Name: 지질 막 역학 및 막 단백질 상호 작용을 위한 독특한 프로브로 중성자 스핀 에코 분광법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 학습하세요 중성자 스핀 에코 분광법을 활용한 지질 이중막의 집단 막 변동 연구 방법을. 나노초 시간척도에서 막 역학을 직접 측정하고 막-단백질 상호작용을 규명하는 생물물리학적 기법을 익히세요.

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R. 아쉬카르 감사 M. 나가오, L.-R. Stingaciu, 그리고 P. Zolnierczuk 많은 유용한 토론과 그들의 각각의 빔라인에 NSE 실험에 그들의 빈번한 지원에 대 한. 저자는 NIST와 ORNL에서 중성자 스핀 에코 분광기의 사용을 인정합니다. NIST의 NSE 분광기는 국가 표준 기술 연구소와 국가 과학 재단 간의 파트너십인 고해상도 중성자 산란 센터의 지원을 받고 있습니다. DMR-1508249. ORNL의 Spallation 중성자 소스의 NSE 분광기는 미국 에너지부 기초 에너지 과학 부서인 과학 사용자 시설 부서에서 지원됩니다. 오크 리지 국립 연구소는 UT-Battelle에 의해 관리됩니다, 미국 DOE 계약 번호에 따라 LLC. DE-AC05-00OR22725.

저자는 이해 상충을 선언하지 않으며 공개 할 것이 없습니다.

NSE는 다양한 조건에서 지질 막의 중각역학을 측정하는 강력하고 독특한 기술입니다. NSE의 효과적인 활용은 샘플 품질, 중성자 대비 및 지정된 샘플에 대해 조사할 수 있는 접근 가능한 역학의 범위에 따라 달라집니다. 따라서 성공적인 NSE 실험을 수행하고 고품질 데이터를 수집하려면 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. NSE 실험 중 중성자 빔 시간을 효과적으로 사용하는 데 있어 중요한 단계는 NSE 실험 전에 실험실 기반 방법으로 리포소말 현탁액을 특성화하는 것이다. 압출 리포솜의 크기 분포(또는 확산 상수)는 다이나믹 라이트 산란(DLS)에 의해 결정될 수 있으며, 개별 실험실이나 공유 시설에서 쉽게 사용할 수있다(84). 극저온 전자 현미경 검사는 최근 리포소말 샘플에서 검증된 또 다른 탄성술 법으로, 리포소말 현탁액의 극저온 미세화 섹션에 대한 고해상도 현미경 이미지가 효과적으로 리포소플루65, 도메인 형성85,<sup class="xr...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1"> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1"> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 5">, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
to:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 5">, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
<img alt="Lipid bilayer structures; neutron scattering analysis; molecular arrangement diagram; lipid vesicles." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Lipid bilayer diagrams with charts, nanostructure spheres, and membrane model in research context." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

세포막과 그 기능에 대한 이해는 지난 수십 년 동안 현저하게 진화했습니다. 세포막의 이전 보기는 세포 경계와 집막단백질을 정의하는 수동 지질 양층으로 1은 점차 지질 이중층이 세포 신호, 분자 교환 및 단백질 기능을 포함한 중요한 생물학적 과정을 조절하는 데 중요한 역할을하는 동적 모델로 점차 변형되어 몇가지 2,3,4,5,6의이름을 지정합니다. 세포막이 매우 역동적이고 지속적으로 리모델링 및 분자 재분배를 겪고 있다는 이러한 실현은 멤브레인7,8,9의평형 구조를 넘어 과학 탐사를 촉구했습니다. 이에 따라 생물학적 및 생체 영감 지질 막에서 다양한 동적 모드를 연구하기 위해 여러 가지 접근법이 개발되었습니다. 현재까지, 이들 연구의 대부분은 주로 확산 분자 운동에 초점을 맞추고있다 10,11,12,13 및 거시적 모양 변동14,15,16,중간 막 역학이해에 상당한 격차를 떠나, 즉, 지질 분자의 몇 10-100s로 구성 지질 어셈블리의 집단 변동. 이러한 역학은 수십 ~소수의 100 Å의 길이 저울과 몇 백 ns (그림 1참조)에 하위 ns의 시간 동안 저울에 걸쳐 발생, 중시경 비늘로 여기에 언급. 그것은 실제로 주요 생물학적 활동이 막 수준17에서일어나는 이 비늘에 실제로 입니다. 여기에는 바이러스신진(18),채널 게이팅19,막 단백질 상호작용(20)이포함됩니다. 또한 멤브레인 단백질21,22의 에너지 경관은 단백질의 형성적 변화가 규제 역할에 필요한 것을 보여 주며, ns 시간척도23의 집단 막 변동에 걸쳐 발생하며, 세포막의 생물학적 기능과 생체 영감 에 대한 생물학적 기능에 있는 중각역학의 중요성을 더욱 강조하는 것이중요하다. 이 논문은 지질 막의 두 가지 주요 중전적 동적 모드, 즉 굽힘 변동 및 두께 변동에 중점을 둡니다.
이러한 변동 모드를 직접 조사하는 데 중요한 과제는 표준 분광법 방법을 사용하여 공간 및 측두형 스케일에 동시에 액세스하는 데 어려움이 있다는 것입니다. 다른 과제는 직접 접촉 기술이16을측정하기 위한 것과 동일한 변동에 영향을 줄 수 있다는 것입니다. 이는 생물학적 멤브레인(24)의 조성 및 구조적복잡성에의해 더욱 악화되어지질영역형성(26,27,28,29,30 및 막 비대칭31, 32,33)등 비균일한 멤브레인 특징을 초래하여 다른 멤브레인 특징의 역학을 이해하기 위해 선택적 프로브를 요구한다. 다행히도, 이러한 과제는 본질적으로 필요한 길이와 시간 척도에 액세스하는 중성자 스핀 에코(NSE)와 같은 비침습적 중성자 분광법 방법으로 극복될 수 있으며, 또한 그들의 물리화학적 환경을 변경하지 않고 선택적 멤브레인 특징의 연구를 가능하게 한다34. 실제로, 지난 몇 년 동안 NSE 분광기는 집단 막 역학의 독특하고 강력한 프로브로 진화했다35. 지질막에 대한 NSE 연구의 결과 기계적36,37 및 점성탄38,지질 막의39 속성에 대한 새로운 통찰력을 생산하고 생물학적 기능40,41에서자신의 잠재적 인 역할에 새로운 빛을 발산했다.
NSE 분광법은메제이(42)가처음 제안한 간섭계 설계를 기반으로 하며, 일련의 스핀 플리퍼와 자기 코일을 사용하여 중성자가 계측기를 통과할 때 중성자 스핀의 침체를 제어합니다. 설계는 시료위치(도 1A)에대하여 자기장 원소의 자기 미러링에 달려 있다. 이것은 중성자와 시료 사이의 에너지 교환이 없는 경우 중성자는 악기의 상반기와 후반에서 반대 방향으로 동일한 수의 스핀 프런치를 수행한다는 것을 의미합니다 (두 번의 패침체 코일 사이의 π 플립퍼를 알 수 있음). 그 결과, 중성자의 최종 스핀 상태는 초기 상태에 비해 변경되지 않은 상태로 유지- 스핀 에코라고 하는 현상(도 1A에서투명 중성자 참조). 그러나 중성자가 시료와 활발하게 상호 작용할 때 에너지 교환은 계측기의 후반부에서 스핀 프론치 수를 수정하여 다른 최종 스핀 상태로 이어집니다(그림 1A참조). 이것은 실험적으로 이 논문의 후반에 나타난 바와 같이 편광의 손실로 검출됩니다. NSE 기술에 대한 자세한 내용은 독자가 전용 기술논문(42,43,44,45)을참조합니다.
여기서, 단순화된 설명은 NSE로 액세스할 수 있는 길이 및 시간 척도에 대한 대략적인 추정치를 제공하기 위해 제시된다. 길이 스케일은 달성 가능한 파벡터 전달, Q = 4π 신 θ/λ의범위에 의해 결정되며, 여기서2θ는 산란 각및 λ는 중성자 파장이다. 하나는 Q가 파장 범위와 분광계의 두 번째 팔의 회전 정도에 의해 설정된 것을 볼 수 있습니다 (그림 1A참조). NSE 분광기의 전형적인 Q-범위는~0.02-2Å-146,47,및 0.01-4Å-1까지 최근 업그레이드48,49,~1-600 Å의 공간 척도에 해당한다. 한편, 접근 가능한 시간 척도는 자기 패침체 코일 내의 중성자에 의해 획득된 총 경기 침체 각도(또는 상)로부터계산되며, 50으로 <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq12v5.jpg"> 나타났다. 이 표현식에서 t는 <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq13v2.jpg"> <img alt="Equation 50" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq50v2.jpg"> 중성자자성자성비의 위치가 <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg"> 코일 길이이며 코일 자기장의 강도로 정의된 포리에 <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> 시간이다. Fourier 시간은 계측기 기하학, 자기장 강도 및 중성자 파장에 엄격하게 의존하는 양이라는 점을 지적할 가치가 있습니다. 예를 들어, 파장의 중성자를 사용 <img alt="Equation 70" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq70v6.jpg"> = 8 Å 및 악기 설정 = <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg">   1.2 m 및 = <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> 0.4 T, Fourier 시간은 t ~ 50 ns로 계산됩니다. 실험적으로, 포리에 시간은 p침체 코일(즉, 자기장 강도)에서 전류를 변경하거나 다른 중성자 파장을 사용하여 조정되어~ 1 ps ~ 100ns의 전형적인 NSE 시간 척도를 초래한다. 그러나, NSE 분광기의 최근 업그레이드는 하이네즈 마이어-라이프니츠 젠트럼51의 J-NSE-피닉스 분광기에서 최대 ~400ns까지 더 긴 포리어 타임에 접근할 수 있게 해주었으며, 오크 리지 국립 연구소48의SNS-NSE 분광기, 그리고 IN15 NSE 분광기에서 최대 ~1,000ns까지인루트 랭에프(Ill-Inute) 
멤브레인 역학의 길이 및 시간 척도에 직접 액세스 하는 것 외에도, NSE는 중성자 동위원소 감도 의 고유 기능을 가지고52. 구체적으로, 중성자의 능력은 생물학적 시스템에서 가장 풍부한 소원인 수소의 동위원소와 다르게 상호 작용하는 능력으로, 상이한 중성자 산란 길이 밀도,34 또는 NSLD(굴절의 광학 지수에 상응하는50)를초래하며, 프로티엄은 중투란에 의해 대체된다. 이를 통해 특정 멤브레인 피쳐를 강조하거나 다른 사람을 숨기는 데 일반적으로 사용되는 콘트라스트 변형이라고 하는 접근 방식을 사용하여 후자의 시나리오를 대비 일치라고 합니다. 대조적 변화/매칭의 빈번한 적용은 중수 또는 D 2O(NSLD = 6.4 ×10 -6 å-2)에 의해 물의 대체물(NSLD= -0.56 × 10-6Å-2)으로유량지질막(NSLD ~0~0× -6Å-2)으로부터 중성자 신호를 증폭시키는 것이다. 이러한 접근법은 멤브레인의 헤드그룹 영역으로D2O의침투가 멤브레인 두께(도 2A,왼쪽 패널 참조) 및 보다 정교한 모델이적용될때 다른 지질 하위 그룹의 위치의 정확한 측정을 허용하기 때문에 멤브레인 구조의 연구에서 매우 효과적이다. 이 논문은 생물 막의 집단 역학 및 선택 막 특징의 연구를 위한 대비 변이의 사용에 대한 몇 가지 예를 강조합니다.
여기서, 동역 및 기능성 멤브레인 특성에 대한 고유한 통찰력을 제공하는 NSE의 효과는 리포소말 현탁액의 형태로 독립형 멤브레인의 중전역학에 중점을 둔 모델 및 생물학적으로 관련된 지질 막 시스템에 대한 NSE 연구의 유형 사례를 통해 설명됩니다. 평면 막 역학의 NSE 측정을 위해, 독자는 방목 발생 중성자 스핀 에코 분광법 (GINSES)55,56 및 정렬 다중 다각막 스택의 다른 연구에 전담 간행물을참조57,58,59,60.
단순성, 이 논문은 잘 연구된 도메인 형성, 또는 위상 분리, 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-인포콜린(DMPC)의 지질 이중층 시스템 및 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DSPC) 혼합물(DSPC) 혼합물(DSPC)61개에 대해 세 가지 다른 계획을 강조합니다. 두 지질은 탄화수소 사슬 길이(DMPC의 14탄/꼬리 vs DSPC의 18탄소/꼬리)와 겔유체 전이 온도(Tm, DMPC = 23°C vsTm, DSPC = 55°C)의 불일치를 특징으로 합니다. 이는 DMPC:DSPC 멤브레인에서 혼합물63의상부 및 낮은 전이 온도 사이의 온도에서 측면 상 분리를 초래한다. 여기서 고려되는 증단 방식은 리포소말 멤브레인, 즉 굽힘 변동, 두께 변동 및 측면 도메인의 선택적 굽힘/두께 변동에 대한 NSE 측정에서 액세스할 수 있는 다양한 동적 모드를 시연하기 위해 선택됩니다. 모든 지질 조성물은 DMPC및 DSPC의 상용 및 정해 변형을 사용하여 70:30의 몰트 분수로 제조된 DMPC:DSPC 이중층에 대해 보고됩니다. 모든 시료 준비 단계는 D2O에서 지질 농도가 50 mg/mL인 4mL의 지질 현탁액을 기반으로 하며, 총 지질 질량인 Mtot = 샘플당 200 mg을 기준으로 합니다.

<table><tbody><tr><td>클로로포름 (생명 공학 급료)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>496189</td><td>Biotech. 급료, &ge; 99.8 %, 안정제로 0.5-1.0 % 에탄올 함유</td></tr><tr><td>순환 수조</td><td>Julabo</td><td>SE-12</td><td>가열 순환기 스마트 펌프, 프로그래밍 가능한 온도 설정 및 측정 및 제어를위한 외부 센서 연결</td></tr><tr><td>중수소 산화물</td><td>Cambridge Isotopes Laboratories</td><td>DLM-4</td><td>중수소수; 중수(D2O) (D, 99.9%)</td></tr><tr><td>디지털 세미 마이크로 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS105</td><td>120 g 용량, 0.01 mg 해독도, 고해상도 칭량 셀, 인체공학적 도어 및 피펫 검사 어플리케이션을 갖춘 세미 마이크로 저울</td></tr><tr><td>에탄올(분자생물학 등급)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>분자생물학 어플리케이션용 200 프루프 에탄올</td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>VWR</td><td>36360-536</td><td>일회용 소다 석회 유리 파스퇴르 피펫</td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>Thermo Scientific</td><td>B7990-1</td><td>PTFE/Silione 격막 캡이 있는 붕규산 유리 바이알</td></tr><tr><td>실험실 등급 냉동고</td><td>Fisher Scientific</td><td>IU2886D</td><td>지질 및 단백질의 장기 보관을 위한 초저온 냉동고(-86 - -50°C)</td></tr><tr><td>지질(프로테이트 또는 투과)</td><td>Avanti 극성 지질</td>은 <td>지질</td><td>에 따라 다릅니다.지질은 Avanti에서 분말 형태 또는 필요한 양과 중분화 계획과 함께 클로로포름 용액으로 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Millipore 정수기</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZRQSVP3US</td><td>Direct-Q&reg; &nbsp; 3 UV 정수 시스템은 내장 UV 램프로 순수와 초순수를 모두 제공하여 생물학적인 유기물 수준을 줄입니다. 응용 분야</td></tr><tr><td>미니 압출기 세트</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td>미니 압출기 세트에는 미니 압출기, 가열 블록, GasTight 주사기 2개, O-링 2개, 폴리카보네이트 멤브레인 및 필터 지지대가 포함되어</td></tr> 있습니다<tr>.<td>퀵 커넥트 피팅</td><td>Grainger</td><td>2YDA1 및 2YDA7</td><td>푸시 버튼 튜브 피팅은 QuickConnect 물 순환 애플리케이션(예: 고온 소포 압출</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>)을 위한 것입니다.SyringePump.com</td><td>New Era-1000</td><td>주입 및 배출을 위한 완전 프로그래밍 가능한 주사기 펌프; 조정 가능한 펌핑 속도, 분주 용량 및 압출 주기로 최대 41개의 펌핑 단계를 프로그래밍</td></tr>합니다. <tr><td>초음파 수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPX2800</td><td>탈기 및 초음파 응용 분야를 위한 프로그래밍 가능한 기능을 갖춘 온도 제어 초음파 수조</td></tr><tr><td>진공 오븐</td><td>Thermo Scientific</td><td>3608</td><td>0.7 cu ft 진공 오븐은 과열을 방지하는 상한 온도 조절 장치가 내장되어</td></tr> 있습니다. <tr><td>Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td>부드러운 쉐이킹을 위한 낮은 rpm 시동 또는 샘플의 격렬한 와류를 위한 고속 혼합을 허용하는 가변 속도, 아날로그 제어</td></tr></tbody></table>

지질 막 역학 및 막 단백질 상호 작용을 위한 독특한 프로브로 중성자 스핀 에코 분광법

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

지질 이중층은 세포막의 주요 매트릭스를 형성하고 영양 교환, 단백질 막 상호 작용 및 바이러스 성 신진을위한 기본 플랫폼입니다, 다른 중요한 세포 과정 중. 효율적인 생물학적 활동을 위해 세포막은 세포와 구획의 무결성을 유지할 수 있을 만큼 단단해야 하지만 단백질 및 기능성 도메인과 같은 멤브레인 성분이 확산되고 상호 작용할 수 있을 만큼 충분히 유연해야 합니다. 탄성 및 유체 막 특성의 섬세한 균형, 생물학적 기능에 미치는 영향은 주요 생물학적 과정의 장편 길이 및 시간 척도,즉 막 변형 및 단백질 결합 이벤트의 집단 막 역학에 대한 더 나은 이해가 필요합니다. 이 동적 범위를 효과적으로 조사 할 수있는 기술 중 중 하나는 중성자 스핀 에코 (NSE) 분광법입니다. 중수소 라벨링과 결합된 NSE는 벤딩 및 두께 변동뿐만 아니라 선택 된 멤브레인 피처의 중전적 역학에 직접 액세스하는 데 사용할 수 있습니다. 이 백서는 NSE 기술에 대한 간략한 설명을 제공하고 샘플 준비 및 중음 체계의 세부 사항과 데이터 수집 및 감소에 대한 지침을 포함하여 리포소말 멤브레인에 대한 NSE 실험을 수행하는 절차를 간략하게 설명합니다. 또한 굴곡 강성 계수, 영역 압축성 계수 및 평면 점도와 같은 주요 멤브레인 파라미터를 추출하는 데 사용되는 데이터 분석 방법을 소개합니다. NSE 연구의 생물학적 중요성을 설명하기 위해 NSE가 조사한 멤브레인 현상의 예를 선택하여 멤브레인 굽힘 강성에 첨가제의 효과, 막 변동에 대한 도메인 형성의 영향 및 막 단백질 상호 작용의 동적 시그니처에 대해 논의됩니다.

굽힘 변동에 액세스하는 NSE 연구는 일반적으로 ~ (0.04 - 0.2) Å-1의Q 범위에서 수행됩니다. 이 Q-range는 구부리다믹이 지배하는 멤브레인 두께와 리포소말 반경 사이의 중간 길이 스케일에 해당합니다. 확장된 Q-range를 측정하면 리포소말 확산 및 막 내 역학을 포함한 추가 동적 모드에 액세스할 수 있습니다. NSE에서 액세스하는 멤브레인 역학의 크로스 오버에 대한 자세한 내용은 이러한 관련 간행물25,71을확인하십시오. NSE 신호가 비례한다는 것을 강조하는 것이 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg"> 중요합니다:, 내가코와 나Inc.는 각각 샘플에서 일관되고 일관되지 않은 산란 강도입니다. 따라서, 주로 시료의 수소 함량에 의해 ...

이 논문은 지질 막의 중성자 스핀 에코 (NSE) 연구에서 샘플 준비, 데이터 감소 및 데이터 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. 지질의 현명한 중테리움 라벨링은 중요한 생물학적 과정이 발생하는 중전 길이와 시간 척도에 대한 다양한 막 역학에 접근할 수 있게 합니다.

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

이 프로토콜은 생물학적 기능과 지질 막의 실용적인 응용에 대한 관련성의 집단 막 변동에 대한 성공적인 중성자 스핀 에코 연구에 필요한 샘플 준비 및 데이터 감소를 설명합니다. NSE는 다른 기술로는 접근할 수 없는 선택적 멤브레인 특징을 조사하기 위한 동위원소 감도의 독특한 이점을 통해 주요 멤브레인 기능의 나노초 타임스케일에 직접 멤브레인 역학에 접근합니다. 나노 스케일에 막 역학의 연구는 분자 메커니즘의 기본 막 속성 및 다양 한 세포 병리에 연루 된 막 단백질 상호 작용을 이해 하는 데 필수적이다.이 방법은 성공적인 실험 및 후속 데이터 감소 분석 및 해석을 위해 지질 소포를 설계, 준비 및 특성화하는 방법에 대한 상세한 지침을 NSE에 새로운 연구원에게 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 테샤니 쿠마리지와 줄리 응우옌, 대학원생 및 실험실에서 학부 생입니다. 후드 내부에서 작업하면 수동 믹싱으로 용매 의 1 밀리리터에 정확하게 계량 된 지질을 용해하여 지질 현탁액을 준비합니다.유리병에 불활성 가스를 부드럽게 스트리밍하면서 천천히 비스듬히 회전하여 지질 용액을 건조시다. 잔류 용매를 철저히 제거하려면 바이알을 진공 오븐에 35도의 진공 오븐에 밤새 놓습니다. 다음 날, 지질 필름에 2밀리리터의 중수로 수분을 공급하여 밀리리터당 50밀리그램의 지질 농도를 얻고 지질 필름이 완전히 용해될 때까지 수화 지질 현탁액을 소용돌이시킵니다.다음으로, 동결 될 때까지 영하 80도에서 수화 지질 현탁액의 유리병을 저장하여 5 개의 동결 해동 주기를 수행하십시오. 그리고 지질 현탁액을 해동하기 위해 섭씨 35도의 수조로 옮김합니다. 다음 주기로 진행하기 전에 균일 할 때까지 해동 된 서스펜션을 소용돌이.실험을 시작하기 전에 두 멤브레인 지지대 사이에 폴리 중탄산염 멤브레인을 사용하여 압출기 설정을 조립하고 각 측면에 두 개의 종이 필터를 추가하여 추가 지원을 제공합니다. 밀폐 유리 주사기를 사용하여 막 조립을 통해 0.3 밀리리터의 중수를 여러 번 전달하여 폴리카보네이트 멤브레인에 수분을 공급합니다. 멤브레인을 수화한 후, 준비된 유백색 지질 용액을 한쪽 끝에 넣고 압출기 장치의 반대쪽 끝에 빈 주사기를 삽입합니다.주사기가 연결되면 어셈블리를 압출기 블록에 넣습니다. 속도 버튼을 누르고 압출 속도를 입력하고 직경 버튼을 눌러 주사기 직경을 입력하여 펌프를 프로그래밍합니다. 그런 다음 빛이 켜집니다 때까지 철회를 누릅니다.시동을 누르고 샘플이 빈 주사기에 분배되기 시작할 때까지 기다립니다. 샘플 주사기가 완전히 비어 있기 직전에 정지 버튼을 누르십시오. 디스펜싱 된 볼륨을 기록한 다음 위상 1이 화면에 나타날 때까지 속도 버튼을 누를 수 있습니다.인출 표시등을 끄고 볼륨 버튼을 눌러 이전에 기록된 분배 된 볼륨을 입력합니다. 속도 버튼을 다시 누르고 오른쪽 최대 화살표를 사용하여 2단계에 액세스합니다. 볼륨을 눌러 이전에 기록된 분배 된 볼륨의 동일한 값을 입력합니다.이 단계에서는 인출 표시등이 켜집니다때까지 인출 버튼을 누릅니다. LP:SE가 화면에 나타날 때까지 볼륨 버튼을 눌러 3단계의 주기를 반복하고 20으로 설정합니다. 마지막으로, 속도 버튼을 누르고, 4단계에 액세스하고, 볼륨 버튼을 눌러 정지 기능을 클릭하여 펌프 설정을 완료합니다.펌프가 프로그래밍된 후 시작을 눌러 압출 주기를 시작합니다. 측정을 위한 깨끗한 유리병에 투명한 오팔 블루 압출 지질 현탁액을 수집하기 전에 15~20회 압출 주기를 수행합니다. DAVE 소프트웨어를 열고 데이터 감소 메뉴에서 NSE 데이터 감소를 선택합니다.파일 메뉴에서 열린 에코 파일을 사용하여 다른 Q 값위에 데이터 파일을 업로드합니다. 업로드된 파일은 사용 가능한 데이터 집합 아래에 표시됩니다. 선택한 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 샘플, 셀 또는 해상도와 같은 측정에 따라 레이블을 지정합니다.데이터 집합 탭을 사용하여 검출기 픽셀을 2 X 2로 그룹화하여 신호 대 노이즈 비율을 개선합니다. 해상도, 셀 및 샘플의 모든 파일에 동일한 비닝을 적용합니다. 모든 픽셀 그룹에서 데이터를 검사하고 키보드의 끝 키를 눌러 신호가 좋지 않은 데이터를 마스크합니다.Enter를 눌러 팝업 창에 액세스하여 네 번 모두에 동일한 마스크를 적용합니다. 마스크된 픽셀은 녹색으로 바뀝니다. 수집된 데이터가 에코 신호의 형태로 되어 있는지 확인합니다.업로드된 파일 목록에서 원하는 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 맞춤 작업을 선택하여 해결 방법 파일을 피팅하기 시작합니다. 에코 신호의 적합이 합리적인 피팅 매개 변수를 생성하도록 합니다. 전체 검출기에서 각 피팅 매개 변수와 관련된 오류를 검사하려면 이미지 옵션을 선택한 다음 관심 있는 피팅 매개 변수를 선택합니다.그런 다음 감지기 이미지를 마우스 오른쪽으로 클릭하여 오류 표시줄 맵을 표시하는 팝업 창에 액세스합니다. 특정 픽셀에 대한 적합성이 만족스럽지 않은 경우 신호를 선택하고 피팅 탭을 누른 다음 Fit Pixel을 눌러 해당 픽셀 위에 신호를 다시 맞춥시게 합니다. 피팅 탭에서 위상 및 기간에 대한 새 시작 매개 변수를 입력합니다.업로드되고 레이블이 표시된 파일 목록에서 해당 파일을 선택하여 샘플 파일을 줄입니다. 위에서 설명한 대로 모든 픽셀을 검사하고 불량 픽셀을 마스크합니다. 그런 다음 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 맞춤 작업, 가져오기 단계를 선택합니다.해상도 파일의 경우 해상도에서 가져온 기간값과 에코 위상점의 값이 변경되지 않은 에코 신호를 미리 설명한 대로 맞춥시게 합니다. 일반 탭에 액세스하고 실험에서 기록된 X 및 Y 빔 센터 값을 입력하여 모든 데이터 파일에 대한 빔 센터를 입력합니다. 피트가 완료되면, 장착 된 파일 목록에서 원하는 샘플 파일을 오른쪽으로 클릭하고 팝업 메뉴에서 Q의 I 계산을 선택하여 정규화 된 중간 산란 함수를 계산합니다.해상도 및 셀 파일 및 팝업 창의 Q-arc 수에 필요한 정보를 입력한 다음 확인을 눌러 결과를 봅니다. 시안의 데이터는 검출기 가장자리 효과로 인해 신호가 좋지 않으며 다른 Q 데이터 세트를 컴파일할 때 제거해야 합니다. 마지막으로 감소된 데이터 집합을 ASCII 파일로 저장하고 전체 세션을 원하는 폴더에 DAVE 프로젝트로 저장합니다.이 연구에서는, 다른 중음 계획으로 제조된 리포소말 견본의 NSE 측정이 수행되었습니다. 멤브레인 굽힘 변동의 NSE 측정은 완전히 대조된 리포솜에서 수행됩니다. 이 중음 제표는 멤브레인 코어와 중음 유체 환경 사이의 큰 산란 길이 차이를 초래하여 리포소말 멤브레인의 산란 신호를 크게 향상시키고 굽힘 역학의 측정 통계를 향상시킵니다.한편, 리포솜의 멤브레인 두께 변동의 NSE 측정은 Q에 비해 편차를 벤딩 변동의 세 번째 의존도에 나타낸다. 두께 변동 신호를 격리하기 위해, 얻어진 신호는 Q로 3분의 1로 나뉘고, 초과 역학은 Q.이 방법은 고농도 및 강한 산란 신호의 샘플로 더 달성 가능한 양질의 데이터에 우발적이다. NSE가 조사한 역학은 중수소 NMR 이완과 분자 동적 시뮬레이션을 통해 시너지 효과를 통해 분자 지질 구조와 패킹 모티프가 멤브레인 기능에 미치는 영향을 보여줍니다.지질 막에 대한 NSE 연구는 막 생물 물리학, 막 구조 및 역학의 복잡한 관계, 막 기능 및 막 단백질 상호 작용에 미치는 영향에 대한 새로운 빛을 발산합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 기사에서는 전자 상자성 공명 연구를 위한 5층 리간드 게이트 채널의 위치 지정 스핀 라벨링 및 재구성 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 모든 멤브레인 단백질에 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 재구성 방법은 정의된 지질 시스템에서 거시적 및 단일 채널 전류의 패치 클램프 측정에도 사용할 수 있습니다.

사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

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이 프로토콜에는 저해상도 ab initio 모델 및 대비 세제의 일치와 작은 각 중성자 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 세제 solubilized 막 단백질의 구조 정보를 가져오는 방법을 보여 줍니다.

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여기, 우리는 예를 들어 시 토 크롬 보3  를 사용 하 여 단일 리의 지질 막에 걸쳐 양성자 전 좌의 분자 메커니즘을 연구 하는 프로토콜 제시. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법, 단일 소포, 포함 하는 단일 또는 여러 효소의 루멘에서 pH 변화를 결합 수 있습니다 감지 되며 개별적으로 분석.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

본 프로토콜은 인간 건강에 중요한 역할을 하는 두 모델 단백질의 구조 및 역학을 조사하는 방법을 기술한다. 이 기술은 벤치 탑 생물 물리학 적 특성화와 중성자 스핀 에코 분광법을 결합하여 단백질 간 운동과 관련된 시간 및 길이 스케일의 역학에 액세스합니다.

중성자 스핀 에코 분광법을 통한 단백질 역학 연구

이 프로토콜은 소각 중성자 산란 측정 중에 여러 액체 용액을 현장에서 신속하게 혼합하고 나노미터 길이 스케일 및 두 번째 시간 스케일에서 동역학 과정을 연구하기 위해 정지 흐름 샘플 환경을 사용합니다.

Stopped-flow and Small-angle Neutron Scattering을 이용한 나노스케일 물질의 시간 진화 측정

이 프로토콜은 분자 질량의 동시 조사 및 지질 막과 상호 작용하는 거대 분자의 확산 거동을 가능하게하는 iSCAT 기반 이미지 처리 및 단일 입자 추적 접근법을 설명합니다. 샘플 준비, 질량 대비 변환, 영화 수집 및 사후 처리에 대한 단계별 지침이 잠재적 인 함정을 방지하기위한 지침과 함께 제공됩니다.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

그라마시딘 A-도핑된 액상 계면 이중층을 조립, 전기자극, 분석하는 실험 프로토콜이 제시됩니다. 지질-단백질 구조-기능 관계는 막 면적, 이온 플럭스, 단일 채널 전도도 변화를 측정하고, 이러한 반응을 전기 시냅스에서 영감을 받은 막 모델에서 이온 전도의 가소성 유사 변화와 연관하여 정량화합니다.

액상 인터페이스 이중층을 이용한 지질-단백질 막 구조-기능 특성 분석

학습하세요 중성자 스핀 에코 분광법을 활용한 지질 이중막의 집단 막 변동 연구 방법을. 나노초 시간척도에서 막 역학을 직접 측정하고 막-단백질 상호작용을 규명하는 생물물리학적 기법을 익히세요.

지질 막 역학 및 막 단백질 상호 작용을 위한 독특한 프로브로 중성자 스핀 에코 분광법

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