Name: 시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 학습하세요 시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 활성 분석 방법으로 E2-E3 효소 협력과 기질 선택성을 평가하는 기술입니다. 이 프로토콜은 재조합 단백질을 사용하여 진핵생물 단백질의 유비퀴틸화를 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 원고에 대한 비판적 인 토론과 유용한 조언을 우리 실험실의 회원들에게 감사드립니다. 크기 제한으로 인해 귀중한 기여를 인용하지 않은 것에 대해 사과드립니다. 이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구재단)-SFB 1218 - 프로제크넘 269925409 및 우수 EXC 229/CECAD 클러스터에서 TH까지 지원된다. 이 작품은 독일의 우수 전략인 EXC 2030 - 390661388 및 SFB 1218 - Projektnumber 269925409 T.H에 대한 독일의 우수 전략에 따라 도이치 포르스충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구 재단)의 지원을 받았습니다. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 T.H. gefördert.

1. 버퍼 및 시약 준비
참고: 실험실에서 수동으로 제조된 버퍼 및 시약은 다음과 같습니다. 프로토콜에 사용된 다른 모든 버퍼 및 시약은 다른 소스에서 구입하여 제조업체의 지침에 따라 사용되었습니다.
<ol><li>10배 인산염 완충식식염(10배 PBS)을 준비한다. 이를 위해 염화나트륨 1.37M 나트륨(NaCl), 염화27m 칼륨(KCl), 디나트륨-수소-인산염 이수제 80mMM(Na2HPO4.2 H2O),20mMMMM의 칼륨-디수소 인산염(KH2PO4)2l(2PO 4) 2L를 2L로 혼합한다. 10x PBS를 오토클레이브하고 ddH2O로 1배 PBS 솔루션을 준비합니다.<ol>
<li>오토클레이빙은 121°C 및 98.9kPa에서 15분 동안 수행됩니다. 참고: 자동 연결은 모든 버퍼 및 솔루션에 대해 이러한 조건에서 수행됩니다. 달리 표시되지 않으면 솔루션이 실온(RT)에 저장됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS-Tween(PBS-T) 솔루션 1L을 1x PBS1L에 0.1% 펜을 추가하여 준비합니다.</li>
	<li>ddH2O. Aliquot L-lysine에서 L-리신을 1mL 부분으로 용해시켜 0.5 M L-리신 스톡 용액의 10mL를 준비하고 추가 사용전까지 -20°C에 보관하십시오. 참고: L-리신은 반복적으로 동결및 해동할 수 있습니다.</li>
	<li>ddH 2O의 200mL에서 EDTA를 용해시켜 0.25 M 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA) 용액을 준비한다.<ol>
<li>수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH를 8.0으로 조정합니다.</li>
		<li>ddH2O로 볼륨을 250mL로 조정합니다.</li>
		<li>솔루션을 자동 복제합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>200 μL 알리쿼트에서 -20°C에서 ddH2O. 스토어에서 BSA를 용해시켜 20 mg/mL 소 소 세럼 알부민(BSA) 용액의 10mL를 준비한다. 참고 : BSA는 반복적으로 동결 및 해동 할 수 있습니다.</li>
	<li>2-(N-morpholino)에 탄 설포닉산(MES)의 러닝 버퍼는 50mM MES, 50m 트라이베이스, 3.47m 나트륨 도데킬 황산(SDS), ddH2O의0.9L로 1.03mM EDTA를 준비한다. 제대로 혼합 한 후 볼륨을 1 L로 조정합니다.<ol>
<li>1x 버퍼의 pH는 7.6입니다. pH를 산이나 염기로 조정하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1x PBS-T에서 10g의 분유를 용해하여 블로킹 용액(5% 우유)을 200mL준비한다. 블로킹 용액을 최대 1주일 동안 4°C에 저장합니다.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 1 L의전송 버퍼(재료 표 참조)를 준비합니다.</li>
	<li>125m MM Tris 베이스, 4% SDS, 4% 글리세롤, 0.03% 브로모페놀 블루, 50 μL/mL의 β-메르카포에탄올50mL/mL를 50mL ddH2O. 알리쿼트1mL 부로, 1mL 부당에 2x SDS 샘플 버퍼를 준비하고 -20°C에 저장합니다.</li>
</ol>2. 시험관 내 자동 유비쿼터션 분석
<ol><li>분석 준비 및 실행<ol>
<li>단백질의 주어진 어과 단백질 농도를 기반으로 반응당 필요한 각 시약의 부피를 계산합니다. 자동 유비쿼터틸화 반응당 100nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 및 50 μM Ub를 사용하십시오. ddH2O로 반응의 부피를 20 μL로 조정합니다. 참고: ATP 솔루션 및 유비쿼터티션 버퍼는 10배 재고 솔루션으로 구입하여 1배에서 사용되었습니다.</li>
		<li>모든 반응에 대한 파이펫 팅 구성표를 준비합니다. 치촉매 비활성 칩(H260Q) 돌연변이체로 칩(I) 기능(I) 기능( I) 및 (III) 개별 유비쿼터스 반응에서 CHIP 없이 9개의 다른 E2 효소를 테스트한다.</li>
		<li>피펫팅 오류를 방지하려면 모든 반응에 필요한 볼륨과 하나의 추가 반응에 필요한 볼륨이 포함된 얼음에 마스터 믹스를 준비합니다. 반응당 필요한 마스터 믹스의 양을 계산합니다. 참고: 마스터 믹스 구성 요소는 각 반응, 즉., E1, E3, Ub, ATP 및 유비쿼터티션 버퍼에 동등하게 필요한 시약입니다.</li>
		<li>폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 튜브에 ddH2O 및 마스터 믹스를 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>E2 효소를 첨가하여 유비쿼터티화 반응을 시작하기 전에, 다음 프로그램으로 PCR 열 사이클러를 설정합니다: 2h, 37°C, 4°C, 무한히.</li>
		<li>각 튜브에 E2 효소의 1 μM을 추가하고, 표시된 기간 동안 PCR 열 사이클러에서 샘플을 배양한다.</li>
		<li>2시간 후 각 반응에 SDS 샘플 버퍼를 추가하고 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 참고: 샘플 버퍼의 필요한 부피는 샘플 버퍼의 재고 농도에 따라 달라집니다. 여기서, 2x SDS 샘플 버퍼의 20 μL이 각 반응에 첨가되었다.</li>
		<li>샘플을 즉시 95°C에서 5분간 끓이고 폴리아크릴라미드 젤 전기포레시스(PAGE)를 계속합니다. 변성 단백질을 -20°C에 저장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>젤 전기 전과 및 서부 얼룩<ol>
<li>해동 후, 약 10s에 대한 샘플을 회전하고 SDS-PAGE 젤을로드합니다. 단백질 사다리를 크기 참조로 사용하십시오. 참고: 여기, 4-12% 비스 트리그라데이션 젤과 단백질 사다리의 3 μL이 사용되었다. 샘플 볼륨을 나누고 각 샘플의 20 μL을 사용하여 두 젤을 동등하게 로드합니다.</li>
		<li>샘플 전면이 젤의 바닥에 도달할 수 있도록 약 30-45 분 동안 160-200 V에서 젤을 실행합니다.</li>
		<li>각 젤을 반건조 블로팅 버퍼로 채워진 플라스틱 용기에 옮기고 RT에서 2-5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>SDS 젤 당 젤 크기의 니트로셀룰로오스 멤브레인 2개와 젤 크기의 니트로셀룰로오스 멤브레인 을 준비하고 세미드라이 블로팅 버퍼에 미리 담가 둡니다. 서쪽 블롯 (WB) 샌드위치를 아래에서 위쪽으로 조립 : 블로팅 종이, 니트로 셀룰로오스 막, SDS-PAGE 젤, 블로팅 페이퍼.</li>
		<li>샌드위치 층 사이에 갇혀있을 수있는 기포를 제거합니다. 이를 위해 롤러를 사용하여 조심스럽게 샌드위치를 몇 번 롤오버하십시오.</li>
		<li>챔버를 닫고 과도한 블롯 버퍼가 빠져나갈 수 있도록 합니다.</li>
		<li>각 블로팅 장치에 챔버를 배치하고, 반건조 블로팅에 대한 다음 프로그램을 사용 : 25 V, 1.0 A, 30 분.</li>
		<li>블로킹 멤브레인을 블로킹 솔루션으로 채워진 플라스틱 용기로 옮기고 RT에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>블로킹 시약을 포함하는 PBS-T의 10mL에 항체를 추가하여 1차 항체 용액을 준비한다(재료의 표참조). 참고: 항체의 작동 농도는 항체 특이적이다. 이 경우, 단일 클론 마우스 항 유비퀴틴 항체는 1:5,000의 희석에서 사용되었다. 제2 겔의 경우, 단클론 토끼 안티칩 항체는 PBS-T/차단 시약에서 1:5,000에서 사용되었다.</li>
		<li>차단 용액을 1차 항체 용액으로 교체하고 로커의 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
		<li>PBS-T로 멤브레인을 10분 동안 세 번 씻으시면 됩니다.</li>
		<li>PBS-T의 10mL에 각각의 항체를 추가하여 이차 항체 용액을 준비한다. 참고: 여기에서 염소 항마우스 및 마우스 항래빗 항체는 1:10,000의 희석에 사용됩니다.</li>
		<li>로커에 RT에서 1 시간 동안 이차 항체로 멤브레인을 배양하십시오.</li>
		<li>PBS-T로 멤브레인을 5분 동안 세 번 씻으시면 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 분석<ol>
<li>제조사의 지시에 따라 고추냉이 과산화제(HRP)-컨쥬게이드 항체에 대한 서부 블롯 검출 시약을 제조사의 지시에 따라 세척된 멤브레인에 추가하고 X선 필름 또는 전하 결합 장치카메라(도 1)를사용하여 HRP 신호를 캡처합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 체외 기판 유비쿼터션 분석
<ol><li>분석 준비 및 실행<ol>
<li>단백질의 주어진 어과 단백질 농도를 기반으로 반응당 필요한 각 시약의 양을 계산합니다. 기판 유비쿼터틸화 반응당 100nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM 기판 및 50 μM Ub를 사용합니다. 10x ATP 솔루션과 10배 유비쿼터틸레이션 버퍼를 1배에서 사용하십시오. ddH2O로 기판 유비쿼터션 반응의 부피를 20 μL로 조정합니다.</li>
		<li>모든 반응에 대한 파이펫 팅 구성표를 준비합니다. 기판 유비쿼터틸화가 E3 특이적임을 확인하는 적절한 제어 반응을 포함한다. 단백질 UNC-45B를 칩의 대표적인 기판으로 사용하고 촉매비활성 칩 돌연변이체(H260Q)를 대조군으로 사용한다. E1, E2, Ub 믹스(Ub, ATP, 유비쿼터티션 버퍼 포함) 다음 반응을 준비합니다. E1, E2, Ub 믹스, UNC-45B; E1, E2, Ub 믹스, 칩 (H260Q), UNC-45B; 및 E1, E2, Ub 믹스, 칩, UNC-45B.</li>
		<li>피펫팅 오류를 방지하려면 모든 반응에 필요한 볼륨과 하나의 추가 반응에 필요한 볼륨이 포함된 얼음에 마스터 믹스를 준비합니다. 반응당 필요한 마스터 믹스의 볼륨을 계산합니다. 참고: 이 분석의 마스터 믹스 구성 요소에는 E1, E2, Ub, ATP 및 유비쿼터션 버퍼가 포함됩니다.</li>
		<li>ddH2O, 기판, E3 리게아제 : 다음 순서로 반응 성분을 추가합니다.</li>
		<li>마스터 믹스의 첨가에 의한 유비쿼터스 반응을 시작하기 전에, 다음 프로그램으로 PCR 열 사이클러를 설정: 2 h, 37°C 다음에 4°C, 무한히.</li>
		<li>각 튜브에 마스터 믹스를 추가하고 표시된 기간 동안 PCR 열 사이클러의 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>2시간 후 각 반응에 2x SDS 샘플 버퍼를 추가하고 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.</li>
		<li>실행 후, 샘플을 즉시 95°C에서 5분 동안 끓이고 PAGE로 계속 끓입니다. 대안적으로, -20°C에 변성 단백질을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤 전기 전과 및 서부 얼룩<ol>
<li>섹션 2.2에 설명된 바와 같이 겔 전기 전구 및 서부 블롯을 수행합니다. 기판과 E3 리게아제의 검출을 위해 각각 특정 항체를 사용한다. 참고: 여기서, UNC-45B는 단일클론 마우스 항MYC 항체의 사용을 허용하는 c-myc 유전자 제품으로부터 유래된 폴리펩티드 단백질 태그에 융합된다. 안티 MYC는 1:10,000에 사용됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터 분석<ol>
<li>섹션 2.3(그림 2)에설명된 바와 같이 데이터 분석을 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 리신 방전 분석
<ol><li>분석 준비 및 실행<ol><li>E1로 Ub을 사용하는 E2 효소 충전<ol>
<li>단백질의 주어진 어과 단백질 농도를 기반으로 반응당 필요한 각 시약의 부피를 계산합니다. 충전 반응당 2μM E1, 4 μM E2 및 4 μM 리신 프리 유비퀴틴(Ub K0)을 사용하십시오. 10배 ATP와 10배 유비쿼터티 버퍼를 1배에서 사용하십시오. ddH20으로 충전 반응의 부피를 20 μL로 조정합니다. 참고: 리신이 없는 Ub K0 돌연변이체는 모노 유비쿼터스 E2의 독점 생산을 시행하는 데 사용됩니다. 야생 형 Ub도 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 분석하기 어려운 다양한 E2~Ub수정(예:E2의 폴리-유비쿼터스)으로 이어질 수 있습니다. 처음 사용하거나 새로운 E2 효소를 사용할 때 E1에서 얻을 수 있는 E2에 대한 Ub 충전 수준을 결정합니다. 충전 의 수율을 확인하려면 쿠마시 염색을 통해 충전되지 않은 대 충전 된 E2를 시각화하십시오. 여기서 Ub K0의 약 절반은 UBE2D2 및 Ub K0(보충피규어 S2A)의평형 비율을 사용할 때 UBE2D2~Ub로 안정적으로 전환되었습니다.</li>
			<li>충전 반응에 대한 파이펫팅 구성표를 준비합니다. 개별 방전 반응에서 칩 및 CHIP(H260Q)을 사용한다. 따라서, 하나의 충전 반응의 두 배 의 부피를 준비한다. 참고: 처음으로 사용하는 경우 최적의 방전 상태를 모니터링하고 서부 블로팅으로 분석하기 위해 선택한 E3 리개서의 다양한 농도를 테스트합니다. 이상적인 조건에서, E2에서 Ub의 출력은 각각E2~Ub 단백질 밴드가 사라질 때까지 시간이 지남에 따라 증가할 것입니다.</li>
			<li>37°C에서 15분 동안 충전 반응을 배양한다.</li>
		</ol></li>
		<li>충전 반응 종료<ol>
<li>최종 농도 1.8 U/mL에서 apyrase를 첨가하여 충전 반응을 중지하십시오. RT에서 5분 동안 아피라제로 인큐베이션을 수행하고, 최종 농도인 30mM에서 EDTA를 추가합니다. ddH2O로 충전 반응의 부피를 30 μL로 조정합니다. 참고: Apyrase는 ATP 분자를 ADP(아데노신 디포스페이트) 분자로 변환하는 데 사용됩니다. E1 효소의 활성은 ATP 의존성이기 때문에 E1은 더 이상 E2를 충전할 수 없습니다. EDTA는 E1에 필요한 동인 Mg2+ 이온을 담금질하여 E1이 억제되도록 추가로 사용됩니다. 반응을 중지하는 데 필요한 apyrase의 양은 분석 조건 마다 다를 수 있습니다. apyrase 혼자 이미 사용할 수 있는 ATP 분자를 담금질, apyrase와 EDTA의 조합은 E1-UBE2D2 쌍에 대 한 충전 반응을 중지에 더 효과적이었다. 반응을 중지하는 것은 분석 재현성에 대한 중요한 요소이기 때문에 새로운 E1-E2 쌍을 테스트해야합니다. 이를 위해 충전 반응을 설정하고 중지하고 특정 시점에서 샘플을 수집합니다(예:2, 5, 10 및 15분 후). E2~Ub의 변속되지 않는 수준은 반응이 중단되었고, 티오에스테르가 그 기간 동안 안정적이었다는 것을나타낸다(보충 도도 S2B).</li>
		</ol></li>
		<li>E3로 E2~Ub 의 배출<ol>
<li>다른 시간 점에 해당하는 4개의 튜브를 준비합니다(t0, t1, t2, t3); 각 튜브에 비감소 시료 버퍼(4배 리튬 도데실 황산염(LDS) 버퍼의 6.7 μL을 추가합니다. 참고: 샘플 버퍼에서 감소 제를 사용하지 마십시오.</li>
			<li>t0에대한 정지 충전 반응에서 6 μL을 제거하고 ddH2O로 부피를 20 μL로 조정합니다.</li>
			<li>70°C에서 10분 동안 t0 샘플을 배양한다. 참고: 티오에스테르가 더 높은 온도에서 음순이 기때문에 배양 시간을 연장하여 샘플을 끓이지 마십시오.</li>
			<li>방전 반응당 필요한 각 시약의 부피를 계산합니다. 충전된 E2의 나머지 24μL을 사용하고 E3 리게아제의 10mM L-리신, 1 mg/ml BSA 및 500nM을 추가합니다. 1x에서 유비쿼터티션 버퍼를 사용하고 ddH2O로 부피를 80 μL로 조정합니다.</li>
			<li>모든 방전 반응에 대한 파이펫팅 체계를 준비하고 CHIP(WT) 외에 CHIP(H260Q)을 제어로 사용합니다.</li>
			<li>ddH2O, 유비쿼터틸션 버퍼, BSA, 리신, E3 리개제 및 충전된 E2의 반응과 같은 순서로 필요한 구성 요소를 추가하여 얼음에 방전 반응을 설정합니다.</li>
			<li>RT에서 방전 반응을 배양합니다.</li>
			<li>각 샘플 튜브로 방전 반응의 20 μL을 전송하여 5, 30 및 60 분 후에 샘플을 채취하십시오. 참고: 방전을 적절하게 모니터링할 수 있는 적절한 시간점은 E2-E3 쌍마다 다를 수 있습니다.</li>
			<li>즉시 샘플을 소용돌이시키고 70 °C에서 10 분 동안 배양합니다.</li>
			<li>페이지로 직접 진행합니다. 참고: E2~Ub 티오에스테르는 시료 버퍼에서 데우러진 후에도 음순이 될 수 있습니다. 따라서, 겔 전기전광은 분석 실행 후에 직접 수행되어야 한다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>젤 전기 전과 및 서부 얼룩<ol>
<li>2.2항에 설명된 바와 같이 겔 전기전과 서부 블로팅을 수행한다. Ub 특이적 항체를 사용하고, 사용 가능한 경우, 또한 다른 종에서 제기된 E3 특이적 항체를 사용하여 Ub 및 E3 리게아제 신호를 동시 검출할 수 있게 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 분석<ol>
<li>섹션 2.3(그림3)에설명된 바와 같이 데이터 분석을 수행합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해상충이 없습니다.

이 논문은 E3 리게아제 기능 의 분석을 위한 기본 체외 보편화 방법을 설명합니다. 시험관 내 유비쿼터티션 어약을 수행할 때, 일부 E2 효소는 활성부위(30)에근접한 자체 리신 잔류물의 공격으로 인해 자동 유비쿼터티화를 수행할 수 있다고 고려해야 한다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 각각의 리신 잔류물이 아르기닌으로 교환되는 E2 돌연변이제를 사용하는 것이 좋습니다, 이는 자동유비쿼터션(32)에저항하는 촉매 활성 E2 효소를 초래한다. 이는 분석의 재현성을 보장하기 위해 리신 방전 분석서를 통해 Ub 전송을 모니터링할 때 특히 중요합니다. 또 다른 중요한 요소는 E2~Ub 티오에스 본드의 일시적인 특성입니다. 티오에스테르 안정성이 시험관내 적용에서 가능한 경우, E2의 활성 시스테인 잔류물은 세린으로 교환되어 보다 안정적인 E2~Uboxyester(33)를</s...

유비쿼터션은 Ub가 기판 단백질1에공동으로 연결되는 과정입니다. Ub 수정은 세 가지 효소 클래스, 즉Ub 활성화 효소 (E1s), Ub-컨쥬게이팅 효소 (E2s), Ub ligases (E3s), 그리고 아마도 Ub 사슬 연신 요인 (E4s)2,3,4,5의작용을 포함하는 연속적인 효소 반응에 의해 촉매된다. E1에 의한 Ub의 아데노신 트리호스페이트(ATP)와 마그네슘(Mg2+)의존적활성화 후, E1의 활성 부위 시스테인은 Ub의 C-말단 글리신을 공격하여 티오에스테르 복합체(Ub~E1)를 형성한다. ATP 가수분해에서 가져온 에너지는 Ub가 다음과 같은 효소 캐스케이드 전반에 걸쳐 유지되는 높은 에너지 전환 상태를 달성하게 합니다. 다음으로, E2 효소는 활성 Ub를 내부 촉매 시스테인으로 전달하여 일시적인 Ub~E2 티오에스테르 결합을 형성합니다. 이어서, Ub는 기판 단백질로 옮겨질 것입니다.
이 작업은 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. E3 리개세중 은 먼저 E2에 결합할 수 있거나 E3 리개세는 Ub를 직접 결합할 수 있습니다. 후자의 방법으로 E3~Ub 중간기의 형성이 발생합니다. 두 경우 모두, Ub는 Ub의 C-말단 카복실 그룹과 기판6의리신 아미노 그룹 사이의 이소펩티드 결합의 형성에 의해 기판 단백질에 연결된다. 인간 게놈은 2개의 E1s, 대략 40 E2s 및 600개 이상의 putative 유비퀴틴 리개사7을인코딩합니다. E3의 Ub 전송 메커니즘에 기초하여, Ub ligases는 E6AP C-terminus (HECT) 타입, 정말 흥미로운 새로운 유전자 (RING)/U 박스 형, 그리고 링 (RBR) 형 리게세스8사이의 링에 동종과 관련된 세 가지 범주로 나뉩니다. 본 연구에서는, HSC70-상호작용 단백질(CHIP)의 리구아제, 카르복실 터미누스를 함유한 U-box를 대표적인 E3 효소로 사용한다. Ub~E3 티오에스테르를 형성하는 HECT 형 E3 효소와는 달리, 칩의 U 박스 도메인은 E2~Ub를 결합하고 E2 효소8,9에서직접 후속 Ub/기판 전달을 촉진한다. 효소 기능에 대한 U-box의 중요성을 바탕으로 비활성 CHIP U-box 돌연변이인 CHIP(H260Q)이 컨트롤로 활용됩니다. CHIP(H260Q)은 코그네이트 E2에 결합하지 못해 E3 리구아제 활동10을잃습니다.
단백질 유비쿼터스는 진핵 세포에 있는 세포 사건의 다수를 조절에 있는 중요한 역할을 합니다. 기판 단백질에 Ub 분자의 가역적 인 부착에 의해 촉진되는 세포 결과의 다양성은 Ub의 분자 특성에 기인 할 수있다. Ub 자체가 7개의 리신(K) 잔류물을 함유하고 있기 때문에, 다양한 크기 및/또는토폴로기(11)를가진 다양한 Ub 체인 타입이 있다. 예를 들어, 기판은 단일 Ub 분자(mono-ubiquitylation) 또는 다중 리신(멀티 모노-유비쿼터틸레이션)에 의해, 심지어 Ub 체인(poly-ubiquitylation)11에의해 변형될 수 있다. Ub 체인은 Ub의 동일하거나 다른 리신 잔류물을 통해 일반적으로 형성된 호모 또는 이종성이며, 이는 심지어 분지 된 Ub 체인9의결과를 초래할 수 있습니다. 따라서, 단백질 유비쿼터스는 유목 단백질의 분해, 활성화 또는 국소화를 위한 특정 정보(예:.,12,13)를제공하는 Ub 분자의 다양한 배열로 이어집니다. 이러한 다른 Ub 신호는 변화하는 환경 요구에 대응하는 세포의 능력에 대한 중요한 요구 사항인 세포 신호 경로의 빠른 재프로그래밍을 가능하게 합니다.
유비쿼터스의 중심적인 측면은 단백질 품질 관리와 관련이 있습니다. 잘못 접히거나 돌이킬 수 없는 손상된 단백질은 단백질 항상성 또는프로테오스타증(14)을유지하기 위해 새로 합성된 단백질로 분해되고 대체되어야 한다. 품질 관리 E3 리게아제, CHIP, 손상된 단백질의 Ub 의존 적 분해에분자 샤페론과 협력9,15,16,17. 그 외에도, CHIP은 근육 기능과 편차로 단단히 조정되는 뮤진 주도 샤페론, UNC-45B(UnC-45 Homolog B)의 안정성을 조절하여 인간 근병증18,19,20,21로이어진다. 26S 프로테솜에 의한 UNC-45B의 분해는 K48 연계 폴리-Ub 체인9의부착에 의해 중재된다. 기판 단백질이 없는 경우, CHIP은 링/U-box E3 유비퀴틴 리게아제(24, 25)의 특징인 자동 유비퀴틸레이션10,22,23을수행하며, 리구아제 활성(26)을조절하는 것으로 고려된다. 본 논문에 기재된 체외 유비쿼터션 분석 방법의 적용은 CHIP과 협력하여 CHIP의 무료 폴리-Ub 체인 및/또는 칩의 자동 유비쿼터션(프로토콜 섹션 2)의 형성을 촉진하는 E2 효소를 체계적으로 식별하는 데 도움이 되었습니다. 더욱이, UNC-45B의 칩 의존형 유비쿼터스(ubiquitylation)가 관찰되었으며, 이는 E3 리게아제18,19(프로토콜 섹션 3)의 공지된 기판이다. 궁극적으로, Ub~E2 티오에스테르로부터 활성화된 Ub의 칩 의존적 전송을 모니터링하였다(프로토콜 섹션 4).

<table><tbody><tr><td>Amershan Protran 0.1 &마이크로; m NC</td><td>GE Healthcare</td><td>10600000</td><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td></tr><tr><td>Anti-CHIP</td><td>세포 신호</td><td>2080</td><td>단클론 토끼 항 CHIP 항체, 클론 C3B6</td></tr><tr><td>Anti-MYC</td><td>Roche</td><td>OP10</td><td>단일 클론 마우스 anti-MYC 항체, 클론 9E10</td></tr><tr><td>Anti-ubiquitin</td><td>Upstate</td><td>05-944</td><td>Monoclonal mouse anti-Ub 항체, 클론 P4D1-A11</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma</td><td>A6535-100UN</td><td></td></tr><tr><td>ATP (10x)</td><td>Enzo</td><td>12091903</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A6003-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>LDS 샘플 버퍼 (4x)</td><td>novex</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>L-라이신</td><td>시그마</td><td>L5501-5G</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Roth</td><td>4256.4</td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>VWR 화학 물질</td><td>2,08,47,307</td><td>100%</td></tr><tr><td>Milchpulver</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>P029.3</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 항산화</td><td></td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 전송 buffer(20x)</td><td>novex</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Page ruler plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>26619</td><td>단백질 사다리</td></tr><tr><td>RotiBlock</td><td>Roth</td><td>A151.1</td><td>차단 시약</td></tr><tr><td>SDS(20%)</td><td>Roth</td><td>1057.1</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Thermal Cycler</td><td>Bio Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo</td><td>Bio Rad</td><td>1704150EDU</td><td>이송 시스템</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>UbcH 효소 세트</td><td>BostonBiochem</td><td>K-980B</td><td>E2 효소</td></tr><tr><td>Ubiquitin</td><td>BostonBiochem</td><td>U-100H</td><td></td></tr><tr><td>유비퀴틴 활성화 효소 E1</td><td>Enzo</td><td>BML-UW941U-0050</td><td></td></tr><tr><td>Ubiquitylation buffer (10x)</td><td>Enzo</td><td>BML-KW9885-001</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 블로팅 페이퍼</td><td>Bio Rad</td><td>1703969</td><td>매우 두꺼운 여과지</td></tr></tbody></table>

시험관 내 e3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

기판 단백질의 내부 리신 잔류물, 유비쿼터스라고 불리는 공정에 유비퀴틴(Ub)의 공유 부착은 진핵 생물에서 가장 중요한 번역 후 수정 중 하나를 나타냅니다. 유비퀴틸화는 유비퀴틴 활성화 효소(E1 효소), 유비퀴틴-컨쥬게이팅 효소(E2 효소), 유비퀴틴 리구아제(E3 효소) 등 3가지 효소 클래스의 순차적 캐스케이드에 의해 매개되며, 때로는 유비퀴틴 사슬 연공인자(E4 효소)에 의해 매개된다. 여기서, 유비퀴틸레이션 분석용 체외 프로토콜이 제공되어 E3 유비퀴틴 리가제 활성, E2-E3 쌍 간의 협력 및 기판 선택의 평가를 가능하게 한다. E2-E3 쌍의 협력은 E3 리게아제의 무료 폴리 유비퀴틴 체인 및/또는 자동 유비쿼터션의 생성을 모니터링하여 스크리밍할 수 있습니다. 기판 유비쿼터틸레이션은 E3 리게아제의 선택적 결합에 의해 정의되며 체외 반응의 서쪽 블로팅에 의해 검출될 수 있다. 또한, E2~Ub 방전 분석체가 설명되어 있으며, 이는 기능적 E2-E3 협력의 직접적인 평가를 위한 유용한 도구이다. 여기서, 유비퀴틴의 E3 의존적 전달은 해당 E2 효소로부터 자유 리신 아미노산(기판 유비쿼터티화를 모방) 또는 E3 리게아제 자체의 내부 리신(auto-ubiquitylation)에 따른다. 결론적으로, E3 리구아제 촉매 기능을 해결하기 위해 빠르고 수행하기 쉬운 세 가지 다른 체외 프로토콜이 제공됩니다.

유비퀴틴 리가제 칩과 협력하는 E2 효소를 식별하기 위해, E2 후보 세트는 체외 유비쿼터션 반응에서 개별에서 테스트되었다. 협력 E2-E3 쌍은 E3 의존형 유비쿼터티화 제품, 즉E3 리게세의 자동 편평성 및 무료 Ub 폴리머형성에 의해 모니터링되었다. 유비쿼터티화 제품은 서양 블로팅에 의해 분석되었다. 데이터 해석은 분자량 마커를 가진 결과 단백질 밴드의 크기 비교를 기반으로 합니다. 단백질 유비쿼터스는 각각 의 크기 차이가 8.6 kDa (단일 Ub 분자의 크기)를 가진 이중 밴드 또는 다중 반복 밴드의 외관을 특징으로하는 특정 밴드 패턴의 형성에 이르게한다.
여기서, 9개의 E2s의 능력은 야생형칩(도 1A),비활성 U박스 돌연변이 칩(H260Q)(도 1B)또는 칩(보충도면 S1)의존재속에서 시험되었다. ...

본 연구는 E3 유비퀴틴 리구아제 촉매 활성의 분석을 위한 체외 유비쿼터스 분석 프로토콜에 대한 상세한 제공. 재조합 단백질은 대장균 배양과 같은 원핵계를 사용하여 발현되었다.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 E2 효소 특이성, 기판 선택 및 유비퀴틴 전송을 포함한 E3 리개아제 기능의 중요한 주요 측면을 분석하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 진핵 소스의 단백질이 특수 장비없이 시험관에서 재조합적으로 표현되고 연구 될 수 있기 때문에 넓은 적용성입니다. 리신 방전 기법을 처음으로 사용하는 경우, 효소 농도와 같은 분석 파라미터를 최적화하여 E3 리게아제에 이상적인 배출 조건을 식별하는 것이 중요하다.시험관 내 자동 유비쿼터션 분석기를 수행하기 위해, 다른 E2 효소의 기능성을 테스트하고 모든 유비쿼터티션 반응과 하나의 추가 반응에 대한 얼음에 마스터 믹스를 준비하는 파이펫팅 방식을 설정합니다. 다음으로, 적절한 튜브에 E2 효소 1개의 마이크로몰라를 추가하고, 표시된 조건하에서 2시간 동안 PCR 열 사이클러에 샘플을 배양한다. 인큐베이션 후 각 반응에 SDS 샘플 버퍼를 추가하고 여러 번 파이펫팅하여 혼합합니다.그런 다음 즉시 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓이고 변성 단백질을 섭씨 20도에서 보관합니다. 체외 기판 유비쿼터스 분석기를 수행하려면 모든 반응에 대한 파이펫팅 방식을 준비합니다. 하나의 반응에 필요한 마스터 믹스의 양을 계산한 후, 얼음에 대한 모든 반응에 대한 마스터 믹스를 준비하고 각 튜브에 마스터 믹스를 추가합니다.각각의 E3 리개구를 개별적으로 추가합니다. 그런 다음 시연된 대로 PCR 열 사이클러에서 샘플을 2시간 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 각 반응에 두 번 SDS 샘플 버퍼를 추가하고, 파이펫팅으로 여러 번 혼합하고, 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다.리신 방전 분석기를 수행하려면 충전 반응에 대한 파이펫팅 방식을 설정하고 섭씨 37도에서 15 분 동안 충전 반응을 배양하십시오. 충전 반응을 중지하려면 밀리리터당 1.8단위의 최종 농도에 아피라제를 추가하고 실온에서 5분 동안 반응을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 EDTA를 최종 농도30 밀리머에 추가하고 이중 증류수를 사용하여 반응의 부피를 30 마이크로리터로 조정합니다.E3에 의한 E2 유비쿼터티화를 배출하기 위해 실험시 시점에 해당하는 5개의 튜브를 설정하고, 각 튜브에 6.7 마이크로리터의 비환화를 추가하고, 시간점 제로 튜브에서 정지된 충전 반응의 6마이크로리터를 제거하고, 총 부피를 26.7 마이크로리터로 조정한다. 방전 반응을 설정하려면 각 반응에 이중 증류수, 유비쿼터틸션 버퍼, BSA, 리신, E3 리게아제 및 충전된 E2를 추가합니다. 선택한 기간 이후에, 각 방전 반응에서 20 마이크로리터 샘플을 해당 샘플 튜브로 이송한다.그런 다음 즉시 샘플을 소용돌이쳐 10 분 동안 섭씨 70도에 놓습니다. 이 대표적인 서양 얼룩 분석에서 비활성 칩은 자동 보편화되지 않았습니다. 그러나, E3 독립적인 유비퀴틴 제품은 비활성 칩의 존재와 칩이 없는 상태에서 형성되었다.야생형 칩은 UBE2D 및 UBE2E 제품군의 단백질과 결합될 때 자동 보편화되었으며, 무료 폴리비비퀴틴 체인은 UBE2D 제품군의 단백질과 협력하여 생산되었지만 UBE2E 제품군의 단백질과는 달리. UBE2N/V1의 유비퀴틴 의 결합은 무료 유비퀴틴 체인의 형성을 지휘했다. UNC-45B의 자동 유비쿼터션 및 유비쿼터션은 야생형 칩으로 관찰되었지만 칩의 비활성 돌연변이가 아닌, UNC-45B가 칩에 대한 보존기판역할을 한다는 것을 나타낸다.칩의 촉매 활성이 리신 방전 분석서를 사용하여 분석되었을 때, 충전되지 않은 UBE2D2 효소는 17킬로달톤의 분자량을 가지고 있으며, 단일 유비퀴틴 분자를 가진 충전된 UBE2D2는 약 26킬로달톤의 분자량을 가졌다. 0시에 충전된 전체 E2 수율이 관찰되었습니다. 비활성 칩의 존재에서, UBE2D2의 희미한 E3 리게아독립적 방전하지만 칩의 자동 유비쿼터스검출되지 않았다.와일드 타입 CHIP의 존재에서, UBE2D2의 방전은 60 분 이내에 빠르고 완료되었고, CHIP의 자동 유비쿼터션은 자신의 lysine 잔류물에 유비퀴틴의 전송을 나타냈다. 제한된 E2 능력으로 인해 가능한 한 빨리 작동하고 즉시 SDS-PAGE 및 서양 블로팅다음에 방전 반응을 진행합니다. 이러한 시험관 내 유비쿼터틸화 프로토콜에 이어, 특정 유비쿼터틸화 연계 유형은 연결성 항체를 가진 서양 얼룩을 조사하여 식별할 수 있다.

in-vitro-analysis-of-e3-ubiquitin-ligase-function

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이 원고의 목표는 RING 형 E3 유비퀴틴 리가제의 포괄적 인 생화학 및 기능 적 연구에 대한 개요를 제시하는 것입니다. 상세한 프로토콜을 갖춘 이 다단계 파이프라인은 테스트된 단백질의 효소 활성을 검증하고 활성을 작동하도록 연결하는 방법을 보여줍니다.

시험관 내 링 타입 E3 유비퀴틴 리가제의 기능적 특성화

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

유비퀴티뉴션은 번역 후 중요한 단백질이며, 이의 난독증은 수많은 인간 질환에 연루되어 있다. 이 프로토콜은 파지 디스플레이가 유비퀴티니션의 특이성, 효율성 및 패턴을 제어하는 E3 리개아의 활성을 결합하고 조절할 수 있는 새로운 유비퀴틴 변종을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.

파지 디스플레이를 사용하여 E3 리개아제용 유비퀴틴 변종 변종 변조기 개발

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

기능 상실 및 획득이 Angelman 증후군 및 자폐 스펙트럼 장애와 관련된 유전자인 Ube3a에서 잘못된 센스 변이체의 기능적 중요성을 평가하기 위해 간단하고 확장 가능한 방법이 개발되었습니다.

Ube3a 변이체의 기능 평가를 위한 확장 가능한 세포 기반 방법

이 프로토콜은 재조합 단백질 정제와 유비퀴틴 사슬 절단 분석을 결합하여 신경 발달 장애와 관련된 유전적 변이가 탈유비퀴틸화 효소 활성에 미치는 영향을 측정하는 방법을 설명합니다.

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

SMAD2/SMURF2를 모델로 삼은 포유류 세포 용해체에서의 유비퀴틴화 검출 비교 전략

이 프로토콜은 포유류 세포 용해액 또는 순수 유비퀴틴 효소 복합체를 이용해 폐렴 구균을 유비퀴틴화하는 방법을 설명하며, 이후 정제된 VCP/p97-UFD1-NPLOC4 단백질 복합체로 처리하여 박테리오리네이션 활성을 평가하여 유비퀴틴 의존성 면역 효과 연구를 가능하게 합니다.

시험관 내 박테리아 유비퀴틴화 재구성 및 VCP/p97 매개 제거

학습하세요 시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 활성 분석 방법으로 E2-E3 효소 협력과 기질 선택성을 평가하는 기술입니다. 이 프로토콜은 재조합 단백질을 사용하여 진핵생물 단백질의 유비퀴틸화를 연구하는 데 활용됩니다.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

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