세차재 후에, 30분 동안 블로킹 용액에 있는 커버립을 배양하고, 마우스 단클론 또는 폴리클론 항체로 또 다른 30분 배양이 뒤따릅니다. PBS 세차 후, 커버립을 차단용액과 프할로이드신을 차단하는 보조 항체로 30분 동안 배양하여 숙주 셀에서 액틴 필라멘트를 얼룩지게 한다. 그런 다음 슬라이드 표면에 DAPI 배지로 소량의 페이드 장착 시약을 적용하기 전에 PBS로 커버립을 세 번 다시 세척합니다.집게를 사용하여, 부드럽게 거품 형성을 방지하기 위해 매체에 커버 슬립을 기울. 이중 라벨링의 경우, 이전에 입증된 바와 같이 블로킹 용액에서 커버립을 배양한 후 마우스 폴리클론 항체에서 30분 동안 배양한다. 다음으로, 커버립을 PBS로 5분 동안 3회 세척한 후 이차 항체로 30분 간 배양합니다.그런 다음 세 개의 PBS 세차재에 따라, 차단 용액에서 희석 된 AffiniPure 토끼 안티 마우스 IgG와 함께 두 번째 차단 단계를 수행합니다. 30분 후, 마우스 단일 클론 항체로 30분 간 배양하기 전에 PBS로 커버립을 다시 세척합니다. 다음으로, 세 개의 PBS 세차재 후 염소 안티 마우스 IgG 2B 항체 및 판로이드로 커버립을 배양합니다.그런 다음 세 가지 PBS 세차재에 따라 이전에 설명한 대로 페이드 방지 장착 시약을 적용합니다. 트리플 라벨링을 위해, 마우스 폴리클론 항체로 커버립을 차단하고 인큐베이팅한 후 염소 항마우스 항체를 거쳐 30분 동안 차단용액에 토끼 폴리클론 항체로 새로운 인큐베이션을 시작한다. 그런 다음 3개의 PBS 세차체 후에, 염소 항토끼 항체로 커버립을 30분 동안 배양한다.다음으로, 3개의 PBS 세차재에 이어, 30분 동안 차단용액에 희석된 AffiniPure 토끼 항마우스 항체로 블로킹 단계를 수행한다. 그런 다음 마우스 모노클론 IgG 서브 클래스 항체로 30 분 동안 배양하기 전에 커버립을 다시 씻으십시오. 3개의 PBS 세차체에 따라, 염소 안티 마우스 IgG 하위 클래스 항체의 특정 쌍으로 30 분 동안 커버립을 배양한다.인큐베이션 후 PBS로 5분 동안 커버립을 세 번 씻습니다. 63X 오일 침지 목표를 가진 공초점 현미경을 사용하여 면역 형광성 샘플을 분석하고 광증 튜브 및 하이브리드 검출기로 형광을 감지합니다. 그런 다음 분리 된 채널로 모든 공초점 이미지를 획득하고 Adobe Photoshop을 사용하여 이미지 처리를 수행합니다.이러한 공초점 현미경 이미지는 숙주 세포 및 내재화된 기생충에서 항체의 특이성을 강조하는 감염및 비감염 세포의 대조 실험결과를 보여준다. 마우스 폴리클론 항체 항-Trypanosoma cruzi FAZ는 기생충 깃발의 깃개 부착 영역에서 T.cruzi 거대 단백질을 인식했지만 숙주 세포에서는 그렇지 않았습니다. 핵에 있는 이질적인 핵 리보뉴클레오프로틴 A1의 분포는 숙주 포유류 세포만을 인식하는 상업적마우스 단클론 항체를 사용하여 관찰되었지만 기생충은 아니다.또한, 숙주 및 기생충 핵 및 기생충 운동성 세포는 DAPI로 염색되었고 호스트 F-actin은 알렉사(594)에 컨쥬게이트된 프할로이드진으로 염색되어 항체의 특이성을 확인시켰다. 이중 라벨링 면역 형광은 공초점 현미경 검사법에 의해 분석된 숙주 및 기생충에 있는 단백질 분포를 보여줍니다. 라벨링은 이 방법론을 사용하여 항체 간의 교차 반응을 제안하지 않았다.요약하자면, 호스트 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 여기에 설명된 프로토콜은 항체의 어떤 조합에도 적응할 수 있는 기본적이고 정교한 기술을 제시합니다. 이 접근법은 면역 형광 비용을 효과적이게 하고 몇몇 항체가 유효할 때 관심있는 2개 이상의 단백질의 현지화를 연구하는 것을 도울 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 동일한 종에서 배양된 두 개의 서로 다른 1차 항체를 사용하여 기생충 및 숙주 단백질에 특이적으로 결합하는 이중 라벨링 면역염색을 보여줍니다. 또한, 이러한 1차 항체를 표적으로 하는 표지된 2차 항체는 숙주 및 기생충 단백질의 뚜렷한 시각화를 가능하게 하여 숙주-병원체 상호 작용에 대한 연구를 용이하게 합니다.

감염된 세포에서 숙주 및 병원체 단백질을 시각화하기 위한 이중 라벨링 면역형광 기법

이 동영상은 동일한 숙주 종의 1차 항체를 사용하여 다중 면역염색을 수행하는 분석을 보여줍니다. 이 방법에서는 부신 조직 절편이 2단계 면역염색 과정을 거칩니다. 처음에는 피질의 마커에 특이적인 항체로 절편을 염색한 다음, 결합된 항체를 벗겨내고 수질의 마커에 특이적인 항체로 다시 염색합니다.

동일 숙주 종의 1차 항체를 이용한 멀티플렉스 면역염색 방법

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

이 입문 수준 프로토콜은 미세아교세포와 신경 요소에 대한 마커를 예로 들어 설치류 뇌의 면역조직화학적 염색을 완료하는 데 필요한 시약, 장비 및 기술을 설명합니다.

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

이 비디오 기사는 동일한 조직 절편 내에서 성체 해마 신경 발생의 모든 단계를 감지하고 정량화하는 포괄적인 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 다른 숙주 종의 적절한 항체를 사용할 수 없을 때 발생하는 간접 다중 면역 형광의 한계를 극복하기 위한 방법을 정교하게 만들었습니다.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

동일한 숙주 종으로부터의 1차 항체를 사용하여 멀티플렉스 면역염색을 위해 여러 가지 다른 방법이 확립되었다. 여기서, 우리는 포르말린 고정 파라핀 내장 마우스 부신 절편에서 멀티플렉스 면역 염색 동안 항체 교차 반응성을 차단하기 위해 마이크로파 매개 항체 스트리핑 및 플루오로포폴-티라미드의 사용을 설명한다.

마우스 부신에 멀티플렉스 면역 염색을 위한 마이크로 웨이브 및 플루오로포어 티라미드 - 동일한 숙주 종에서 분리되지 않은 1 차 항체를 사용하여

이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

이 프로토콜은 알레르기 비염의 쥐 모델을 평가하기 위한 다색 면역형광 기법을 설명합니다.

Multicolor Immunoassay를 통한 알레르기 비염 쥐의 코 점막 조직 절편에서 면역형광 라벨링

방법을 개별적으로 선택 조작 설명 및 이미지 라이브 병원균은 회전 디스크 현미경을 결합 광학 트랩을 사용하고 있습니다. 광학 트랩은 생물의 공간적 시간적 및 제어를 제공하며, 호스트 세포에 인접 장소. 형광 현미경은 세포에 최소한의 섭동와 역동적인 세포 상호 작용을 캡처합니다.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

학습하세요 동일 종에서 제조된 다클론성 및 모노클론성 항체를 사용하여 이중 및 삼중 면역 형광을 수행하는 방법을. Trypanosoma cruzi에 감염된 LLC-MK2 세포에서 교차 반응을 방지하면서 숙주-병원균 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

호스트-병원균 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 항체를 사용하여 면역 형광을 이중 표지합니다

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