Name: 使用双光束扫描电子显微镜从玻璃体生物样品制备薄片进行冷冻电子断层扫描 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学习使用双束扫描电子显微镜制备玻璃体生物样品薄片，用于冷冻电子断层扫描。该方法以感染恶性疟原虫的人红细胞为样本，实现高分辨率原位结构分析。

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本研究全部或部分由惠康信托基金（Wellcome Trust，项目编号：212916/Z/18/Z）资助。为实现开放获取，作者已对本投稿所产生的任何作者接受稿件版本应用了CC BY公共版权许可。
本项目的研究方法由英国医学研究理事会（MRC）资助，资助编号为 MR/P010288/1，授予 Helen R. Saibil、Roland A. Fleck&#160;和 Michael J. Blackman。恶性疟原虫（P. falciparum）的培养在弗朗西斯·克里克研究所（The Francis Crick Institute）进行，并得到 Michael J. Blackman 研究团队成员的支持。作者谨此感谢 Ser Ying (Michele) Tan 博士提供了化合物 2 以及经 E64 处理的裂殖体在薄血涂片中的图像。大部分薄片样品的制备得到了电子生物成像中心（eBIC）工作人员的支持，我们感谢在研究提案 NT21004 下使用 Scios 双束冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）的机会。作者还感谢英国皇家学会产业研究员计划（INF\R2\202061）对在 CUI 内持续推进聚焦离子束切削（FIB-milling）技术发展的支持。作者同时感谢 Helen R. Saibil 就本方法学论文所进行的有益讨论以及对整个项目的指导。

人血通过英国国家血液与移植服务机构从匿名捐赠者处获取，并在收到后两周内使用。使用此类血液无需伦理审批。
1. 样品制备与冷冻投入&#160; 恶性疟原虫&#160; 感染的红细胞
<ol>
	<li>通过离心（1,580 x g）分离成熟的裂殖体 g) 在70%（v/v）等渗密度梯度培养基上方（关于培养3D7无性血阶段的标准操作步骤 恶性疟原虫 在人红细胞中，参见 Blackman M.J., 199537).</li>
	<li>用100%甲醇固定载玻片上的空气干燥薄血膜，以在使用6.7 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.1）配制的10%吉姆萨染液染色前，检查裂殖体的形态均一性。 
	注意：为了富集停滞在特定裂解阶段的裂殖体，可进一步使用化合物2和E64抑制剂对裂殖体进行同步化处理（参见 代表性结果 和 图1 有关这些抑制剂作用的解释）。 
	警告： 恶性疟原虫 是一种人类病原体，必须在符合当地健康与安全规范的适当 containment 设施中操作。</li>
	<li>轻轻离心裂殖体（240 × g） g) 离心沉淀细胞，然后用相当于细胞沉淀体积2倍的RPMI培养基重悬，得到50%红细胞比容的细胞悬液。</li>
	<li>在手动冷冻固定装置上，取2.5 μL裂殖子悬液滴加至经辉光放电处理的（使用辉光放电仪，参数设置为：空气环境中30 mA，60 s，仅处理载网的碳膜面）200目铜载网的碳膜面，该载网为具有2/4型穿孔碳膜的载网。用带有撕边的1号滤纸从载网背面吸附约20 s。迅速浸入液氮冷却的液态乙烷中进行冷冻，随后将载网转移至储存容器中（见&#160;材料表&#160;用于本研究的设备）。 
	注意：实验可在此处暂停，载网可无限期地保存在液氮中。 
	警告：液氮具有窒息性，可导致冻伤；须在配备氧气监测的适宜环境中小心操作。 
	警告：液态乙烷会引起严重灼伤，且具有可燃性；应在通风橱中使用，并远离点火源。 
	注意：经浸入式冷冻的裂殖体已无活性。该结论基于将若干载有空气解冻后浸入式冷冻裂殖体的金网格与人血共同孵育，数日后未观察到寄生虫生长，而未冷冻的对照组则有生长。因此，裂殖体冷冻载网在非密闭设施中操作时是安全的，只需采用常规的安全与去污染程序（如佩戴手套，使用70%乙醇或次氯酸钠溶液对表面和工具进行消毒）。 &#62;70% 乙醇及载网的处理 &#62;70% 乙醇</li>
	<li>使用光学显微镜的冷冻载台筛选载网，特别注意冰层在载网上的厚度梯度。在较薄的冰区，检查各个载网方格中的细胞覆盖情况。 
	&#8203;注意：最佳的方格应为在网格方格中心处单层细胞厚度图2）。这可以确保在方格中心切削薄片时，不会触及网格条边缘处较厚的冰层。实验可在此暂停，载网可无限期地保存在液氮中。如果细胞带有荧光标记，也可通过冷冻关联显微镜（cryoCLEM）对载网进行筛选，以定位感兴趣的X/Y位置，并将这些位置与冷冻聚焦离子束扫描电镜（cryoFIB-SEM）中的载网位置相关联，从而指导切削操作。</li>
</ol>
2. 冷冻浸入细胞的网格内聚焦离子束铣削
<ol>
	<li>使用黑色永久性记号笔在专用于冷冻FIB的自动网格环的正面标记，以指示切口部分的中心位置及环的对侧位置图3）。设置剪切工作站，将载网网格剪切到已标记的载网环中，碳膜面朝下。</li>
	<li>将载网装入冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）样品 shuttle 中（通常为 2 个载网，取决于 shuttle 类型），碳膜面朝上，并在氩气环境中进行铂溅射镀膜（5 × 10⁻³ mbar，厚度约 20–30 nm）。-2 mbar）（5 mA，60 s——厚度可变）或对细胞表面进行碳/铂电子束旋转镀膜（约4 nm厚度）。 
	注意：两种涂层均有助于在扫描电镜成像过程中分散电荷。电子束旋转镀膜仪的优点在于可精确设定涂层的厚度。</li>
	<li>将载样穿梭盒装入冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM），在5 kV（13 pA或25 pA）条件下通过扫描电镜观察每张载网上的细胞分布情况。先获取低倍率概览图像（约100倍），检查载网上的冰层梯度。随后获取较高倍率图像（约5,000倍），观察单个载网方格，识别出具有明显细胞结构且表面污染较少的区域，用于后续切削加工。</li>
	<li>应用 &#62;使用气体注入系统（GIS）在每张载网表面沉积2 µm的有机铂涂层。操作时，将GIS针头插入载网上方的腔室中，将有机铂源加热至设定温度并保持一定时间（例如，约27 °C下持续3–10 s），以产生蒸气流。 
	注意：通过 GIS 针对样品施加有机铂镀层的角度、温度和时间应优化，以实现均匀镀层。具体参数取决于所使用的 cryoFIB-SEM 型号（参见 代表性结果 如需进一步说明）。</li>
	<li>将样品倾斜，使载网平面与离子束入射角成约10°，并移动合适网格方格的中心，使其在扫描电镜（SEM）和聚焦离子束（FIB）图像中均可见。</li>
	<li>使用离子束在低电流（标称值为 1.5 pA，30 kV）下扫描网格，并放大至足够高的倍数（约 7,000 倍），以观察位于网格方格中心的细胞。在第一铣削电流（300 pA）下将样品调至聚焦状态，并校正像散。调节亮度与对比度，然后标记出两个用于铣削的矩形区域，分别位于一个厚度为 3 µm 的受保护区域的上方和下方，该受保护区域的中心即为目标薄片的最终位置。 
	注意：所选图案的宽度取决于周围细胞层的形貌和细胞大小。对于裂殖体而言，7–20 µm 是合适的宽度，但较宽的薄片需要更长的铣削时间。第一次铣削步骤中所选图案的高度取决于样品厚度，起始值约为 6 µm；该参数在铣削过程中可能需要调整。铣削从图案的外侧上下边缘朝薄片表面方向进行。此过程可并行或顺序完成：并行指两个图案同时铣削；顺序指先去除薄片上方的材料，再去除下方的材料。</li>
	<li>以初始电流开始研磨；在离子束视图中实时监测进展，并间歇性地通过扫描电镜（5 kV，13 或 25 pA）进行观察。检查离子束是否已穿透保护区域上下方的样品。若未穿透，增加矩形图案的高度以去除更多材料。当离子束视图中薄片上下表面完全光滑时，停止研磨。 
	注意：当矩形图案内部在焦平面上无任何特征时，表明离子束已在保护区域的上下方穿透样品。某些特征（如网格条）可能在背景中失焦可见。</li>
	<li>切换至下一个铣削电流（100 pA）；调整焦距并优化亮度/对比度。将两个矩形图案之间的间距减小至1.5 µm，并降低图案高度，使其仅覆盖未铣削的材料区域。在新电流下开始铣削，直至薄片上下表面完全平整。</li>
	<li>逐步重复此过程，直至达到 0.3 µm 的厚度，每次根据铣削方案逐步降低离子束电流。 表1.</li>
	<li>在一张或两张网格上铣削多个薄层（数量取决于样品厚度和可用时间），厚度约为0.3 µm，记录每个薄层的X/Y/Z位置，并在会话结束前预留约1–2小时，将薄层抛光至最终厚度（60–200 nm）。</li>
	<li>对整个载网进行低倍率扫描电镜概览，规划一个从载网前端（靠近离子束源一侧）的薄片到载网后端（远离离子束源一侧）的薄片的抛光路径（图5). 
	注意：这可以减少消融材料重新沉积到抛光薄片表面的现象。</li>
	<li>将两个矩形图案之间的间距减小至100–200 nm，并在离子束电流为30 pA的条件下开始最终抛光步骤。使用扫描电子显微镜（SEM）在2–3 kV（13 pA，停留时间 = 300 n，3072 × 2048，全帧约2 s）下监测进展，当薄片在SEM中对比度消失，或薄片本身的有机铂涂层开始失去完整性时，停止抛光。</li>
	<li>在取出载网之前，先对整个载网采集低倍SEM图像，并保存每片薄片的图像，以便后续在TEM中对照载网时使用。在此暂停实验，将带有薄片的载网小心地保存在液氮中。 
	&#8203;注意：从冷冻聚焦离子束扫描电镜（cryoFIB-SEM）中取出后，载网可进行轻微溅射镀膜，有助于在高倍透射电镜（TEM）观察时减少漂移和电荷积累。但应谨慎操作，过度溅射镀膜可能遮蔽薄片内部的生物结构。此阶段可对薄片进行荧光筛选，但能否获得足够信号取决于薄片厚度内标记蛋白的丰度。操作载网时须格外小心，以避免薄片损伤和表面污染。</li>
</ol>
3. 倾斜系列图像采集及数据处理总体概述
<ol>
	<li>将载网装入透射电子显微镜，使铣削方向与样品台的倾斜轴垂直对齐。 
	注意：通过肉眼观察自动网格边缘的标记来对齐网格。允许约10°的误差范围，否则在倾斜网格时，薄层两侧的沟槽壁可能会遮挡薄层。</li>
	<li>获取整个载网的低倍率图像（约150倍），定位薄片区域；然后对每个薄片获取中等倍率图像（约1,500倍，根据薄片大小调整），并定位感兴趣区域。</li>
	<li>将载网预倾 ±10°，使薄层平面（而非载网）垂直于光轴 
	注意：预倾方向可通过低倍和中倍率图像中薄层前缘的位置（寻找残留的有机铂涂层）来确定。对于本实验所用的透射电镜，载网需要&#160;若片层前缘指向，则具有+10°预倾角&#160;在图谱中上升并需要&#160;指向时具有 -10° 的预倾角&#160;向下。每个网格可能因拾取和插入自动进样器的方式不同而有所差异。</li>
	<li>获取剂量对称的倾斜系列图像38 （例如，倾斜角度范围为 -54° 到 +54°，增量为 3–5°），像素尺寸应能同时满足感兴趣区域所需的视场和分辨率。使用 -2 至 -5 µm 之间的欠焦值范围。每个角度增量采集 3–10 帧的电影图像，并根据像素尺寸调整这些参数，使总电子剂量累积约为 150 e⁻/Å²。-/Å2 （适用于300 kV透射电子显微镜）。 
	注意：应避免薄片出现裂纹，因为这些区域可能发生漂移。还应避免表面污染，因为它可能遮蔽感兴趣区域或高倾角下的聚焦区域。</li>
	<li>使用 MotionCor2 等程序对电影文件进行运动校正39. 对校正后的图像（累积的 e）应用剂量加权滤波器-/image)40 并使用诸如 CTFFIND4 之类的程序估计每幅图像的离焦量41.</li>
	<li>使用无标志点对齐（图像块追踪）方法，在 etomo（IMOD）等程序中进行42 用于计算倾斜系列图像中的图像对齐和角度关系。</li>
	<li>输入对齐和旋转信息以及离焦值到能够进行三维CTF校正的程序中，例如 NovaCTF43计算校正后的断层图像，以获得适用于下游分析的、具有相应合并像素（binning）因子的输出断层图像。</li>
	<li>分析重建结果，并为后续处理做好准备，例如过滤、分割或子断层平均。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管冷冻聚焦离子束（cryoFIB）切片技术正逐渐趋于常规化，但用于切片的最优样品制备仍未实现标准化；因此，本方案中的大多数关键步骤均发生在样品进入冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）之前。在尝试切片前，必须通过多轮的细胞制备、投入式冷冻以及光学和电子显微镜的筛选来优化样品。获得尽可能高质量的样品不仅能够提高实验成功的几率，还能优化设备的使用效率。正因如此，大多数国家级平台在分配机时前，均要求用户提供已进行充分优化的证据。一旦样品进入cryoFIB-SEM，最大化有机铂镀层的效能至关重要，以确保生成厚度均匀的薄片。最后，操作者必须具备耐心和良好的样品操作技能，因为需要连续多日完成含精细薄片的载网制备及转移工作。随着自动化切片策略的引入47,48，这一状况可能发生变化，但目前在大多数机构中，整个切片过程仍主要依赖人工操作。
尽管本研究仅针对P. falciparum裂殖体，但本文所介绍的方法可轻松修改，以优化其他细胞类型的载网制备和切片过程。需要考虑的重要因素包括：接种到载网上的细胞密度、载网类型（铜网对某些细胞具有毒性）、碳膜上孔洞的大小和间距、 blotting时间以及blotting方法（单侧/双侧、手动或自动）。此外，如果细胞是在载网上培养的（通常为带有穿孔碳膜的金网），可在blotting和冷冻前通过光学显微镜检查细胞汇合度。切片策略取决于细胞在载网上的沉积方式。对于疟原虫感染的红细胞，载网表面基本被一层连续的细胞覆盖，某些区域较厚，其他区域较薄。切片操作可在该厚度梯度的某一区域内多个位点进行，选择冰层厚度能够产生适合断层成像的薄片区域。这种方法适用于较小的细胞，因为可以制备出包含多个细胞横截面的薄片。而对于较大的细胞或细胞团块，可能一个细胞或细胞团块仅能产生一个薄片。
载网操作和样品转移仍是该工作流程中的主要挑战之一。薄片可能因断裂或裂纹而丢失，帘状伪影会遮蔽生物学结构，表面污染过度，以及在透射电镜（TEM）中出现载网方向问题，这些都可能需要额外的操作步骤来重新定位载网。损失程度因天而异、因载网而异，但随着实践和操作经验的积累会逐步改善。本研究发现，载网可在自动进样器中多次小心地重新调整方向，而不会破坏薄片，有时还能借此洗去表面的冰层。该工作流程的另一个主要局限在于制备薄片所需的时间。由于制备过程缓慢，因此至关重要的是要对样品进行充分优化，以使铣削过程尽可能高效。
近年来，针对玻璃态生物样品的聚焦离子束铣削（FIB-milling）技术已引入多项改进。其中一项具有变革意义的进展是在cryoFIB-SEM腔室内采用低温冷却的拾取工具，使得能够从高压冷冻样品中铣削出更大体积的样品块。这些样品块可被固定在金属杆上，或用夹具拾取并转移至第二个样品位置，该位置包含经过特殊改造的电镜载网。随后可对样品块进行有机铂镀膜，并进一步铣削以制备薄片（lamellae）。这种从高压冷冻样品中直接铣削薄片的能力，使得更大尺寸的细胞和组织得以处理，并可通过相关荧光显微镜技术对特定区域进行精确定位12。FIB铣削技术的其他近期改进包括：通过楔形预铣削减少帘状伪影16、微流控低温固定技术49，以及对电镜载网进行光刻微图案化以改善细胞分布50。此外，已有研究证明，在薄片两侧铣削出微小的扩展间隙，可在样品达到最终厚度时缓解周围材料对其产生的压缩效应51。这一方法在处理连续细胞层（如本研究中的样品）时尤为有用，因为此类样品在最终抛光步骤中常出现薄片弯曲现象。
电子显微镜的未来很可能是通过子层析平均法（sub-tomogram averaging）来确定in situ分子结构，而聚焦离子束切削（FIB-milling）是一项重要工具，将有助于为这类工作流程制备玻璃态生物样品。尽管FIB-milling在生物应用中仍处于起步阶段，但由于学术界和国家级研究设施的研究人员的辛勤工作，以及商业领域对开发支持科研的冷冻聚焦离子束-扫描电子显微镜（cryoFIB-SEM）技术的投入，相关方法的开发正在快速推进。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

只有厚度 &#60;500 nm 的生物样品的细胞内容物，才能在低温条件下通过透射电子显微镜（TEM）进行有效成像，这限制了可观察样本的范围，仅限于病毒、原核生物、简单的单细胞生物以及较大真核细胞的较薄区域1。在载网上进行的聚焦离子束（FIB）铣削技术，可将较厚的速冻生物样品在低温条件下（&#60; -150 °C）减薄至电子透明的薄片。所得薄片随后被转移至透射电子显微镜中进行观察和断层数据采集，从而实现对细胞内细胞结构和分子特征的高分辨率三维重构（相关综述见 Rigort 等，20122；Oikonomou 等，20163；Wagner 等，20204）。
聚焦离子束（FIB）铣削技术源于材料科学领域，该领域通常对样品进行减薄处理以用于后续分析5。该技术在扫描电子显微镜（SEM）中进行，该显微镜具有两个光学柱：一个是常规的扫描电子显微镜光学系统，另一个则包含能够生成并精确控制聚焦离子束（FIB）的光学系统，此类设备称为FIB-SEM。通过镓离子源产生的离子束可对样品的特定区域进行消融，去除多余材料，从而留下一片薄片（lamella）6。铣削过程由SEM对样品表面形貌的成像进行引导，用于定位感兴趣区域并实时监控铣削进展。在生物学应用中，基本装置大体相同，但铣削需在低温条件下进行。这要求标准FIB-SEM配备可维持恒定低温且表面污染率低的低温冷却台，以及配备气闸以实现无需玻璃化破坏或污染的样品转移。样品载具也已改进，以便在cryoFIB-SEM内安装多种不同类型的载体，包括透射电镜（TEM）载网、冷冻板（planchettes）和毛细管。多个研究团队在这些方法的发展及该领域持续的技术进步中发挥了核心作用7,8,9,10,11,12。目前，适用于生物样品的低温FIB铣削商业解决方案已更加普及，对于优化后的样品，载网上直接铣削薄片正变得日益常规化。
一系列室温与冷冻电镜（cryoEM）技术可用于在生命的所有尺度上可视化细胞信息，从低分辨率下观察完整的多细胞生物体，到在细胞水平上理解复杂过程的背景，乃至更精细地解析原位（in situ）分子结构13,14,15,16,17,18,19。传统的室温技术包括对固定、染色并包埋于树脂中的细胞和组织进行超薄切片（ultramicrotomy），随后通过透射电子显微镜（TEM）分析其细胞形态（综述见 Studer 等，200820）。另一种技术则利用扫描电子显微镜（SEM）检测二次电子散射，对保存的细胞块表面成像，并通过刀片（连续块面成像）或聚焦离子束逐步去除材料21,22,23。该技术也已成功应用于低温条件（称为冷冻体积成像，cryo-volume imaging），使用cryoFIB-SEM对玻璃态、未染色的细胞或组织块进行成像24。此外，也可制备较厚的薄片（约15 µm厚），并通过扫描透射电子显微镜（STEM）成像进行研究25。利用这些技术，可对包含多个细胞的整块样品成像以获取群体信息，或对整个器官/生物体进行三维成像与重建。然而，若要从细胞中获取高分辨率的分子信息，样品必须以接近天然状态的冷冻水合形式保存，因此需在低温条件下制备。玻璃态切片冷冻电子显微术（CEMOVIS）是一种在低温条件下使用超薄切片机对高压冷冻的生物样品进行切片的技术。该方法可产生厚度为40–100 nm的冷冻切片带26，将其附着于电镜载网上并在TEM中成像。然而，刀片与玻璃态样品的物理相互作用会导致裂隙和压缩伪影，严重扭曲细胞结构27,28,29,30。较厚的切片更容易出现此类伪影，因此使用超过约70 nm的切片在实践中不可行26。这一限制极大影响了断层成像（tomogram）中生物结构的三维视图。低温聚焦离子束（FIB）铣削不会出现上述问题，但会产生因样品不同区域铣削速率差异导致的伪影，造成薄片内部厚度不均，即“帘状效应”（curtaining）。该问题可通过气体注入系统（GIS）施加有机铂涂层来缓解，该涂层可在铣削过程中保护薄片前缘31。载网上FIB铣削的样品厚度上限取决于将样品快速冷冻同时保持其玻璃态的能力32。然而，随着冷冻提取技术（cryo lift-out）及适用于生物样品的改良样品载体的引入，FIB铣削也可用于处理高压冷冻样品31,33,34,35。此外，快速冷冻的样品也不能过薄，因为必须有足够的生物材料以形成尺寸合理的薄片，从而提供足够的表面积用于在所需放大倍数下采集倾转系列图像（tilt-series）。该问题可通过铣削较小细胞（如细菌或酵母）的聚集体来缓解。最终薄片的厚度（约100–300 nm）通常由样品完整性及铣削策略决定。较薄的薄片更适合高分辨率结构研究（如亚断层平均化），而较厚的薄片则能在接近天然保存状态的样品中包含更大的细胞体积，从而提供更丰富的细胞背景信息。FIB铣削还可用于减薄快速冷冻的蛋白质晶体，以进行电子衍射研究36。
如果科学问题需要对近天然状态的样本进行高分辨率分子细节分析，则对玻璃态细胞进行聚焦离子束铣削是值得投入时间和精力的 原位。随着更多设施可用于常规制备薄片样品，限制速率的步骤通常是铣削前的样品优化，需要花费时间确保样品处于玻璃态并具有合适的厚度，以制备出坚固且厚度均匀的薄片。本文所述为聚焦离子束铣削制备 plunge-frozen 感染疟原虫的人类红细胞样品的优化方法 恶性疟原虫 疟原虫是疟疾的致病因子，但该方法可适用于任何给定样本。

<table><tbody><tr><td>c-clips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>切片站</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>直接引用自 Thermo</td></tr><tr><td>切片站</td><td>Sub-angstrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>化合物 2</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>由 LifeArc 的 Simon A. Osborne 博士合成</td></tr><tr><td>用于冷冻聚焦离子束的专用 autogrid 边框</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1205101</td><td></td></tr><tr><td>E64</td><td>Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Emitech K100X 电晕放电装置</td><td>Quorum</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633012</td><td>所用配方为定制（货号 041-91762 A），包含 Albumax、谷氨酰胺、HEPES 和次黄嘌呤补充物</td></tr><tr><td>吉姆萨染液</td><td>VWR International</td><td>350864X</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11562203</td><td></td></tr><tr><td>载网盒</td><td>Sub-angstrom</td><td>PB</td><td>用于存放切片后的载网</td></tr><tr><td>载网盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>用于存放切片后的载网——直接引用自 Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>载网盒</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3727</td><td></td></tr><tr><td>自制手动浸入式冷冻装置</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>配备隔热乙烷罐（高密度泡沫）和液氮浴（聚苯乙烯），置于生物安全实验室的操作台面上</td></tr><tr><td>人血</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>来自英国国家血液与移植服务中心</td></tr><tr><td>配备 Leica VCT500 冷却阶段系统的 JEOL 4700F Z JSM</td><td>JEOL</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>配备 VCT500 冷冻台的 Leica EM ACE600</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>溅射镀膜仪</td></tr><tr><td>Leica EM ACE900</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>电子束旋转镀膜仪。在湿度受控的房间内使用。</td></tr><tr><td>Linkam 显微镜用冷冻台</td><td>Linkam</td><td>型号 CMS196</td><td>用于存放切片和未切片载网的样品盒。在湿度受控的房间内使用。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>配备 Linkam 冷冻台的 Nikon Eclipse E200 光学显微镜</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>在湿度受控的房间内使用</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR International</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll 垫层溶液的配制方法为：35 ml 10x PBS、150 ml RPMI 1640 培养基和 315 ml Percoll</td></tr><tr><td>Quantifoil 铜质 200 目 2/4 多孔碳 EM Finder 载网</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCuH2-01</td><td>每包 100 片</td></tr><tr><td>Quantifoil 铜质 200 目 2/4 多孔碳 EM 载网</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCu20-01</td><td>每包 100 片</td></tr><tr><td>Quorum PP3010 预处理室</td><td>Quorum</td><td>n/a</td><td>溅射镀膜仪</td></tr><tr><td>配备 Quorum PP3010 转移台的 Scios 双束系统</td><td>FEI</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Staedtler Lumocolor 细尖黑色永久记号笔</td><td>Viking Direct</td><td>ND538522</td><td></td></tr><tr><td>TFS Titan Krios 300 kV 透射电子显微镜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>配备 K2 或 K3 相机的透射电镜</td></tr><tr><td>Whatman 1 号级滤纸</td><td>Sigma</td><td>WHA1001150</td><td></td></tr><tr><td>配备 Linkam 冷冻台的 Zeiss Axio Scope A1 光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>在湿度受控的房间内使用</td></tr></tbody></table>

使用双束扫描电子显微镜制备玻璃态生物样品薄片用于冷冻电子断层扫描

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

本文介绍了一种从浸入式冷冻网格制备冷冻薄片的方案 恶性疟原虫-感染的&#160;人红细胞，该方法可轻松适用于其他生物样本。制备样品、切削及观察薄片的基本原理适用于所有仪器，本方案可作为冷冻电镜（cryoEM）和冷冻电子断层扫描（cryoET）中载网原位冷冻薄片制备的通用指南。承载细胞的电镜载网通过手动或自动冷冻仪浸入液氮冷却的液态乙烷中进行速冻，随后在配备冷冻台的光学显微镜下进行筛选。冷冻后的载网转移至配备聚焦离子束（cryoFIB-SEM）的冷冻扫描电子显微镜中。在切削前，载网通常需进行溅射镀膜，以帮助消除切削过程中积累的电荷。 alternatively，可使用电子束旋转镀膜仪在载网上沉积一层碳-铂，其厚度可更精确地控制。进入cryoFIB-SEM后，通过气体注入系统（GIS）在载网表面沉积一层有机铂化合物。该涂层可保护薄片前缘在切削过程中的完整性，这对获得厚度均匀的薄片至关重要。通过扫描电镜（SEM）识别感兴趣区域，并逐步进行离子束切削，在薄片接近电子透明时逐步降低离子束电流，以避免产生过多热量。制备有多片薄片的载网随后在低温条件下转移至透射电子显微镜（TEM）中进行倾转系列图像采集。稳定且无污染的薄片制备流程是细胞冷冻电镜、冷冻电子断层扫描及亚断层平均等下游技术的关键前提。目前领域内高度优先的发展方向包括针对高压冷冻样本的拾取与切削技术的优化与完善。

利用聚焦离子束铣削技术，从浸冻的生物样品中制备用于冷冻电子断层扫描的玻璃态原位薄片。

本文介绍了一种从浸入式冷冻的恶性疟原虫感染人红细胞载网制备冷冻薄片的方案，该方案可……

本方案概述了制备感染恶性疟原虫的红细胞玻璃态切片以进行冷冻电子断层扫描的方法。该方法能够直接观察寄生虫导致疟疾的详细结构信息。冷冻电子断层扫描可记录细胞内部的高分辨率信息。其功能强大，足以原位观察单个蛋白质复合物，并可通过计算手段提取并进行平均化处理，从而揭示蛋白质的三维结构信息。该方案可轻松适用于不同类型的细胞，对于初次尝试制备用于冷冻电子断层扫描的玻璃态切片的研究人员而言，可作为理想的起点。这位是Alejandra Carbajal，她将负责执行今天的实验方案。首先，使用带有CryoStage的光学显微镜检查冷冻铜网，特别注意网格上冰层的厚度梯度。在冰层较薄的区域，检查各个网格方格中的细胞覆盖情况。使用黑色永久性记号笔标记专用于Cryo-FIB-SEM的Autogrid边缘的正面及相对侧。将切好的载网放入Cryo-FIB-SEM样品载具中，碳膜面朝上，并对细胞表面进行四纳米厚的碳或铂电子束旋转镀膜。将样品载具装入Cryo-FIB-SEM，使用五千伏的扫描电镜（SEM）评估每张载网上细胞的分布情况。在100倍低倍率下获取整体图像，以观察载网上的冰层梯度。然后以5,000倍的高倍率拍摄图像，以观察单个网格方格。通过将气体注入系统针头插入网格上方的腔室，并将有机铂源加热至设定温度并保持一定时间，使蒸气释放，从而在每个网格表面施加一层两微米的有机铂涂层。为观察样品，倾斜样品使网格平面与离子束入射角大约成10度，并移动合适网格方格的中心，使其在扫描电镜（SEM）和聚焦离子束（FIB）图像中均可见。使用低电流离子束，在高倍率下扫描网格，以观察位于网格方格中心的细胞。标记出两个用于铣削的矩形区域，分别位于一个三微米厚的保护区域的上方和下方。然后选择合适的束流参数，并通过调节亮度和对比度来校正像散。设置完成后，在离子束视图中实时监测并间歇性地通过扫描电镜（SEM）观察，以300皮安的电流开始铣削。在SEM视图中检查样品，首次铣削后，若离子束尚未在保护区域上下方完全穿透样品，则通过增加矩形图案的高度来去除更多材料。当在离子束视图中观察到薄片上下表面完全光滑时，停止铣削。逐步重复研磨过程，每次降低离子束电流，直至样品厚度达到300纳米。记录每片薄片的X Y Z位置。实验结束时，使用低倍SEM概览图像选择一组待抛光的薄片，并标记抛光起点。标记抛光根部后，将两个矩形图案之间的间距减小至100至200纳米，并在30皮安的离子束电流下开始抛光。在2至3千伏条件下通过扫描电镜（SEM）监测进展。当扫描电镜显示薄片中的对比度消失，或有机铂涂层或薄片本身开始失去完整性时，停止抛光。获取并保存每片薄层的低倍SEM图像。实验结束后，将样品台从显微镜中取出。取下带有薄层的载网，并将其置于液氮中保存。小心操作载网。为了研究形态学，使用 E-64 抑制剂中的化合物二将裂殖体阻滞在逸出的不同阶段。在化合物二存在的情况下，寄生泡膜与宿主红细胞内周围血红蛋白之间的边界清晰分明。完整的寄生泡（PV）内充满裂殖子，并聚集在单一的疟色素晶体团块中。当用E-64洗涤含有化合物二的同步裂殖体时，寄生泡膜破裂，裂殖子在红细胞内散开。铜网上细胞分布良好的典型示例显示，红细胞体积较大，边缘清晰，寄生泡膜完整。在部分塌陷的宿主红细胞内，单个裂殖子呈现为微小的细胞簇。每个裂殖体中央均有一个黑点，指示疟色素晶体的位置。切片后，将载网放入透射电子显微镜中，以确定薄层的位置并寻找适合进行断层成像的区域。在样本显微照片中，可见一个红细胞（RBC）刚刚被裂殖子侵入。在红细胞边界内，可观察到由宿主细胞来源的膜所包裹的裂殖子。在裂殖子的顶端，包围细胞的两层膜以及位于裂殖子顶端、与电子致密的蘑菇状结构相关的四层膜清晰可见。在裂殖子的细胞质内，观察到裂殖子质膜与多层囊泡之间发生融合事件。在对厚度为230纳米的薄层进行的另一项透射电镜分析中，观察到经E-64处理的成熟裂殖子的典型形态。在红细胞膜内，可见裂殖子质膜及其细胞器，如内膜复合体、极环、微线体、棒状体以及核膜。该技术最重要的部分是优化网格，以实现薄层样品的可重复且高效的制备。该技术的进一步发展将使研究人员能够观察疟原虫内的单个蛋白质分子，并确定其在疟原虫逸出过程中的作用。

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利用冷冻电子断层扫描技术观察处于冷冻水合状态神经突的原代神经元制备

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样品制备与冷冻聚焦离子束微加工 酿酒酵母 用于冷冻电子断层扫描

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冷冻电子断层扫描数据采集优化策略

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本视频方案演示了如何对病毒学样本进行扫描透射电子显微镜断层成像。为获得最佳结果，样本需通过高压冷冻及后续的冷冻置换方法进行制备。...

病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

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厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

学习使用双束扫描电子显微镜制备玻璃体生物样品薄片，用于冷冻电子断层扫描。该方法以感染恶性疟原虫的人红细胞为样本，实现高分辨率原位结构分析。

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