혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중된 초음파 및 마이크로 버블 치료를 시각화하는 실시간 인트라바이탈 다광원 현미경 검사법

마이크로 버블의 존재에 초음파 노출은 혈액 - 뇌 장벽의 투과성을 일시적으로 로컬로 증가시키는 효과적인 방법으로 등장했다. 일반적으로 혈액-뇌 장벽 여러 뇌 질환에 대 한 잠재적인 약물의 전달을 방해. 초음파 처리시, 주입된 마이크로버블은 진동을 시작하고 혈관 벽에 부담을 유도하고, 단단한 접합을 열고 결국 약물이 전임상 모델에서 혈액-뇌 장벽을 넘을 수 있도록 허용하며, 초음파 및 마이크로 버블 치료의 효과는 종종 대조적으로 향상된 자기 공명 영상이나 염료 ex vivo의 사치를 연구함으로써 연구됩니다.

이 접근법의 단점은 초음파 노출 후 실시간 반응을 얻을 수 없다는 것입니다. 뇌의 인트라바이탈 다광화상은 이러한 효과를 실시간으로 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 다음 비디오에서는 마우스에 두개골 창을 배치하고 두개골에 장착 된 링 트랜스듀서를 사용하여 초음파 마이크로 버블 치료를 수행하는 방법에 대한 단계별 지침을 제시합니다.

이 절차는 동시 초음파 처리 및 생체 내 다광화상 이미징을 가능하게 합니다. 두개골 창 수술 및 초음파 마이크로 버블 치료에 필요한 재료를 준비하기 시작합니다. 이 비디오에서는 급성 비 회복 두개골 창 수술을 보여줍니다.

만성 회복 두개골 창 수술, 살균 도구 및 재료, 멸균 수술 공간 및 적절한 약물이 필요합니다. 수술 전에 마취와 진통을 투여합니다. 머리에 털을 제거합니다.

동물을 스테레오탁프레임에 놓습니다. dextran 및 마이크로 버블 주사를 위해 꼬리 정맥에 카테터를 삽입합니다. 열원을 사용하여 동물의 핵심 온도를 37도 유지합니다.

여기에 우리는 따뜻한 물로 가득 찬 장갑을 사용하고 있습니다. 두피를 제거하려면 집게를 사용하여 눈 사이에 피부를 들어 올리고 처진 봉합사를 따라 자른다. 면봉으로 두개골의 바깥쪽 표면을 덮는 음골제거합니다.

그런 다음 두개골에 있는 두개골 창의 원하는 위치를 표시하고 윤곽선을 따라 드릴링을 시작합니다. 드릴링 중에 두개골이 과열되는 것을 방지하기 위해 주사기를 사용하여 두개골에 식염수를 떨어 뜨리거나 식염수에 담근 외과 스폰지 조각을 적용하십시오. 두개골을 드릴링하고 냉각하는 것을 번갈아 가며.

뼈 섬에 부드러운 압력을 가하여 드릴링 진행 상황을 확인하십시오. 한 쌍의 집게를 사용하여 뼈 섬을 제거합니다. 식염수에 미리 담근 외과 스폰지 조각을 사용하여 뇌가 촉촉하게 유지되도록하십시오.

두개골 창을 놓기 위해, 커버 슬립의 한쪽에 식염수 한 방울을 놓고 두개골의 구멍 위로 기동합니다. 덮개 슬립의 둘레에 접착제 층을 확산하여 두개골에 부착합니다. 접착제가 완전히 건조되면 아가로즈 용액을 창에 놓고 트랜스듀서를 위에 놓습니다.

트랜스듀서와 두개골 창 사이에 최소한의 아가로즈가 있도록 단단한 압력을 가하십시오. 아가로즈가 젤오와 같은 일관성으로 냉각되면 트랜스듀서의 커버슬립 둘레에서 과잉 아가로즈를 잘라냅니다. 트랜스듀서의 표지 전표 둘레를 따라 접착제 층을 펼쳐 두개골에 부착합니다.

접착제가 완전히 건조 된 후, 현미경의 객관적인 렌즈 아래에 동물을 배치합니다. 목표가 트랜스듀서 또는 커버슬립과 충돌하지 않는지 확인합니다. 다광 현미경에서 시야를 선택합니다.

혈관의 이미징 스캔을 설정하고 초음파 처리를 시작합니다. 이 프로토콜의 경우 0.82 메가헤르츠의 주행 주파수에서 작동하는 링 트랜스듀서, 기계적으로 0.2~0.4의 10밀리초 사이클, 1~4개의 Hertz 사이의 펄스 반복 주파수를 사용합니다. 소노브 마이크로 버블은 킬로그램 당 1 밀리리터의 용량으로 주입됩니다.

성공적인 초음파 마이크로 버블 치료는 BBB 투과성의 증가를 나타내는, 사치스러운 공간에서 형광 dextran의 사치에 의해 검출 될 수있다. 약물 전달을 위한 대표적인 모델로 서두른 누설의 운동을 평가하기 위해 MATLAB과 같은 도구를 사용하여 내외 공간과 사치 공간 사이의 신호 강도를 평가할 수 있다. 초음파 마이크로 버블 치료에 의해 유도 된 혈관 변화를 평가하기 위해, 관심있는 용기의 직경은 초음파 마이크로 버블 치료 전, 도중 및 후에 측정 될 수있다.

이미지 분석은 ImageJ, FIJI 또는 프로그래밍 도구와 같은 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다. 여기서 이마리스는 혈관 세분화 및 분류에 사용되었습니다. 링 트랜스듀서와 결합된 뇌의 인트라바이탈 다광자 현미경 검사는 높은 공간 및 측두성 해상도에서 초음파 마이크로버블 처리에 의해 유도된 효과를 실시간으로 모니터링하는 방법을 제공한다.

정량적 및 질적 데이터는 예를 들어, 사치 운동 및 혈관 변화를 연구하기 위하여 얻어질 수 있습니다. 여기에 제시된 실험 방법은 여러 연구 모델및 다양한 초음파 응용 프로그램에 적용될 수 있다.