Name: ניתוח דפוסי תנועתיות של סטנטור במהלך ואחרי התחדשות מנגנון הפה באמצעות מעקב אחר תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: חקור ניתוח תנועתיות של Stentor coeruleus במהלך התחדשות מנגנון הפה באמצעות מיקרוסקופיה ומעקב אוטומטי. שיטה זו מאפשרת לכמת את התאוששות התפקוד בתאים חד-תאיים ולקשר בין שינויים התנהגותיים לאירועים מולקולריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי מלגת ויטמן לקריירה מוקדמת במעבדה הביולוגית הימית (JYS). אנו מודים לאוון ברנס, מיט פאטל, מלאני מלו וסקיילר וידמן על שעזרו בחלק מהניתוח הראשוני ובדיקת הקוד. אנו מודים למארק סלבודניק על הדיון וההצעות. WFM מכיר בתמיכה ממענק NIH R35 GM130327.

הערה: אוכלוסייה של כמאה תאי S. coeruleus עברו תרבית בהתאם לפרוטוקול JoVE8 שפורסם בעבר.
1. הכנה לדוגמה
<ol><li>חותכים חתיכה של יריעת ספייסר סיליקון בעובי 250 מיקרומטר (טבלת חומרים) מעט קטנה יותר הן בגובה והן ברוחב מאשר מגלשת מיקרוסקופ. באמצעות ניקוב חור בגודל 5/16 אינץ', צרו בארות עגולות. שימו לב להשארת מרווח מספיק בין בארות שכנות כדי להבטיח אטימה טובה. הערה: רווח של 3 מ"מ בין בארות שכנות נמצא מספיק. עם התרגול, ניתן למקם עשר בארות על שקופית לדוגמה אחת.</li>
	<li>יזום התחדשות של OA על ידי דגירה של התאים ב-10% סוכרוז או 2% אוריאה למשך 2 דקות (איור 1A). לאחר מכן, יש לשטוף שלוש פעמים עם בינוני טרי8. פיפטה בעדינות כעשרה סטנטורים לתוך כל באר. היזהר מהתאמת נפח הדגימה לנפח הבאר בצורה הדוקה ככל האפשר. הערה: עבור מידות הבאר המשמשות כאן, 12.5 μL של דגימה הוכנסו לכל באר.</li>
	<li>סגרו את הבארות על ידי הנמכה עדינה של פיסת כיסוי (ראו טבלת חומרים) מעל הבארות החל מקצה אחד. השתמש באובייקט צר ומעט גמיש, כגון קצה פיפטה של 10 μL, כדי ללחוץ על הכיסוי שבו הוא יוצר קשר עם יריעת הסיליקון, כדי להבטיח אטימה טובה.</li>
</ol>2. מיקרוסקופיית אור נראה בהילוך מהיר
<ol><li>הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ, והגדירו את ההגדלה לרמה הנמוכה ביותר הזמינה כך שאחת מהן תתאים היטב למסגרת בשלמותה. הערה: מתאם מצלמה 1.6x והגדלה של 1x על המטרה שימשו במיקרוסקופ עבור פרוטוקול זה.</li>
	<li>התחילו בהילוך מהיר. רכשו סרטון של 10 שניות ב-30 פריימים לשנייה מכל באר בכל נקודת זמן. אם אתם משתמשים בהתקנת מיקרוסקופ עם שלב X-Y ממונע, בצעו אוטומציה של כל קיטועי הזמן. אחרת, ודא שהמשתמש נוכח בכל נקודת זמן כדי לתרגם את הדגימה באופן ידני כדי להקליט כל באר. הערה: הימנע מלהשאיר את הדגימה מוארת בעת אי הדמיה כדי למנוע חימום והתאדות. נפחי הדגימה קטנים, וההתאדות תוביל לבועות אוויר.</li>
	<li>שמור סרטים כ- TIFF, MOV או AVI. הערה: אלה הם סוגי קבצי הווידאו הנפוצים ביותר שאינם קנייניים. בהתאם לתוכנת המיקרוסקופ הספציפית, הסרטונים עשויים לשמור כברירת מחדל לסוג קובץ קנייני, אך לאחר מכן ניתן לייצא לאחד מסוגי הקבצים הנ"ל.</li>
	<li>השתמש בגורם המרה בין פיקסל למילימטר עבור קנה מידה פיזי, ובצע כיול או השתמש בגודל פיקסל ידוע מהמצלמה שבה נעשה שימוש. כדי לכייל, קבל תמונה ברורה של שקופית כיול או סרגל ברור באותן הגדרות הגדלה כמו הסרטונים. באמצעות כל תוכנית צפייה בתמונות, ספרו את מספר הפיקסלים בין סימנים של מרחק פיזי ידוע. הערה: לדוגמה, אם התמונה של סרגל מציגה את סימן 1 מ"מ ואת סימן 2 מ"מ שיופרדו ב- 100 פיקסלים, גורם ההמרה הוא 1 מ"מ לכל 100 פיקסלים. לחלופין, כדי להפיק גורם זה מגודל הפיקסל של המצלמה, פשוט הכפל את גודל הפיקסל של המצלמה בהגדלה. לדוגמה, אם למצלמה שבה נעשה שימוש יש 3.45 μm פיקסלים, וההגדלה שבה נעשה שימוש הייתה 1.6x, אז ההמרה היא 3.45 μm * 1.6 = 5.52 μm לכל פיקסל אחד.</li>
</ol>3. מעקב אחר תאים
<ol><li>הורד את שני הסקריפטים, TrackCells.m ו- CleanTraces.m, למיקום קל לזכירה במחשב. אם סרטוני הנתונים אינם נמצאים כבר במחשב זה, העבר אותם למחשב זה. הערה: סרטוני הנתונים והסקריפטים אינם צריכים להיות באותה תיקיה.</li>
	<li>ארגן סרטוני נתונים בתיקיות, אחת לכל נקודת זמן. השתמש תחילה בסקריפט TrackCells.m כדי לבצע מעקב אוטומטי אחר תאים בסרטוני הנתונים. פתח את TrackCells.m והפעל את הסקריפט.</li>
	<li>בחר הוסף לנתיב אם תתבקש על-ידי חלון קופץ., מה שבדרך כלל יקרה רק כאשר קובץ ה- Script מופעל בפעם הראשונה מתיקיה נתונה. כשתתבקש, בחר סרטון נתונים אחד או יותר כדי ליזום מעקב, נווט אל סרטוני הנתונים (סעיף 2). בחר קבצי וידאו מרובים באמצעות לחיצת shift, לחיצה על שליטה או על-ידי לחיצה ממושכת על לחצן העכבר השמאלי בעת מעבר על הקבצים כדי לסמן אותם.</li>
	<li>לאחר שתסתפק ברשימת הקבצים בשם הקובץ: בתיבה בתחתית חלון הבקשה, לחץ על פתח. בצע תחילה הרצת בדיקה בסרטון אחד כדי לוודא שכל הפרמטרים מוגדרים כהלכה (ראה דיון בהמשך). הערה: סקריפט זה ייצור כעת תיקיה עבור כל קובץ וידאו שנבחר. לאחר מכן הוא יכתוב בתיקייה זו כל פריים של הסרטון כקובץ .jpg וקובץ בשם position_estimates.mat, המכיל את כל העקבות שנמצאו בסרטון. בהתאם לגודל הסרטונים, מספר הסרטונים ומהירות המחשב, סקריפט זה יכול להימשך שעות.</li>
</ol>4. אימות עקבות
<ol><li>ודא שהשלבים המתוארים בסעיף 3 בוצעו כהלכה על-ידי בדיקה שאין הודעות שגיאה לפני שתמשיך. השתמש בסקריפט CleanTraces.m כדי לדחות באופן ידני עקבות חריגים או כוזבים. פתח את CleanTraces.m בחלון העורך של MATLAB על ידי לחיצה כפולה על הקובץ.</li>
	<li>בהודעה בחר פלט תיקיית נתונים על-ידי TrackCells.m. יהיה לו שם זהה לזה של קובץ הווידאו, נווט לאחת התיקיות שנוצרו כמתואר בסעיף 3. בחר תיקיה אחת בלבד. הערה: קובץ Script זה יציג כעת את המעקבים בזה אחר זה בחלון קופץ. הם מכוסים על מסגרת הסרטון שבה מתחיל העקבה, בירוק, ועל מסגרת הסרטון שבה מסתיים העקבה, במג'נטה. לכן, עקבות תקפים צריכים לקשר בין תא ירוק לתא מג'נטה.</li>
	<li>כשתתבקש, הזן 1 כדי לשמור על המעקב ו - 0 כדי לדחות את המעקב. הקש Enter כדי לעבור למעקב הבא. הערה: עקבות חדשים ימשיכו להופיע עד שלא יהיו עקבות נוספים, או שישים הראשונים יוצגו. כאשר תהליך זה יושלם, הסקריפט ייצור באופן אוטומטי תיקיה בשם CLEAN TRACES לשמירת הפלטים ויציג את כל העקבות הנותרים על גבי המסגרת הראשונה של הסרטון (איור 1B). תמונה זו נשמרת באופן אוטומטי כ-LabeledTraces.png לעיון עתידי. כל העקבות שהמשתמש בחר לשמור יישמרו בקובץ clean_traces.mat.</li>
	<li>השלם שלב זה עבור כל הסרטונים בנקודת זמן אחת לפני שתמשיך. הערה: עבור הנתונים בכתב יד זה, נרכש סרטון אחד עבור כל באר בכל נקודת זמן, עבור סך של עשרה סרטונים בכל נקודת זמן.</li>
</ol>5. תצוגה חזותית של נתונים
הערה: כדי להשוות באופן חזותי את התנועתיות של אוכלוסיית התאים כולה על פני נקודות זמן שונות, כל העקבות מסעיף 4 תורגמו כדי להתחיל במקור וליצור תרשים תזוזה רדיאלי אחד לעומת תרשים זמן עבור כל נקודת זמן (איור 1C-F, ראו איור משלים S1 עבור כל נקודות הזמן).
<ol><li>התחילו בהורדת התסריט שכותרתו ספגטיPlots.m. פתח והפעל את הסקריפט. כאשר חלון דפדפן של קובץ חלון קופץ עם תיקיית הזמן 'בחר' בקשה המכילה נתונים טובים (clean_traces.mat) לגרף, נווט אל התיקיה של אחת מנקודות הזמן. שים לב שתיקיה זו צריכה להכיל בתוכה תיקיה עבור כל אחד מסרטוני הווידאו שנותחו.</li>
	<li>כשתתבקש כיול: מהו מספר הפיקסלים למילימטר?, הקלד את ערך הכיול שנמצא בשלב 2.4 והקש Enter. הערה: התסריט ישלב כעת את העקבות מכל הסרטונים שנותחו בנקודת זמן זו לעלילה אחת (איור 1C-F). עיגולים מנוקדים קלושים בחלקה מצביעים על תזוזות רדיאליות של 1, 2, 3 ו-4 מ"מ.</li>
	<li>התאם צירים של העלילה לפי הצורך על ידי שינוי שורה 55 של הסקריפט, אשר כברירת מחדל, מוגדר rr = 4 עבור כולל רדיוס של עד 4 מ"מ. שמור את העלילה.</li>
</ol>

<ol><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration%3B+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTartar%2C+V+%22The+Biology+of+Stentor%22">The Biology of Stentor</a>. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li>
<li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861(2014).</li>
<li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167(2020).</li>
<li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759(2018).</li>
<li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell%2C+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788(2017).</li>
<li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

קיימים כיום אלגוריתמים רבים למעקב אחר חלקיקים ותאים, חלקם חופשיים לחלוטין. עלות וידידותיות למשתמש הן לעתים קרובות פשרות הדורשות פשרה. בנוסף, רבות מתוכניות המעקב הקיימות אחר תאים נועדו לעקוב אחר תנועת זחילה איטית של תאי תרבית רקמה, במקום תנועת השחייה המהירה של סטנטור, שמסתובבת תוך כדי שחייה ויכולה לעבור שינויי כיוון פתאומיים. לאחר בדיקת רבות מהאפשרויות הללו, הפרוטוקול המוצג כאן נועד להיות פתרון חד פעמי שיעבור את כל הדרך מרכישת נתונים ועד להדמיית נתונים באמצעות ציוד בעלות נמוכה בלבד וחבילת תוכנה מדעית אחת (<strong...

Stentor coeruleus (Stentor) הוא אורגניזם מודל ידוע ששימש לחקר התחדשות חד-תאית בשל גודלו הגדול, יכולתו לעמוד במספר טכניקות מיקרו-כירורגיות וקלות התרבות בסביבת מעבדהשל 1,2,3. מחקרי התחדשות מוקדמים התמקדו בתכונה הגדולה והמורפולוגית המורפולוגית הגדולה ביותר בסטנטור – ה-OA – אשר נשפכת לחלוטין על הלם כימי 4,5,6. החלפת דה נובו של OA אבוד מתחילה עם הופעתה של רצועת ממברנה חדשה – מערך של ריסונים הנעים בהדרגה לכיוון החלק הקדמי של התא לפני שהם יוצרים OA פונקציונלי על פני שמונה שלבים מורפולוגיים3. שלבים אלה נצפו ברצף, ללא קשר לטמפרטורה, ומספקים נקודת ייחוס אוניברסלית כמעט לכל המחקרים5.
ניתוח מכניסטי של התחדשות סטנטור דורש כלים למדידת תזמון ההתחדשות שהם חזקים ופשוטים מספיק כדי להיות מיושמים על דגימות מרובות כחלק ממסך כימי או מולקולרי. השיטה הסטנדרטית לביצוע בדיקה מבוססת תאים היא הדמיה, במקרה זה, הדמיה של היווצרות OA חדש במהלך התחדשות. עם זאת, מבחנים מבוססי הדמיה כאלה יעילים ביותר כאשר המבנה המתחדש מכיל רכיבים מולקולריים מובחנים שיכולים לשמש כסמנים, כך שהם יזוהו בקלות בתמונה פלואורסצנטית. במקרה של Stentor OA, הרכיבים הידועים (ריסונים, גופים בסיסיים) נמצאים גם על שאר פני השטח של התא; לכן, הכרה בשיקום של OA לא יכולה להיות מושגת פשוט על ידי חיפוש נוכחות או היעדר של רכיב.
במקום זאת, תידרש צורה כלשהי של זיהוי צורה כדי לזהות OA, וזה עלול להיות מאתגר מאוד בהתחשב בעובדה שתאי סטנטור לעתים קרובות משנים צורה באמצעות תהליך כיווץ מהיר. מאמר זה מציג בדיקה חלופית להתחדשות המסתמכת על פעילות תנועתית של הגוף וריסוני OA. כאשר ה- OA מתחדש, הריסונים החדשים שנוצרו עוברים שינויים הניתנים לשחזור במיקום ובפעילות, אשר בתורם משפיעים על תנועתיות השחייה של התא. על ידי ניתוח תנועתיות, ניתן לבצע בדיקה עבור "התחדשות פונקציונלית" המכמתת התחדשות על ידי כימות הפונקציה של המבנים המתחדשים. ניתוח קודם של תפקוד Stentor ciliary במהלך התחדשות השתמש בוולוצימטריה של תמונת חלקיקים, בשילוב עם חרוזי עקיבה שנוספו למדיה החיצונית, כדי לבחון שינויים בתבנית הזרימה בשלבים שונים של התחדשות7; עם זאת, גישה זו דורשת הדמיה מייגעת של תאים בודדים ושדות הזרימה הקשורים אליהם, בזה אחר זה.
על ידי שימוש בתנועת התא עצמו כפרוקסי לזרימה שנוצרה על ידי ריסונים, ניתן יהיה לנתח מספר גדול יותר של תאים במקביל, באמצעות מערכות הדמיה ברזולוציה נמוכה התואמות לפלטפורמות סינון בתפוקה גבוהה. בדיקה זו יכולה, באופן עקרוני, לשמש לחקר התפתחות והתחדשות תפקודית באורגניזמים שוחים אחרים בקנה מידה של מאות מיקרונים עד מילימטרים. סעיף 1 של הפרוטוקול מתאר את בנייתה של שקופית דגימה רב-תחומית, המאפשרת הדמיה בתפוקה גבוהה של אוכלוסיית תאים במשך עד יום שלם. מפורטים כיצד להתאים את עצמם לשימוש עם סוגי תאים אחרים. חלק 2 של הפרוטוקול מכסה את רכישת נתוני הווידאו עבור בדיקה זו, אשר ניתן לבצע על מיקרוסקופ דיסקציה עם מצלמת רפלקס דיגיטלית עם עדשה אחת. סעיף 3 של הפרוטוקול מספק מעבר של מעקב אחר תאים וחישוב מהירות התא באמצעות קוד MATLAB (מידע משלים). סעיף 4 של הפרוטוקול מסביר כיצד להפוך את התוצאות המספריות לחלקות כפי שמוצג באיור 1C-F ובאיור 2C לפענוח קל של התוצאות.

<table><tbody><tr><td>יריעת סיליקון בעובי 0.25 מ"מ</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CWS-S-0.25</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 מ"מ, #1.5 כיסוי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC1034527</td><td>כפי שצוין בדיון, ניתן להשתמש בזכוכית כיסוי קטנה יותר אם פחות בארות דגימה מונחות על שקופית אחת.</td></tr><tr><td>מצלמת</td><td></td><td></td> CCD <td>השתמשנו ב-Nikon D750</td></tr><tr><td>Chlamydomonas 137c WT</td><td>strain Chlamydomonas Resource Center</td><td>CC-125</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATHWORKS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB ארגז כלים לעיבוד תמונה</td><td>MATHWORKS</td><td></td><td>דרוש עבור TrackCells.m ו-CleanTraces.m</td></tr></tbody></table>

ניתוח דפוסי תנועתיות של סטנטור במהלך ואחרי התחדשות מנגנון הפה באמצעות מעקב אחר תאים

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus הוא אורגניזם מודל ידוע לחקר ההתחדשות החד-תאית. ניתוח תעתיק של תאים בודדים גילה מאות גנים – רבים מהם אינם קשורים למנגנון הפה (OA) – המווסתים באופן דיפרנציאלי בשלבים לאורך תהליך ההתחדשות. ההשערה הייתה כי ארגון מחדש מערכתי זה וגיוס משאבים תאיים לקראת צמיחה של OA חדש יובילו לשינויים נצפים בתנועה ובהתנהגות המתאימים בזמן לשלבים של ביטוי גנים דיפרנציאליים. עם זאת, המורכבות המורפולוגית של S. coeruleus חייבה פיתוח של מבחן כדי ללכוד את הסטטיסטיקה ואת ציר הזמן. סקריפט מותאם אישית שימש למעקב אחר תאים בסרטונים קצרים, וסטטיסטיקות נאספו על פני אוכלוסייה גדולה (N ~ 100). עם אובדן ה- OA, S. coeruleus מאבד בתחילה את היכולת לתנועה מכוונת; ואז מתחיל ב~ 4 שעות, הוא מציג ירידה משמעותית במהירות עד ~ 8 שעות. בדיקה זו מספקת כלי שימושי לסינון של פנוטיפים של תנועתיות וניתן להתאים אותה לחקירת אורגניזמים אחרים.

מטרתו של מבחן זה היא לכמת את השינוי ההדרגתי של דפוסי התנועה ואת העלייה המדורגת במהירות התנועה מתאים בתוך אוכלוסיית סטנטור גדולה (N ~ 100) המתחדשת. כדי לסייע בפרשנות התוצאות, הקוד המותאם אישית הכלול בפרוטוקול זה יוצר שני סוגים של חלקות: שכבה של כל עקבות תנועת התאים בסדרת נתוני וידאו (איור 1C-F ואיור S1), וחלקה של מהירות שחייה לפי שעה מאז תחילת ההתחדשות (איור 2C). אוכלוסייה של סטנטור, שמתחדשת כרג...

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון תנועתיות והתנהגות של אוכלוסייה של תאים בגודל של מאה מיקרון עד מילימטר באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר ומעקב אחר תאים. בדיקה זו מגלה כי Stentor coeruleus עובר דרך ארבעה שלבים שונים מבחינה התנהגותית כאשר הוא מחדש מנגנון אוראלי אבוד.

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Stentor coeruleus משמש זה מכבר כאורגניזם מודל להבנת התחדשות חד-תאית. בעוד שציר הזמן להתחדשות מורפולוגית חזותית ידוע, ציר הזמן להתחדשות תפקודית נותר לא ידוע. בדיקה זו עוקבת אחר התנועתיות של אוכלוסיית המרכז העוברת התחדשות מסונכרנת כך שניתן לכמת את התאוששות תפקוד האובדן.ניתן להתאים אותו לשימוש עם סוגי תאים אחרים. היעדר חותם מאובטח של תא ההדמיה יגרום לדליפת בארות זו לתוך זו או להיווצרות בועות אוויר בתוך הבארות. עבור חוקרים שאינם מכירים את השימוש במרווחי סיליקון אנו ממליצים בחום להכניס PSW או מדיום נקי אחר לתוך כל אחת מהבארות כדי לבדוק אם יש דליפה לפני השימוש.בניית תאי המדגם קלה יותר להצגה מאשר לתיאור מילולי. וכך גם התהליך לחילוץ דפוסי תנועתיות מנתוני הווידאו שנרכשו. כדי להתחיל, חותכים חתיכה של יריעת ספייסר סיליקון בעובי 250 מיקרומטר מעט קטנה יותר הן בגובה והן ברוחב מאשר שקופית מיקרוסקופ.השתמש באגרוף שלם כדי ליצור בארות עגולות המשאירות מספיק מקום בין בארות שכנות כדי להבטיח אטימה טובה. ליזום התחדשות של מנגנון הפה על ידי דגירה של תאי stentor coeruleus ב 10% סוכרוז או 2% אוריה במשך שתי דקות. לאחר מכן יש לשטוף שלוש פעמים עם מדיום טרי.בעדינות פיפטה כ 10 stentor לתוך כל באר. הקפדה על התאמת נפח הדגימה לנפח הבאר קרוב ככל האפשר. סגרו את הבארות על ידי הנמכה עדינה של פיסת זכוכית כיסוי מעל הבארות החל מקצה אחד.השתמש באובייקט צר ומעט גמיש, כגון קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי ללחוץ על זכוכית הכיסוי במקום שבו הוא יוצר קשר עם יריעת הסיליקון כדי להבטיח אטימה טובה. מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ ומניחים את המיקרוסקופ להגדלה הנמוכה ביותר הזמינה כך שאחד מהם יתאים היטב למסגרת. התחילו את קיטועי הזמן ורכשו סרטון של עשר שניות בקצב של 30 פריימים לשנייה מכל באר בכל נקודת זמן.כדי לכייל, קבל תמונה ברורה של שקופית כיול או סרגל ברור באותן הגדרות הגדלה כמו הסרטונים. באמצעות כל תוכנית צפייה בתמונות, ספרו את מספר הפיקסלים בין סימנים של מרחק פיזי ידוע. הורד את שני הסקריפטים, תאי המעקב והמעקבות הנקיים למיקום קל לזכירה במחשב והעבר את סרטוני הנתונים גם למחשב זה.ארגן את סרטוני הנתונים בתיקיות. אחד לכל נקודת זמן. השתמש בתאי המסלול של Script כדי לבצע מעקב אוטומטי אחר תאים בסרטוני הנתונים על-ידי פתיחת תאי רצועה והפעלת הסקריפט בחר הוסף לנתיב "אם תתבקש על-ידי חלון קופץ אשר בדרך כלל יקרה רק כאשר הסקריפט מופעל בפעם הראשונה מתיקייה נתונה.כשתתבקש, בחר סרטון נתונים אחד או יותר כדי להתחיל במעקב. נווט אל סרטוני הנתונים ולאחר שהיית מרוצה מרשימת הקבצים לחץ על open"כדי לדחות באופן ידני עקבות חריגים או כוזבים, פתח עקבות נקיים בחלון עורך MATLAB על ידי לחיצה כפולה על הקובץ. בבקשת הבקשה בחר פלט תיקיית נתונים לפי תאי מעקב.נווט אל אחת התיקיות שנוצרו ובחר אותה. כשתתבקש, הזן אחד כדי לשמור על המעקב ואפס כדי לדחות את המעקב. לאחר מכן לחץ על Enter כדי לעבור לעקבה הבאה.התחל על ידי הורדת התסריט שכותרתו עלילות ספגטי. פתח והפעל את הסקריפט. כאשר חלון דפדפן הקבצים צץ עם הבקשה, בחר תיקיה לפתיחה.נווט אל התיקיה של אחת מנקודות הזמן. כאשר מתבקש, כיול, מהו מספר הפיקסלים למילימטר? הקלד את ערך הכיול והקש Enter.התאם את צירי העלילה לפי הצורך על ידי שינוי שורה 55 של הסקריפט, אשר כברירת מחדל מוגדר ל- RR שווה לארבעה. עבור הכללת רדיוס של עד ארבעה מילימטרים. שמור את העלילה.התוצאות מראות את התנועתיות הקולקטיבית של אוכלוסיית תאי הסטנטור בשעתיים, שלוש, שבע ושמונה שעות לתוך תהליך התחדשות המנגנון האוראלי. חלקות אלה מראות הן את הגידול הצפוי במספר הפרטים תנועתיים והן את הגידול הגדול פי ארבעה בטווח התאים תנועתיים ביותר באוכלוסייה. תאי השחייה המהירים ביותר, אם הם מתחילים קרוב לקצה, מוגבלים משחייה לחלוטין בקו ישר וטווח התנועה שלהם נראה קטן יותר.תאי המערכת סווגו לשלוש קטגוריות נפרדות, לא תנועתיים ללא אחיזה נראית לעין במהירות, לא תנועתיים עם אחיזה נראית מהר, ותנועתית. התוצאה הראתה היסטוגרמה מוערמת המסכמת את ספירת התאים היחסית בקטגוריות אלה כפונקציה שלנו להתחדשות. בתקופות מאוחרות יותר, מספר משמעותי של תאים נמצאו במושבות עם צום אחיזה נראה לעין, מה שמרמז מאוד על כך שהם חקרו את הסביבה והתחברו באופן מועדף ליד אחרים מסוגם.חשוב לבחור את מידות הבאר לדוגמה שעובדות היטב עבור stentor coeruleus שגודלם כמילימטר אחד. זה כולל עובי ספייסר סיליקון בקוטר 5/16 אינץ', ו-10 תאים לכל באר. יש להתאים מספרים אלה בעת התאמת פרוטוקול זה לסוגי תאים אחרים.ניתן לבצע בדיקה זו בשילוב עם RNA-I כדי לחקור ולהשוות את ההתחדשות של פנוטיפים שונים של סטנטור.

analysis-motility-patterns-stentor-during-after-oral-apparatus

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

הערכת תנועתיות המעי במעי הגס שפן ניסיונות דיסטלי עם צג תנועתיות מערכת העיכול (GIMM) היא גישה ישירה ופשוטה ללמוד להעריך כמותית הנעה תנועתיות במערכת העיכול.

צג תנועתיות מערכת העיכול (GIMM)

זמן לשגות הדמיה של התרבות רקמת 3D מאפשר ללמוד התנהגות הנדידה של תאים בודדים שמקורם רוממות ganglionic בתגובה תמצית חלבון מופרדים מן קליפת המוח.

התנהגות הנדידה של תאים שנוצר תרבויות רוממות Ganglionic

שיטה אמינה לחקור תא השיער החיצוניים (OHC) תגובות ניעתי, כולל electromotility, תנועתיות איטית כיפוף, הוא תיאר. תנועתיות OHC הוא שהושרו על ידי גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין, ואת השיטה מנצלת את הקלטת במהירות גבוהה התמונה, מבוססי LED תאורה, הדור האחרון התמונה תוכנת ניתוח.

חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעתיד.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

הריסנית הענקית Stentor coeruleus היא מערכת קלאסית לחקר התחדשות וריפוי פצעים בתאים בודדים. על ידי הדמיית תאי סטנטור בו זמנית בהגדלה נמוכה וגבוהה ניתן למדוד זרימות ציטופלזמיות לפני, במהלך ואחרי פציעה.

הדמיה של זרימה ציטופלזמית במהלך ריפוי פצע של תא בודד ב-Stentor coeruleus

טכניקות הקלטת וידאו ומיפוי מרחבי-זמני (STmap) הזמינות לאחרונה מאפשרות לדמיין ולכמת הן דפוסי התפשטות והן ערבוב של תנועתיות המעיים. מטרת פרוטוקול זה היא להסביר את היצירה והניתוח של STmaps באמצעות מערכת ניטור תנועתיות מערכת העיכול (GIMM).

מיפוי Spatiotemporal של תנועתיות ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תכשירים מהמעיים

ממצאים אחרונים מצביעים על כך שמנועי דגל חיידקים חשים מגוון אותות סביבתיים ומעצבים מחדש בתגובה. מבחני החרוזים שנדונו כאן צפויים לעזור להסביר את תפקיד העיצוב מחדש בהסתגלות התאים לגורמי לחץ סביבתיים.

אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor

Ciliate ענק, Stentor coeruleus, היא מערכת מצויינת ללמוד התחדשות ואף ריפוי פצעים. אנו מציגים את הליכי הקמת Stentor תרביות תאים תאים בודדים או שברי תאים, גרימת התחדשות על ידי חיתוך תאים, מבחינה כימית גרימת לרגנרציה של להקת membranellar, המנגנון אוראלי, הדמיה, וניתוח של תא התחדשות.

שיטות המחקר של התחדשות ב- Stentor

חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות של תאים מזנכימליים הפליאטוניים של עכבר ראשוניים להדמיה של צמיחה דו-ממדית (2D) ובגידות לתיקון פצעים. אנו מספקים גם את המתודולוגיה לניתוח נתוני ההדמיה של זמן לשגות כדי לקבוע היווצרות זרם תאים תנועתיות כיוונית.

בידוד והדמיה בזמן-לשגות של תאי מזנשים הפליאטל העוברי הראשי של העכבר כדי לנתח תכונות תנועה קולקטיבית

חקור ניתוח תנועתיות של Stentor coeruleus במהלך התחדשות מנגנון הפה באמצעות מיקרוסקופיה ומעקב אוטומטי. שיטה זו מאפשרת לכמת את התאוששות התפקוד בתאים חד-תאיים ולקשר בין שינויים התנהגותיים לאירועים מולקולריים.

ניתוח דפוסי תנועתיות של סטנטור במהלך ואחרי התחדשות מנגנון הפה באמצעות מעקב אחר תאים

גלה סרטונים נוספים