인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화
2021년 3월 31일
여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.
이 프로토콜은 인간 혈구 내피 세포의 잘 특성화된 집단을 생성하는 방법을 상세히 설명한다. 이들 세포는 분자 조절 및 내피에서 조혈로의 전이를 연구하는데 활용될 수 있다. 인간 배아 줄기 세포를 4 일 동안 배양하여 원시 내피 세포로 분화시키는 것으로 시작하십시오.
5 일째에 세포 위의 배지를 흡인하십시오. 그런 다음 웰당 DMEM/F-12 1밀리리터로 세포를 부드럽게 씻습니다. 웰당 새로 준비된 조혈 내피 세포 분화 배지 1밀리리터를 추가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
6일째 및 7일째에 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 동성 내피 세포 분화 배지 1밀리리터로 교체하고 세포를 추가로 24시간 동안 배양합니다. 여덟 번째 날. 세포를 분리하고 세척 한 후 얼음 위의 미세 원심 분리 튜브로 골고루 나누고 각각 밀리리터 당 1 배 10에서 5 번째 세포의 밀도로 최소 600 마이크로 리터의 세포를 포함합니다.
세포를 포함하는 튜브에 항체를 적절하게 추가하고 빛으로부터 보호 된 얼음에서 30 분 동안 배양하십시오. 세포를 1000배 G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화한다. 상청액을 제거하고 600 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 분류 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다.
5 밀리리터 FACS 튜브의 메쉬 필터 캡을 통해 샘플을 변형시키고 즉각적인 세포 분류를 위해 빛으로부터 보호 된 얼음에 세포를 보관하십시오. FACS로 혈구 내피 세포를 분리하려면 먼저 CD45 음성 세포 집단을 게이트하십시오. 그런 다음 CD45 음성 집단 내에서 CD31 양성 세포를 게이트합니다.
다음으로 CD31 양성 집단 내에서 VE- 카드 헤린 음성 세포 집단에 대한 게이트. 그런 다음 VE- 카드 헤린 음성 집단 내에서 c- 키트 양성 세포에 대한 게이트. c-Kit 양성 집단에서 CD34 양성 세포 집단을 게이트합니다.
마지막으로 CD34 양성 세포 집단에서 KDR 양성 세포를 식별하고 수집합니다. 조혈 전구 세포의 성장을 위해 제조된 메틸셀룰로오스 기반 배지에 혈구 내피 세포를 파종한 후, 콜로니 형성 단위-적혈구 콜로니 및 블라스트 형성 단위-적혈구 콜로니가 8일째에 계산됩니다. 집락 형성 단위-과립구-대 식세포 및 집락 형성 단위-과립구, 적혈구, 대 식세포 및 거대 세포.
다능성 조혈 전구 콜로니는 14일째에 계산됩니다. 1000개의 혈성 내피 세포가 도금될 때마다 약 20개의 콜로니 형성 단위가 생성됩니다. 내피 세포 형태를 가진 세포도 배양에서 볼 수 있습니다.
이들은 단일 세포 수준에서 다중 계통 조혈 전구 세포를 생성하는 혈구 내피 세포입니다. 이 프로토콜은 약 1주일 내에 인간 혈구 내피 세포를 생성할 수 있는 2D 혈청 및 쥐 피더가 없는 배양 시스템입니다.
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개요
본 논문은 인간 배아 줄기세포로부터 약 1주일 만에 조혈 내피세포를 유도하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 연구자가 특성이 잘 정의된 조혈 내피세포 집단을 생성할 수 있게 하며, 이는 내피-조혈 전환 연구에 필수적일 뿐만 아니라 재생 의학 및 혈액 제제 생산 분야에서도 활용 가능성이 높습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 줄기세포 생물학
- 혈관 생물학
- 조혈 작용
- 조직 공학
배경
- 혈관은 조직 기능에 필수적이며 혈관 내피세포로 덮여 있습니다.
- 조혈 내피세포는 발생 과정 중에 조혈 줄기세포 및 전구세포를 생성하는 특수한 하위 유형입니다.
- 이러한 세포를 인비트로(in vitro)에서 생성하는 것은 혈구 세포의 발달 연구와 잠재적인 치료 적용을 위해 가치가 있습니다.
- 기존의 내피세포 유도 프로토콜로는 인간 줄기세포로부터 특성이 잘 규명된 조혈 내피세포를 얻을 수 없습니다.
연구 목적
- 인간 배아줄기세포로부터 조혈 내피세포를 생성하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 확립한다.
- 분자 조절 및 내피-조혈 전환(endothelial-to-hematopoietic transition)의 인 비트로(in vitro) 연구를 가능하게 한다.
- 후속 응용 연구에 적합한 피더-프리(feeder-free) 및 무혈청 시스템을 제공한다.
사용된 방법
- 인간 배아줄기세포 배양 및 8일간의 단계적 분화.
- 특정 성장 인자와 소분자(예: GSK3β 억제제, bFGF, BMP4, VEGF-A, 레티노산)를 이용한 중배엽 및 내피 세포 계보 유도.
- 표면 마커(CD45-, CD31+, VE-cadherin-, c-Kit+, CD34+, KDR+)를 기반으로 한 조혈 내피 세포의 순차적 게이팅 및 분리를 위한 유세포 분석(FACS).
- 조혈 잠재력을 평가하기 위해 메틸셀룰로오스 기반 배지에서 콜로니 형성 분석을 통한 기능 평가.
주요 결과
- 본 프로토콜을 통해 일주일 이내에 정의된 혈구조성 내피세포 집단을 얻을 수 있습니다.
- 혈구조성 내피세포 1000개당 약 20개의 콜로니 형성 단위가 생성되며, 이는 강력한 조혈 잠재력을 나타냅니다.
- 적혈구계 및 다능성 조혈 전구세포 콜로니가 모두 관찰됩니다.
- 배양 과정에서 내피세포의 형태가 유지되어 세포 정체성이 확인됩니다.
결론
- 이 피더-프리(feeder-free), 무혈청 프로토콜은 배아줄기세포로부터 인간 조혈 내피세포를 효율적으로 생성합니다.
- 이 방법은 내피-조혈 전환 및 분자 조절에 대한 인비트로(in vitro) 연구를 용이하게 합니다.
- 이는 잠재적인 엑스비보(ex vivo) 혈액 제제 생성 플랫폼을 제공하며, 인간 공여자에 대한 의존도를 낮춰줍니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
인간 다능성 줄기세포로부터 조혈 내피세포의 지향성 분화는 조혈 발달 모델링 및 체외 혈액 계통 생성의 결정적인 병목 현상을 해결합니다. 이러한 기술은 내피-조혈 전환의 기전적 위험 요소를 제거하며, 초기 단계의 세포 치료 및 재생 의학 파이프라인에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다. 본 프로토콜의 피더 프리(feeder-free) 및 무혈청 설계는 기업 R&D 포트폴리오를 위한 재현성과 확장성을 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 내피-조혈 전환을 조절하는 분자 경로의 분석을 가능하게 합니다.
- 혈액 계통 분화에 영향을 미치는 인자들에 대한 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 조혈 발달 단계의 후보 타겟에 대한 예측적 리스크 감소를 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 기능 분석을 위해 표준화되고 특성이 잘 규명된 세포 집단을 제공합니다.
- 정해진 전구세포로부터의 조혈 콜로니 형성의 정량적 평가를 가능하게 합니다.
- 내피 또는 조혈 운명에 영향을 미치는 조절 인자의 재현성 있는 스크리닝을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련 조혈 결함을 in vitro에서 모델링하기 위한 플랫폼을 구축합니다.
- 혈구 생성 전략의 발견부터 전임상 검증까지의 연속성을 가능하게 합니다.
- 리스크가 조정된 세포 기반 치료 개념의 진전을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 프로토콜은 기전 연구 및 기능 분석을 위해 혈구조성 내피세포(hemogenic endothelial cells)를 안정적으로 생성하고 분리할 수 있게 함으로써, 발견 단계부터 전임상 단계까지의 연속적인 연구 과정에 통합될 수 있습니다.
- 발견 생물학: 혈액 계통 출현의 분자적 조절에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 비교 분석을 위해 재현 가능하고 정량적인 콜로니 형성 결과물을 제공합니다.
- 분석: 객관적인 판독을 위해 유세포 분석 기반의 게이팅 및 콜로니 정량화를 제공합니다.
- 중개 연구: in vitro 모델링과 조혈 잠재력의 전임상 평가 사이를 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 줄기세포주 및 질환 모델에 적용 가능한 확장 가능한 feeder-free 시스템을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 조혈 계통 모델링 및 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 세포 분화 워크플로우의 표준화, 재현성 및 확장성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 세포 치료제 및 재생 의학 프로그램의 추진/중단(go/no-go) 의사결정을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 초기 단계 세포 기반 치료제 후보 물질의 리스크 조정 우선순위 선정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 인간 다능성 줄기세포 배양 및 분화 프로토콜에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 다중 파라미터 세포 분류를 위한 유세포 분석 장비의 사용이 가능해야 합니다.
- 게이팅 전략 및 콜로니 정량화에 대한 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 프로토콜 최적화를 통해 다양한 인간 줄기세포주에 적용 가능합니다.
- 검증된 항체 패널 및 메틸셀룰로오스 기반의 기능 분석법에 의존합니다.
