Name: 用利甘德分析（DRACALA）的微分径向毛细管作用识别小配体的结合蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习DRaCALA技术用于鉴定大肠杆菌中(p)ppGpp信号分子的靶蛋白。该方法通过放射性标记配体与蛋白裂解液结合，经硝酸纤维素膜点样和磷屏成像实现高通量筛选，为系统研究细菌信号转导提供快速灵敏的工具。

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本工作由丹麦诺和诺德基金会项目资助（NNF19OC0058331）资助YEZ，以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议（Nº 801199）资助MLS。
<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg" />

1. 全细胞裂解液的制备
<ol>
	<li>接种 E. coli K-12 ASKA ORFeome文库菌株15 加入含有1.5 mL 赖氨酸肉汤（LB）的容器中 25 µg/mL 氯霉素置于96孔深孔板中。于37°C培养18小时过夜（O/N）。 30 °C 以160 rpm振荡培养。次日，向过夜培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（终浓度0.5 mM），以诱导蛋白表达 30 °C 6 小时。</li>
	<li>500 × 离心收集细胞 g 10分钟。将沉淀在-80 °C 直至使用。为裂解细胞，加入 150 µL 裂解缓冲液L1（40 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl₂）2，加入2 mM苯基甲基磺酰氟（PMSF） 40 µg/mL DNase 1 和 0.5 mg/mL 溶菌酶）重悬沉淀。</li>
	<li>将细胞在 -80 °C 30 分钟，然后在 37 °C 20分钟。重复此循环三次以裂解细胞。将裂解物储存在-80 °C 使用前</li>
</ol>
2. Relseq 和 GppA 的纯化
注意：使用来自马链球菌（Streptococcus equisimilis）的重组蛋白 Relseq 和来自大肠杆菌（E. coli）K-12 的 GppA 分别合成放射性标记的 pppGpp 和 ppGpp。
<ol>
	<li>培养并收集过表达每种蛋白的细胞。
	<ol>
		<li>在LB肉汤中将E. coli BL21 DE3菌株培养至对数生长期（光密度（OD）约为0.3–0.4），取1 mL培养物在6000 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用100 µL冰冻TSB肉汤（LB肉汤中添加0.1 g/mL PEG3350、0.05 mL/mL二甲基亚砜和20 mM MgCl2）重悬细胞。</li>
		<li>将分别含有组氨酸标签的relseq和gppA质粒各100 ng加入上述TSB细胞悬液中，冰上孵育30分钟。42 °C热激40秒，再将混合物放回冰上2分钟，随后加入1 mL室温LB肉汤，在37 °C、160 rpm振荡条件下恢复培养1小时。</li>
		<li>将恢复后的细胞涂布于添加相应抗生素的LB琼脂平板上（Relseq：100 µg/mL氨苄青霉素；GppA：30 µg/mL卡那霉素）。次日，挑取单菌落接种至LB肉汤中，于37 °C开始过夜预培养两种菌株。</li>
		<li>18小时后，取10 mL过夜培养物接种至500 mL LB培养基中，并加入相应的抗生素。在37 °C、160 rpm振荡条件下培养，当OD600nm达到0.5–0.7时，加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达，继续在30 °C、160 rpm振荡条件下培养3小时。</li>
		<li>在4 °C条件下以6084 × g离心10分钟收集细胞。用20 mL冰冻的1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀，在4 °C条件下以1912 × g再次离心20分钟。弃去上清液，将沉淀于-20 °C冷冻保存，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和纯化 
	​注意：从本步骤开始，确保所有样品保持低温。
	<ol>
		<li>加入40 mL冰冻的裂解缓冲液L2（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，10 mM咪唑，10 mM β-巯基乙醇，并加入蛋白酶抑制剂（无EDTA片剂；见材料表）以重悬沉淀。通过超声处理裂解细胞（60%振幅，开2秒/关4秒，累计开启8分钟）。在4 °C条件下以23,426 × g离心40分钟澄清裂解液，取上清液进行后续纯化。</li>
		<li>在上述离心过程中，准备Ni-NTA树脂。
		<ol>
			<li>将500 µL均质化的Ni-NTA树脂转移至直立的聚丙烯层析柱中，静置15分钟，使保存液自然流出。用超纯水洗涤树脂两次，每次15 mL，然后用15 mL裂解缓冲液L2洗涤层析柱。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将第1步获得的澄清裂解上清液上样至层析柱，使其自然流过。用30 mL洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，20 mM咪唑）洗涤层析柱。</li>
		<li>用400 µL洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，500 mM咪唑）洗脱蛋白三次，随后再用300 µL洗脱缓冲液重复洗脱一次。合并所有洗脱组分，最终体积为700 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶过滤
	<ol>
		<li>配制凝胶过滤缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5；200 mM NaCl；5%甘油）。用一个柱体积（25 mL）的凝胶过滤缓冲液洗涤尺寸排阻层析柱。</li>
		<li>使用500 µL进样环加载上述700 µL样品，流速设为0.5 mL/min，收集2–3个含有目标蛋白的组分，每管0.5 mL。</li>
		<li>合并含有各目标蛋白的组分，使用离心浓缩柱进行浓缩，并通过Bradford法测定蛋白浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 32P标记的pppGpp和ppGpp的合成
<ol>
	<li>在螺口管中配制小规模的 Relseq 反应体系（见表 1）。 
	注意：放射性试剂操作仅可在取得许可的场所进行，并须佩戴个人防护装备。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">体积 (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>小规模</td>
			<td>大规模</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>超纯水</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Relseq 缓冲液*</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP（终浓度 8 mM）</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relseq （终浓度 4 μM）</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32P-α-鸟苷三磷酸（GTP）（终浓度 120 nM）（注意）</td>
			<td>0.2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>20</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：小规模与大规模合成32P标记pppGpp的反应组装信息。 *10x Relseq缓冲液含有250 mM Tris-HCl，pH 8.6；1 M NaCl；80 mM MgCl2。缩写：pppGpp = 鸟苷五磷酸。
<ol start="2">
	<li>将离心管置于37 °C的恒温混匀仪中孵育1小时，随后在95 °C孵育5分钟，再置于冰上5分钟。在15,700 x g 条件下离心5分钟，沉淀蛋白质，将上清液（合成的32P-pppGpp）转移至新的螺旋盖离心管中。</li>
	<li>为从32P-pppGpp合成32P-ppGpp，取一半的32P-pppGpp产物转移至新的螺旋盖离心管中，加入1 µM GppA。在37 °C孵育10分钟，95 °C孵育5分钟，然后置于冰上5分钟。</li>
	<li>在15,700 x g 条件下离心5分钟，沉淀蛋白质，将上清液（合成的32P-ppGpp）转移至新的螺旋盖离心管中。</li>
	<li>取1 µL样品，在薄层色谱（TLC）板（聚乙烯亚胺修饰的纤维素TLC板）上进行电泳分析32P-pppGpp和32P-ppGpp，以1.5 M KH2PO4（pH 3.4）作为流动相。 
	注意：使用α-32P标记的鸟苷-5'-三磷酸（32P-α-GTP）作为对照。</li>
	<li>将TLC板完全干燥，夹在透明塑料文件夹中，暴露于存储磷屏5分钟。使用磷屏成像仪对信号进行成像和定量。 
	​注意：当32P-pppGpp与32P-ppGpp的比率高于85%时，可参照表1配制并合成大规模反应体系（500 µL，足以用于20块96孔板的筛选）。</li>
</ol>
4. (p)ppGpp 靶蛋白的 DRaCALA 筛选
<ol>
	<li>将20 µL全细胞裂解液解冻并转移至96孔V型底微孔板中。每孔加入2.5 U来自Serratia marcescens的内切核酸酶，在37 °C孵育15分钟以降低裂解液黏度。将裂解液置于冰上20分钟。</li>
	<li>将32P-pppGpp与32P-ppGpp按1:1比例混合，加入1倍体积的L1裂解缓冲液，使(p)ppGpp的终浓度为4 nM。 
	注意：由于pppGpp与ppGpp在化学结构上相似，使用两者的混合物可简化筛选过程。</li>
	<li>使用多通道移液器和带滤芯的吸头，将10 µL (p)ppGpp混合物加入细胞裂解液中并混匀。室温（RT）孵育5分钟。</li>
	<li>将96针工具浸入0.01%非离子型去污剂溶液中清洗30秒，然后在纸巾上干燥30秒。重复清洗该针工具3次。</li>
	<li>将针工具插入上述96孔样品板中，静置30秒。垂直提起针工具，并垂直下压至硝酸纤维素膜上，保持30秒。 
	​注意：若某点样缺失，可用移液器和带滤芯吸头点加2 µL相应样品。建议如下方所示对同一样品进行重复点样。</li>
	<li>室温干燥膜5分钟。将膜夹在透明塑料文件夹之间，暴露于存储磷屏5分钟，使用磷光成像仪进行检测。</li>
</ol>
5. 潜在靶蛋白的定量与鉴定
<ol>
	<li>使用与磷屏成像仪配套的分析软件打开已显影平板的 .gel 文件。利用阵列分析功能，通过设置 12 列 × 8 行的网格来定义 96 个斑点。</li>
	<li>定义大圆以包围整个斑点的外缘（见图 1B）。导出所定义大圆的体积+背景和面积，并保存至电子表格中。 
	注意：如有需要，可重新调整每个单独圆圈的位置，使其与斑点完全重叠，并调整每个圆圈的大小，使其略大于实际斑点。</li>
	<li>将已定义的圆缩小，以包围内部的小点。导出所定义小圆的体积+背景和面积，并保存至电子表格中。</li>
	<li>在电子表格中使用图 1B中的公式计算结合分数，并绘制数据图。通过比较其他大多数孔的结合分数，识别出显示高结合分数孔中潜在的结合蛋白。</li>
</ol>
<img alt="大肠杆菌蛋白质合成与分析；SDS-PAGE 和薄层层析；磷屏成像定量工作流程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：DRaCALA 筛选流程的整体工作路线图。 从 Escherichia coli ASKA 文库中诱导表达蛋白质，并裂解细胞。同时，纯化重组蛋白 Relseq-His 和 GppA-His，并利用 32P-α-GTP 合成 32P 标记的 pppGpp 和 ppGpp。将放射性标记的 (p)ppGpp 分子与裂解液混合后，使用 96 孔点样工具将混合物点样至硝酸纤维素膜上，随后进行磷屏曝光、成像及放射性信号的定量分析。缩写：DRaCALA = 配体差异径向毛细管作用分析法；(p)ppGpp = 鸟苷五磷酸和四磷酸；RT = 室温；IPTG = 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；GTP = 鸟苷-5'-三磷酸；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；TLC = 薄层层析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide%2C+c-di-GMP%2C+c-di-AMP%2C+cGMP%2C+cAMP%2C+%28p%29ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li>
<li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+small-molecule+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins%3A+from+protein+kinase+A+to+potassium%2Fsodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li>
<li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404(2015).</li>
<li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+%27%2C5+%27-cAMP+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li>
<li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li>
<li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232(2015).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GIL%2C+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li>
<li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+%28p%29ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mbio%22%5BJournal%5D)">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188(2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus%2C+with+functions+distinct+from+those+of+%28p%29+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388(2020).</li>
<li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+%28DRaCALA%29+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li>
<li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+%28A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive%29%3A+Unique+resources+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li>
<li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li>
<li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p%29ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

进行DRaCALA筛选的关键步骤之一是获得高质量的全细胞裂解液。首先，目标蛋白应大量表达并以可溶形式存在。其次，细胞裂解必须彻底，且裂解液的黏度必须尽可能低。加入溶菌酶并进行三次冻融循环通常足以实现完全的细胞裂解。然而，染色体DNA的释放会使裂解液变得黏稠，并导致非特异性结合信号升高，从而产生假阳性结果，如图3B、C所示。为减轻这一问题，可使用DNase 1和/或粘质沙雷氏菌（S. marcescens）来源的内切核酸酶，并延长孵育时间以充分降解DNA。
在进行大规模筛选之前，应使用阴性对照（空质粒载体）和阳性对照（已知靶蛋白）来优化全细胞裂解液制备及DRaCALA结合实验的条件。一旦确定了最佳条件，在后续每块板的实际筛选过程中便无需再加入对照。这是因为筛选流程非常短暂，且预计每块板中的大部分蛋白质不会与(p)ppGpp结合。因此，这些蛋白质在定量结合比例时可作为阴性对照（图3）。
<p class="j...

细菌利用多种小分子信号物质来适应持续变化的环境1,2。例如，自诱导物N-酰基高丝氨酸内酯及其修饰的寡肽可在细菌之间介导细胞间通讯，协调群体行为，这一现象被称为群体感应2。另一类小分子信号物质是NSMs，包括被广泛研究的环腺苷酸（cAMP）、环二腺苷酸（cyclic di-AMP）、环二鸟苷酸（cyclic di-GMP）以及鸟苷五磷酸和四磷酸（p)ppGpp1。细菌在应对多种不同应激条件时会生成这些NSMs。一旦生成，这些分子便会结合其靶蛋白，调控多种不同的生理和代谢通路，以应对所遭遇的应激环境并增强细菌的存活能力。因此，鉴定这些小分子的靶蛋白是解析其分子功能不可或缺的前提条件。
过去十年间，人们对这些小信号分子的认识迅速增长，这主要得益于几项技术革新，这些技术揭示了这些小分子的作用靶蛋白。这些技术包括捕获化合物技术3,4,5，以及本文将要讨论的配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）6。
由 Vincent Lee 及其同事于 2011 年发明6，DRaCALA 利用硝酸纤维素膜对游离配体与蛋白结合配体的选择性截留能力。蛋白质等分子无法在硝酸纤维素膜上扩散，而小分子配体（如 NSM）则可以。通过将 NSM（例如，ppGpp）与待测蛋白质混合后点样于膜上，可预期出现两种情况（图1：如果(p)ppGpp与蛋白质结合，放射性标记的(p)ppGpp将被蛋白质保留在斑点中心，不会向外扩散，从而形成一个浓密的小点即然而，如果 (p)ppGpp 未与蛋白质结合，则会自由向外扩散，形成一个具有均匀背景放射性信号的大斑点，在磷屏成像仪下呈现强放射性信号。
此外，如果蛋白质在全细胞裂解液中含量足够，DRaCALA 可用于检测小分子与未纯化蛋白质之间的相互作用。这种简便性使得 DRaCALA 可结合 ORFeome 表达文库，快速鉴定蛋白质靶标。事实上，已通过 DRaCALA 系统性地鉴定了 cAMP7、环二-AMP8、环二-GMP9,10 以及 (p)ppGpp11,12,13 的靶蛋白。本视频文章以 (p)ppGpp 为例，演示并描述了成功实施 DRaCALA 筛选的关键步骤和注意事项。需要注意的是，在开展 DRaCALA 实验前，强烈建议结合阅读关于 DRaCALA14 的更详尽描述。
<img alt="硝酸纤维素膜上带有 ³²P-(p)ppGpp 的静态平衡蛋白质结合实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：DRaCALA 的原理。（A）DRaCALA 实验的示意图。详见正文。（B）结合分数的定量与计算。详见正文。简而言之，通过绘制两个圆圈来分析 DRaCALA 斑点，其中一个圆圈包围整个斑点，另一个圆圈包围内部深色斑点（即，由于被测蛋白质结合而保留的 (p)ppGpp）。特异性结合信号为内圈的放射性信号（S1），减去非特异性背景信号（通过 A1 × ((S2-S1)/(A2-A1)) 计算得出）。结合分数为特异性结合信号除以总放射性信号（S2）。缩写：DRaCALA = 配体差异径向毛细管作用分析法；(p)ppGpp = 鸟苷五磷酸和四磷酸；RT = 室温。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-&amp;alpha;-GTP</td><td>Perkinelmer</td><td>BLU006X250UC</td><td></td></tr><tr><td>96 孔针工具</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP 404</td><td>96 孔螺栓复制器，中心间距 9 mm，螺栓直径 4.2 mm，长度 24 mm</td></tr><tr><td>96 孔 V 型底微孔板</td><td>Sterilin</td><td>MIC9004</td><td>Sterilin 微孔板 V 型孔 611V96</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>OXOID - 赛默飞世尔科技</td><td>LP0011</td><td>琼脂 No. 1</td></tr><tr><td>ASKA 文库菌株</td><td>NBRP, SHIGEN, 日本</td><td></td><td>参考文献：DNA Research，第 12 卷，第 5 期，2005 年，第 291&amp;ndash;299 页。https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td></tr><tr><td>苯并核酸酶（Benzonase）</td><td>SIGMA</td><td>E1014-25KU</td><td>来自粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的基因工程核酸内切酶</td></tr><tr><td>Bradford 蛋白检测试剂</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>5000006</td><td>试剂浓缩液</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>&amp;ge;99.9%</td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤柱（10x300）</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>含 20% 乙醇作为防腐剂</td></tr><tr><td>甘油</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1214</td><td>分析纯 87% 甘油</td></tr><tr><td>HyperCassette</td><td>Amersham</td><td>RPN 11647</td><td>20 x 40 cm</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>SIGMA</td><td>56750</td><td>特级纯，&amp;ge; 99.5%（GC）</td></tr><tr><td>IP 储存式磷屏</td><td>FUJIFILM</td><td>28956474</td><td>BAS-MS 2040 20 x 40 cm</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>SIGMA</td><td>I6758</td><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷</td></tr><tr><td>溶菌肉汤（LB）</td><td>英韦特根 - 赛默飞世尔科技</td><td>12795027</td><td>Miller's LB 肉汤基础</td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>SIGMA</td><td>L4949</td><td>来源于鸡蛋清；BioUltra，冻干粉末，&amp;ge;98%</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（氯化镁）</td><td>SIGMA</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td></td><td></td><td>超纯水</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4661110</td><td>F1 - Clip Tip；1-10 µl，8 通道</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>27810</td><td>AnalaR NORMAPUR，ACS，Reag. Ph. Eur.</td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素印迹膜</td><td>Amersham Protran</td><td>10600003</td><td>优质 0.45 µm 300 mm x 4 m</td></tr><tr><td>PBS</td><td>OXOID - 赛默飞世尔科技</td><td>BR0014G</td><td>磷酸盐缓冲液（Dulbecco A），片剂</td></tr><tr><td>PEG3350（聚乙二醇 3350）</td><td>SIGMA</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>SIGMA</td><td>93482</td><td>苯甲基磺酰氟溶液 - 0.1 M 乙醇溶液（T）</td></tr><tr><td>磷屏成像仪</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td>Typhoon FLA-7000 磷屏成像仪</td></tr><tr><td>带滤芯移液器吸头</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>94410040</td><td>ClipTip 12.5 &amp;mu;l 非无菌</td></tr><tr><td>Poly-Prep 层析柱</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>7311550</td><td>聚丙烯层析柱</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片（Mini）</td><td>Pierce</td><td>A32955</td><td>片剂，不含 EDTA</td></tr><tr><td>螺口离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3488</td><td>微量离心管，2.0 ml 带螺口盖，非无菌</td></tr><tr><td>SLS 96 孔深孔板</td><td>Greiner</td><td>780285</td><td>MASTERBLOCK，2 ml，聚丙烯，V 型底，无色</td></tr><tr><td>离心柱</td><td>Millipore</td><td>UFC500396</td><td>Amicon Ultra -0.5 ml 离心过滤器</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer C</td></tr><tr><td>TLC 板（PEI-纤维素 F TLC 板）</td><td>默克 Millipore</td><td>105579</td><td>DC PEI-纤维素 F（20 x 20 cm）</td></tr><tr><td>Tris</td><td>SIGMA</td><td>BP152</td><td>分子生物学级 Tris 碱</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td>粘稠非离子型去污剂</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td>99%（GC/滴定）</td></tr></tbody></table>

利用配体差异径向毛细管作用分析法（dracala）鉴定小分子配体的结合蛋白

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

过去十年中，人们对细菌生理学中小信号分子的理解取得了巨大进展。特别是，多种核苷酸衍生的第二信使（NSMs）的靶蛋白已在模式生物中被系统性地鉴定和研究。这些进展主要得益于若干新技术的发展，包括捕获化合物技术以及配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA），这些技术被用于系统性鉴定这些小分子的靶蛋白。本文以核苷四磷酸和五磷酸鸟苷（(p)ppGpp）这类NSMs为例，介绍并视频演示DRaCALA技术的应用。通过DRaCALA技术，在模式生物大肠杆菌（Escherichia coli）K-12中成功鉴定了20个已知靶蛋白中的9个以及12个新靶蛋白，展示了该分析方法的强大能力。原则上，DRaCALA可用于研究能够被放射性同位素或荧光染料标记的小分子配体。本文还讨论了DRaCALA技术的关键步骤、优势与局限性，以促进该技术的进一步应用。

按照上述方案操作通常会产生两种类型的结果（图3）。
图3A 显示了一个背景结合信号相对较低的孔板（大多数孔的结合分数 &lt; 0.025）。其中H3孔的阳性结合信号结合分数约为0.35，远高于其他孔的信号值。即使未经定量分析，H3孔的信号也十分显著，提示在H3孔中表达的靶蛋白可能与pppGpp、ppGpp或两者均发生结合。事实上，在H3孔中过表达的蛋白为次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶Hpt，已知其能够结合(p)ppGpp12,16。
<img alt="ASKA文库筛选；蛋白质- DNA结合分析；孔板和图表结果；假阳性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig03.jpg" data-altupdatedat="17883047...

利用ORFeome文库，差异径向毛细管配体结合分析法（DRaCALA）可用于鉴定生物体中的小分子配体结合蛋白。

利用配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）鉴定小分子配体的结合蛋白

过去十年间，人们对细菌生理学中重要小分子信号物质的理解取得了巨大进展。特别是靶蛋白……

小分子信号分子可靶向多种效应蛋白，以调控细菌毒力和人类生物学过程。然而，这些效应蛋白的鉴定具有挑战性。作为一种系统生物学工具，DRaCALA 利用 OVium 文库，能够以可行、快速且高度灵敏的方式鉴定未知的效应蛋白。只要能够用放射性同位素或荧光染料进行标记，DRaCALA 可用于研究任何小分子信号分子。首先将大肠杆菌接种至 96 孔深孔板的每个孔中，每孔含 1.5 毫升 LB 培养基，并添加 25 微克/毫升氯霉素，在 30 摄氏度、160 转/分钟条件下过夜培养。次日早晨，用 500 微摩尔 IPTG 在 30 摄氏度处理过夜培养物 6 小时，以诱导蛋白表达。孵育结束后，通过离心收集细胞沉淀，弃去上清液，并将样品在零下80摄氏度冷冻。为启动裂解，将沉淀重悬于150 µL裂解缓冲液中，每孔加入150 µL，在零下80摄氏度孵育30分钟，随后在37摄氏度解冻细胞20分钟。裂解液在使用前应保存在零下80摄氏度。为了充分裂解过表达蛋白的细胞，将样品重悬于40毫升预冷的裂解缓冲液二中，并在60%的超声功率下，以开启2秒、关闭4秒的循环模式超声处理8分钟，随后通过离心澄清裂解液。在样品离心的同时，向直立的聚丙烯层析柱中加入500微升均质化的镍-NTA树脂。离心15分钟后，用15毫升超纯水洗涤沉淀的树脂两次，再用15毫升裂解缓冲液二洗涤一次。离心结束后，将澄清的裂解液上清加到层析柱上。当所有裂解液流经层析柱后，用30毫升洗涤缓冲液洗涤层析柱。为洗脱蛋白质，向层析柱中加入400 µL洗脱缓冲液，并重复洗脱三次。再加入 300 微升洗脱缓冲液，重复洗脱三次，并将洗脱出的蛋白质合并至终体积为 700 微升。对洗脱样品进行凝胶过滤时，先用 25 毫升新配制的凝胶过滤缓冲液洗涤尺寸排阻柱，然后使用 500 微升定量环将全部洗脱蛋白样品上样至层析柱。以 500 微升/分钟的流速运行，并分别收集 2 至 3 个 500 微升体积的组分，对应各目标蛋白质。然后使用单独的离心柱浓缩每种蛋白质，并根据标准操作流程使用Bradford法蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。为合成磷-32标记的鸟苷五磷酸，按照表格中所述在带螺旋盖的离心管中配制小规模Relseq反应体系，在37°C的ThermoMixer中孵育1小时，随后在95°C孵育5分钟，再置于冰上5分钟。孵育结束后，通过离心沉淀蛋白质，将含有合成的磷-32标记鸟苷五磷酸的上清液转移至新的带螺旋盖离心管中。在进行磷-32标记的鸟苷四磷酸合成时，取一微摩尔的GppA加入到新的带螺帽试管中，与一半的磷-32标记鸟苷五磷酸产物混合，于37摄氏度孵育10分钟，95摄氏度孵育5分钟，再在冰上孵育5分钟。孵育结束后，通过离心沉淀反应物，并将含有磷-32标记鸟苷四磷酸的上清液转移至新试管中。为分析分离的目标蛋白，使用1.5摩尔的磷酸二氢钾作为流动相，在薄层色谱板上点样一微升各样品进行分析。分析结束后，将干燥的平板放入透明塑料文件夹中，并将其暴露于存储磷屏上5分钟，然后在磷屏成像仪上进行数据可视化和定量。对于目标蛋白的DRaCALA筛选，将20 µL解冻后的大量裂解液分别加入96孔V型底微孔板的各个孔中，并向每孔加入2.5单位的粘质沙雷氏菌核酸内切酶。在37°C孵育15分钟后，将裂解液置于冰上20分钟。接下来，取等体积的磷-32标记的鸟苷五磷酸和鸟苷四磷酸混合，并向该混合物中加入1X裂解缓冲液一，以获得4纳摩尔的鸟苷五磷酸溶液。使用多通道移液器和带滤芯的移液器吸头，将10微升的鸟苷五磷酸混合物与细胞裂解液混合，在室温下孵育5分钟。孵育结束后，将96孔针工具在0.01%的非离子型去污剂溶液中清洗3次，每次30秒，每次清洗后在纸巾上干燥30秒，然后将针工具放入96孔样品板中。30秒后，将点样针工具垂直向上提起，并垂直向下插入硝酸纤维素膜中，持续30秒。干燥5分钟后，将硝酸纤维素膜放入透明塑料文件夹中，用于储存，并进行磷屏曝光，通过磷光成像系统进行检测，操作如图所示。为了定量分析并鉴定潜在的目标蛋白，在磷光成像仪配套的分析软件中打开已成像平板的凝胶文件。为了确定待分析的斑点，使用阵列分析功能设置一个12列8行的网格。为圈定孔状斑点的外缘，定义较大的圆，将所定义大圆的体积加背景以及面积导出至电子表格。为圈定内部较小的点，缩小所定义的圆，导出所定义小圆的体积加背景以及面积，并将所有数据保存在电子表格中。根据需要调整圆圈位置以与斑点重叠，并将圆圈大小调整为略大于实际斑点。使用公式在电子表格中计算结合分数并绘制数据。随后，在结合分数明显高于大多数其他孔的孔中鉴定潜在的结合蛋白。在此代表性分析中，可观察到大多数孔的背景结合信号相对较低的酶标板。由于鸟苷五磷酸结合蛋白 Hpt 过表达，H3 孔中的阳性结合信号表现出远高于其他孔的结合比例。在代表性酶标板中，多个孔显示出相对较高的背景结合信号，这体现在许多孔中观察到的相对明显的内部斑点，以及定量后观察到的持续较高的结合比例。值得注意的是，某些靶标也表现出可变的结合比例，例如假阳性结果。为了进一步澄清，研究人员使用纯化的蛋白质重新检测结合情况。一旦鉴定出靶标蛋白质，即可将其纯化至均一，并通过 DRaCALA、等温滴定 calorimetry 或其他方法验证相互作用的强度和特异性。鉴定小信号分子的作用靶蛋白，有助于深入理解这些分子在细菌毒力乃至人类生物学功能中所起的作用。

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科研

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生物化学

用利甘德分析（DRACALA）的微分径向毛细管作用识别小配体的结合蛋白

本视频介绍了通过迁移率偏移亲和毛细管电泳分析蛋白质-配体相互作用的方法。该方法可用于表征蛋白质与多种带电配体结合行为的特征。...

迁移率偏移亲和毛细管电泳：一种基于蛋白质-配体复合物迁移差异分析样品-配体相互作用的方法

本视频展示了配体检测的差分径向毛细管作用——一种用于系统性高通量筛选细胞内核苷酸第二信使结合蛋白的技术。该技术可实现第二信使直接与细胞裂解液中过表达的目标蛋白结合，从而无需进行蛋白质纯化。...

配体差异径向毛细管作用分析：一种高通量筛选细菌核苷酸第二信使结合蛋白的细胞内靶标蛋白技术

微量热泳（MST）可广泛用于测定结合亲和力，而无需从细胞裂解液中纯化目标蛋白。该方案包括在非变性条件下过表达GFP融合蛋白、裂解细胞，并在不同浓度配体存在下检测MST信号。...

无需蛋白质纯化的微量热泳动结合亲和力测定方法

差示扫描荧光法是一种广泛用于筛选小分子文库与蛋白质相互作用的方法。本文介绍了一种简单的方法，可将此类分析扩展至估算小分子与其靶标蛋白之间的解离常数。...

使用差示扫描荧光法测定蛋白质-配体相互作用

本文所述方案介绍了两种基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的技术，用于快速研究配体-受体相互作用：第一种检测方法可用于测定配体与受体之间的解离常数；第二种检测方法则可实现对配体-受体相互作用阻断肽的快速筛选。...

一种基于ELISA的结合与竞争方法以快速确定配体-受体相互作用

本文介绍了一种利用光亲和标记技术鉴定小分子结合蛋白的方法。该技术的优势在于，目标蛋白的结合及共价标记过程均在活细胞环境中进行，从而避免了细胞裂解可能对天然蛋白结构及结合条件造成的破坏。...

通过活细胞光亲和标记在天然细胞环境中鉴定小分子结合蛋白

本方案描述了纯化的hEAG1离子通道蛋白与小分子脂质配体磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）之间的相互作用。实验结果表明，生物膜干涉技术（BLI）可能成为一种用于新型小分子离子通道配体筛选的潜在方法。...

通过生物层干涉技术检测离子通道蛋白与小分子相互作用动力学

本文描述了一种进行滴定ELISA的详细实验方案。此外，还提出了一种新颖的算法，用于评估滴定ELISA结果，并获得可溶性配体与微孔板固定化受体结合的解离常数。...

利用滴定ELISA法测定受体-配体相互作用解离常数的方法

关键词：ELISA，滴定，解离常数，受体-配体结合，结合亲和力

本文介绍了一种用于制备和纯化稳定同位素标记蛋白质的实验方案，以及随后利用核磁共振（NMR）波谱法和微尺度热泳（MST）实验表征蛋白质-蛋白质相互作用的方法。...

利用核磁共振波谱法（NMR）和微尺度热泳法（MST）检测球状蛋白与丝状蛋白的相互作用

自显影技术通常用于研究放射性配体与组织切片的结合，以确定药物的定性或定量药理学特性。...

放射自显影作为一种简单而强大的药理学靶点可视化与表征方法

学习DRaCALA技术用于鉴定大肠杆菌中(p)ppGpp信号分子的靶蛋白。该方法通过放射性标记配体与蛋白裂解液结合，经硝酸纤维素膜点样和磷屏成像实现高通量筛选，为系统研究细菌信号转导提供快速灵敏的工具。

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