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우리는 코드와 GUI를 테스트 더스틴 Revell 및 레지널드 에드워즈 감사합니다. 자금은 이 연구를 지원하는 국립 보건원에 의해 제공되었습니다: R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG), F31NS103586 (독감)을 포함.

1. 데이터 집합 및 디렉터리 선택
<ol><li>분석을 위해 데이터 집합을 선택하려면 데이터 집합 찾기 버튼(그림2A,빨간색 상자 1)을클릭하여 데이터가 증착된 폴더(예: RawData 폴더)로 이동합니다. 데이터 파일은 데이터 파일을 목록으로 자동으로 채웁니다. 폴더에 두 개 이상의 데이터 집합이 있을 수 있습니다.</li>
	<li>디렉토리 선택 버튼을 클릭하고 분석된 파일이 입금되는 디렉토리(예: 테스트)를 선택합니다(그림2A,빨간색 상자 2). 분석 버튼을 누르면 폴더 및 완성된 분석 파일 세트와 중간 임시 이미지가 이 디렉토리에서 만들어집니다. 디렉터리를 선택하지 않으면 오류가 생성됩니다.</li>
</ol>2. 픽셀 크기와 프레임 레이트 설정
<ol><li>적절한 "프레임 레이트" 또는 "픽셀 크기"상자(그림 2A,그린 박스)에서 이미지의 적절한 프레임 속도와 픽셀 크기를입력합니다. 값이 제공되지 않는 경우(기본 "0"으로 설정됨) 프로그램은 프레임 레이트 및 픽셀 크기에 대한 파일과 연결된 메타데이터를 검색합니다. 이러한 값을 찾을 수 없는 경우 프로그램은 시간 점에 대한 측정을 위해 픽셀당 및 프레임당 기본값으로 기본값입니다. 참고: 제공된 예제에서는 프레임 레이트가 100이고 픽셀 크기는 0.08입니다.</li>
</ol>3. 마스크 선택 또는 만들기
<ol><li>마스크 메이커 버튼을 사용하여 파일 데이터 집합 목록(그림2A,파란색 상자)의데이터에 대한 셀 마스크를 자동으로 만듭니다. 마스크 메이커 버튼을 사용하면 선택한 디렉터리에서 새 폴더를 MaskFiles라고 합니다. 실행 표시기"는 실행 중 노란색으로 바뀌고 완료되면 녹색으로 돌아갑니다. 참고: 데이터 파일 목록의 각 파일에 대한 마스크는 이미지 파일의 첫 10프레임(또는 이미지 파일에 있는 경우 모든 프레임에서)에서 생성되고 적절한 명명 체계(아래에 설명된 설명)를 사용하여 MaskFiles 폴더에 증착됩니다.</li>
	<li>마스크 파일이 마스크 파일 목록을 자동으로 채웁니다. 사용자는 분석으로 직접 진행할 수 있습니다. 참고: 항상 시각적으로 마스크 파일을 확인하고 관심 영역 전체를 캡처하는지 확인합니다. 선택한 경우 데이터 파일과 마스크 파일의 첫 번째 프레임이 UI에 표시됩니다. (그림2B). 마스크 메이커는 신호 대 노이즈가 낮은 경우 오류를 생성할 수 있으므로 마스크 파일이 적절한지 확인하는 것은 품질 관리에 매우 중요합니다.</li>
	<li>마스크 메이커를 사용하는 대신 이미지 의 노이즈에 대한 신호가 충분하지 않은 경우 ImageJ에서 수동으로 마스크를 만듭니다.<ol>
<li>먼저 ImageJ(그림3A)에서원시 이미지 파일을 엽니다.</li>
		<li>다각형 선택 버튼을 클릭하고 클릭하여 셀 주위에 마스크를 그립니다. 완료되면 마지막 지점을 두 번 클릭하여 다각형을 완성합니다.</li>
		<li>작업이 완료되면 편집| 선택 | 마스크 만들기(그림 3B). 다각형 도면에 따라 새로운 반전 마스크가 만들어집니다. 선택한 디렉터리에서 지정된 MaskFiles 폴더에 마스크를 저장합니다. 마스크 파일 명명 방식은 "_mask_file"이 뒤따르는 해당 개별 데이터 파일과 일치해야 합니다. 예를 들어 데이터 파일의 이름이 "VAMP2_488_WT_1.tif"인 경우 해당 마스크 파일의 이름을 "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif"로 지정해야 합니다.</li>
		<li>마스크 파일 찾기 버튼을 사용하여 입금된 사용자 지정 마스크 파일의 선택한 폴더로 이동합니다. 마스크는 마스크 파일을 목록으로 채웁니다. 참고: 분석을 실행하기 전에 모든 데이터 파일에 대해 마스크를 두는 것이 중요합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 분석 및 기능 추출
<ol><li>디렉터리를 선택하고 데이터 파일 목록과 마스크 파일 목록이 채워진 후 분석 단추(그림4A)를클릭합니다. 외세포 이벤트의 분류가 필요한 경우 5단계로 이동합니다. 참고: 분석 단추 클릭은 데이터를 분석하기 위해 일련의 자동화된 작업을 수행합니다. 선택한 디렉토리에 개별 폴더를 만들어 분석된 데이터를 예치합니다. 실행 하는 동안, "실행 표시기" 녹색에서 노란색으로 변경 됩니다(그림 4A,빨간색 상자). 분석이 완료되면 다시 녹색으로 변경됩니다.</li>
	<li>각 데이터 파일(그림 4C)에 따라 명명된 전체 분석 파일 세트(기능 추출 파일뿐만 아니라 나중에 분류에 사용할 기능 추출 파일)를 가진 DataFiles폴더(그림 4B)를찾습니다. 참고: 이러한 분석 파일에 대한 설명은 아래의 대표 결과 섹션에 포함되어 있습니다.</li>
</ol>5. 외세포 이벤트의 분류
<ol><li>자동 감지를 사용하여 외세포 이벤트의 동시 분류를 수행하려면 분석 버튼을 클릭하기 전에 분류 확인란을 선택합니다. 각 외식 이벤트에 대해 각 클래스에 대해 0-1 사이의 확률 점수를 할당합니다. 엑소시틱 이벤트는 해당 클래스의 확률 점수가 0.5> 인 경우 4개 클래스 중 하나로 분류됩니다. 참고: 분석이 완료되면 선택한 디렉터리 내에 새 데이터 파일 폴더가 나타납니다. 폴더에는 각 이미지 파일에 해당하는 분석 파일이 포함됩니다.</li>
</ol>6. 리플리의 K 값을 사용하여 외세포증의 현면 분석
<ol><li>별도의 "neurite" 및 "소마" 마스크 파일을 만듭니다. 첫째, 중성염으로부터 소마를 분할한다. 중성염에서 소마를 분할하는 편견없는 방법이 없으므로 사용자는 컨디셔닝 실험에 눈을 멀게하고 최상의 판단을 사용해야합니다. 명백한 neurite 확장이없는 타원은 제안됩니다.</li>
	<li>이미지J/피지 오픈.</li>
	<li>마스크 파일을 드래그 앤 드롭하거나 파일 | 사용 마스크 파일을 열고 선택합니다.</li>
	<li>색상 선택 도구를 사용하고 마스크 배경의 검은 색 픽셀을 클릭하여 색상을 검은색으로 설정합니다.</li>
	<li>다각형 선택 도구 또는 프리핸드를 사용하여 소마 주위에 윤곽선을 그려 중성염에서 분리합니다. 이를 위해서는 수동 적인 의사 결정이 필요합니다.</li>
	<li>| 편집을 클릭합니다. 선택 | 마스크를 만듭니다. 이미지의 나머지 부분에서 분할된 동그라미 된 소마로 새 이미지가 열립니다. 이렇게 하면 소마 마스크 파일이 생성됩니다.</li>
	<li>그려진 영역을 이동하지 않고 원래 마스크 파일의 헤더를 클릭합니다.</li>
	<li>| 편집을 클릭합니다. 중성염만 마스크로 유지되도록 동그라미된 소마를 채우기 위해 채웁니다.</li>
	<li>별도의 neurite 및 마스크 파일을 가져오면 두 마스크 파일을 모두 저장합니다. </li>
	<li>Matlab에서 "neurite_2D_network"을 엽니다.</li>
	<li>MATLAB에서는 모든 분석 데이터를 사용하여 디렉터리로 이동합니다.</li>
	<li>"마스크 파일/ VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"와 같은 노이라이트 마스크의 이름으로 경로 "마스크 이름"을 변경합니다.</li>
	<li>"csv_file_name"을 fluorescent_traces.csv 파일이 있는 위치(예: "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv"로 변경합니다.</li>
	<li>실행을 클릭하여 neurite 마스크 파일을 골격화합니다. 이렇게 하면 neurite 마스크 파일의 골격화된 버전이 생성되어 마스크 파일 폴더 아래에 CSV 파일로 기록합니다.</li>
	<li>다음으로 소마에 대한 CSV 파일을 생성합니다. Matlab에서 "CSV_mask_creator.m"를 엽니다.</li>
	<li>"마스크 이름"의 경로에 "마스크 이름"을 soma 마스크의 이름으로 넣습니다(예: "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif</li>
	<li>"쓰기 매트릭스"를 생성할 csv 파일 이름으로 변경합니다(예: "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"</li>
	<li>실행 실행을클릭합니다. 이렇게 하면 새 VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv 파일이 만들어집니다.</li>
	<li>모든 마스크 파일에 대해 6.14를 반복합니다.</li>
</ol>7. RStudio 설정
<ol><li>Rstudio를 열고 ripleys_k_analysis 열립니다. R 파일.</li>
	<li>도구 | 패키지를 설치하고 "스패츠스타트"에 입력한 다음 설치를클릭합니다. 참고: Rstudio 설치당 한 번만 수행해야 합니다.</li>
	<li>각 세션의 시작 부분에서 라이브러리 스패츠스타트를 실행합니다.</li>
	<li>이 경우 "neuron_mask"과 "neuron_datapoints"의 두 가지 주요 변수에주의를 기울이세요. 뉴런 마스크는 실행마스크 파일 세트, 즉 소마 마스크 파일을 가리킵니다." 참고: 모든 소마 마스크 파일을 Neurite 마스크 파일과 별도로 함께 실행하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.</li>
	<li>분석할 각 뉴런에 대한 마스크 파일의 .csv 읽습니다.</li>
	<li>추가 neuron_mask_n+1을 복사하여 한 번에 여러 파일을 실행합니다. 이렇게 하면 섹션 8에 설명된 스크립트를 사용하여 Ripley의 분석을 함께 집계할 수 있습니다.</li>
	<li>이제 두 번째 변수인 "neuron_datapoints"을 확인합니다.</li>
	<li>읽어보십시오." X_fluorescent_traces.csv"파일은 외식 이벤트의 x, y, t 위치뿐만 아니라 2D 네트워크에 대한 x,y 위치의 neurite 특정 파일과 함께 분석 프로그램 (모든 extracted_R 파일)에 의해 생성됩니다. 이것은 "neuron_datapoints" 위치에 간다.</li>
	<li>RStudio에서 코드 | 선택 실행 지역 | 모든 실행. 이렇게 하면 그룹화된 Ripley의 K 값과 밀도 플롯을 비롯한 여러 플롯이 생성됩니다.</li>
	<li>| 내보내서 플롯 저장 이미지 저장 | 적절한 이미지 형식과 디렉토리를 선택하고 적절한 파일 이름을 입력한 다음 저장을 클릭합니다. 참고: 히트맵의 플로팅 함수는 "플롯(밀도(soma_data,0.4)"을 사용하여 스크립트에서 호출됩니다. 여기서 "0.4"는 밀도 함수가 얼마나 부드럽게 되어야 하는지 나타냅니다. 사용자 데이터에 의미 있는 방식으로 맞게 변경할 수 있지만 다른 히트맵 간에 비교를 수행해야 하는 경우 그 사이에 숫자가 같아야 합니다.</li>
	<li>
Rstudio에서 이미지를 내보내거나 저장합니다. 히트맵에 추가 편집이 필요한 경우 적절한 파일 유형(SVG 또는 EPS)을 선택합니다.</li>
</ol>8. 리플리의 분석
참고: Ripleys_k_analysis. R 파일은 또한 자동으로 리플리의 k 값 플롯을 생성. 전체 스크립트를 실행하면 아래에 언급된 함수가 자동으로 실행되지만 스크립트의 각 부분을 개별적으로 실행하거나 분석을 변경하려는 경우 자세히 포함됩니다.
<ol><li>먼저 각 셀에 대한 봉투 함수를 실행합니다. 이 함수는 완전한 공간 임의성(CSR)을 시뮬레이션하여 리플리의 K 값에 대한 외식 이벤트 포인트 패턴을 테스트했습니다. Data_envelope_1 = 봉투(soma_data_1, 키스, nsim = 19, 세이브펀 = TRUE) Data_envelope_2 = 봉투(soma_data_2, 키스, nsim = 19, 세이브펀 = TRUE)</li>
	<li>다음으로 이러한 봉투를 함께 풀을 짜고 그룹에 대한 CSR 추정치하나를 만듭니다. Pool_csr = 풀(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) 그런 다음 모든 데이터 포인트에 대해 Ripley의 K 함수를 실행합니다. Data_ripleys_k_1 = 키스 (soma_data_1, 비율 = TRUE) Data_ripleys_k_2 = 키스 (soma_data_2, 비율 = TRUE)</li>
	<li>완료되면 리플리의 K 값을 함께 풀링하고 다음 명령으로 자신감 간격을 부트스트랩합니다. 데이터 풀 = 풀(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>다음 명령이 있는 부트스트랩: Final_Ripleys_K = varblock (재미 = 키스, Data_pool)</li>
	<li>데이터를 플롯합니다.</li>
	<li>통계적 차이가 어려운 경우 학생 순열 테스트가 스패츠스타트 패키지에 포함되어 포인트 패턴 그룹 간의 차이를 테스트합니다. Test_difference = studpermu.test (all_points_to_test, exocytic_events ~ 그룹, nperm = np).</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것을 선언하지 않습니다.

외식 감지 및 분석 소프트웨어를 사용하는 경우 프로그램은 무손실 압축 .tif 파일만 입력으로 수락한다는 점을 고려하십시오. .tif 이미지 파일은 8비트, 16비트 또는 32비트 그레이스케일(단일 채널) 이미지일 수 있습니다. 다른 이미지 형식은 입력하기 전에 이러한 유형 중 하나로 변환해야 합니다. 참고로 여기에서 사용되는 예제는 16비트 회색 크기 이미지입니다.
자동 감지 프로세스에 내재된 타임랩스 이미지 세트는 자동화된 배경 감속 및 광표백 보정을 위해 처리됩니다. 배경 빼기의 경우 마스크 파일의 마스크 영역 외부의 픽셀은 전체 이미지의 시간 경과에 따라 평균되며 평균 값은 이미지 집합에서 빼됩니다. 포토표백 보정의 경우, 모노 지수 부패 핏이 비디오 의 과정을 통해 마스크의 평균 형광에 적용되며 수정된 강도는 다음과 같이 조정됩니다.
보정 강도 = (시간에 강도 t) ÷ exp-k×t 어디 k = 붕괴 상수
<p ...

VAMP-pHluorin 구조 또는 트랜스프레린 수용체(TfR)-pHuji 구조는 이러한 pH 민감형 형광류가 소포와 혈장 멤브레인1사이의 융합 모공 개구 시 즉시 산 소포 루멘 및 형광 내에 담금질되기 때문에 외세포 현상의 우수한 마커이다. 퓨전 모공 개구부에 이어 형광은 기하급수적으로 부패하며 융합 이벤트에 대한 정보를 드러내는 이질성도가 있습니다. 여기서, 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 응용 프로그램은 자동으로 외세포 이벤트를 감지하고 분석하는 설명입니다. 이 응용 프로그램은 사용자가 자동으로 pH 민감한마커에 의해 공개 엑소시틱 이벤트를 감지 할 수 있습니다 2 분류 목적 에 사용할 수있는 각 이벤트에서 기능을 생성(그림 1A). 또한, 리플리의 K 함수를 이용한 외식 이벤트 클러스터링의 분석이 설명된다.
다른 외세포 모드로 외세포 이벤트의 자동화 된 분류는 최근보고되었다3. 엑소시토시스의 두 가지 모드, 풀 소포 융합(FVF) 및 키스 앤런 융합(KNR) 엑소시토시스는 이전에4,5,6,7로설명되었다. FVF 동안, 융합 모공팽창, 및 소포는 플라즈마 멤브레인에 통합된다. KNR 동안 융합 공공은 일시적으로 열리고4,5,8,9,10을다시 밀봉합니다. 4가지 엑소시토시스 는 뉴런 개발에서 확인되었으며, 2개는 FVF와 관련이 있으며 KNR과 관련된 2가지. 이 작품은 FVF와 KNR 모두 형광 붕괴가 시작되기 전에 융합 모공 개구(FVFd 및 KNRd)(도 1B)가시작되기 전에 융합 모공 개구 후 지연을 나타내는 융합 모공 개구 또는 외세포 이벤트 후 즉시 형광 붕괴(FVFi 및 KNRi)로 진행되는 융합 이벤트로 더욱 세분화될 수 있음을 보여준다. 분류자는 각 융합 이벤트에 대한 외세포증 모드를 식별합니다. 이 분석은 Windows 및 Mac 기반 운영 체제의 MATLAB에 설치할 수 있는 GUI에 통합되었습니다. 모든 분석 파일은 https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing 또는 https://github.com/GuptonLab.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>R</td><td>R Core 팀</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

엑소시토시스의 자동 검출 및 분석

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

소포 SNARE 단백질에 부착된 pH-민감한 GFP(pHluorin)의 타임랩스 TIRF 현미경 검사는 세포 배양에서 단일 소포 외세포 이벤트를 시각화하는 효과적인 방법입니다. 이러한 이벤트에 대한 편견없고 효율적인 식별 및 분석을 수행하기 위해 MATLAB에서 컴퓨터 비전 기반 접근 방식을 개발하고 구현했습니다. 분석 파이프라인은 셀 세분화 및 외식 이벤트 식별 알고리즘으로 구성됩니다. 컴퓨터 비전 접근법에는 형광 부패및 피크 ΔF/F의 반감기를 비롯한 단일 이벤트의 여러 매개 변수를 조사하는 도구뿐만 아니라 외세포증 주파수의 전체 세포 분석을 포함하는 도구가 포함되어 있습니다. 이러한 융합의 매개 변수및 기타 매개 변수는 뚜렷한 융합 모드를 구별하기 위한 분류 접근 방식에 사용됩니다. 여기서 새로 구축된 GUI는 처음부터 끝까지 분석 파이프라인을 수행합니다. R Studio에서 Ripley의 K 기능을 추가로 조정하여 공간과 시간 모두에서 클러스터, 분산 또는 임의의 융합 이벤트를 구별하는 데 사용됩니다.

여기서GUI(그림 2A)는TIRF(총 내부 반사 형광) 현미경을 사용하여 3DIV에서 뉴런을 발현하는 3개의 VAMP2-pHluorin으로부터 의 외세포 이벤트를 분석하는 데 활용되었다. E15.5 피질 뉴런은 격리되었고, 그 다음으로 VAMP2-pHluorin과 함께 트랜스페팅및 윙클 등에서 설명된 프로토콜을 이용한 도금 및 도금에 의해 2016년 및 비셀만 외, 20111년11,12. 이미징 매개 변수의 방법론은 Urbina 외, 20182에설명된 대로 설명되어 있습니다. 간단히, TIRF 현미경 검사는 2 분 동안 100 ms마다 뉴런의 기저 플라즈마 멤브레인을 이미지하는 데 사용되었다. <strong class="xf...

pH 에 민감한 형광 프로브로 표시된 외식 이벤트를 감지하기 위해 자동화된 컴퓨터 비전 소프트웨어를 개발했습니다. 여기서는 그래픽 사용자 인터페이스와 RStudio를 사용하여 융합 이벤트를 감지하고, 융합의 현면 파라미터를 분석하고 표시하며, 이벤트를 고유한 융합 모드로 분류합니다.

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

엑소시토시스 소프트웨어의 자동 검출 및 분석을 통해 사용자는 pH 에 민감한 형광의 외세포 이벤트 및 TIRF 이미지 시퀀스를 자동으로 감지할 수 있습니다. 또한 공간 분포 나 주파수와 같은 외세포증의 특징뿐만 아니라 반감기 또는 배경에 따른 형광 변화와 같은 외세포 이벤트의 개별 특성을 자동으로 출력합니다. 또한, 이전에 문학에 설명된 외세포증의 네 가지 모드로 외세포 이벤트를 분류하는 옵션이 포함되어 있습니다.Exocytosis 소프트웨어의 자동 감지 및 분석을 사용하기 위해 먼저 데이터 집합 찾기 버튼을 클릭하고 데이터가 증착된 곳으로 이동하면 원시 데이터라는 폴더에 넣으십시오. 데이터 파일은 여기에서 목록을 자동으로 채우고 이 폴더에 데이터 파일 수를 가질 수 있습니다. 다음으로 분석 파일이 입금되는 디렉토리를 선택해야 합니다.여기서 테스트라는 디렉토리를 선택했습니다. 픽셀 크기뿐만 아니라 이미지의 프레임 속도를 입력해야 합니다. 여기에 내 프레임 속도는 프레임 당 백 밀리초, 내 픽셀 크기는 8 나노 미터입니다.마지막으로, 엑소시토시스 소프트웨어의 자동 탐지 및 분석을 실행하려면 마스크 파일이 필요합니다. 포함된 마스크 메이커 버튼을 사용하여 데이터 파일에서 마스크 파일을 자동으로 생성할 수 있습니다. 실행 표시기가 노란색으로 바뀌고 마스크 메이커가 실행이 완료되면 녹색으로 돌아갑니다.마스크는 선택한 디렉터리에서 마스크 파일이라는 새 폴더에 보관됩니다. 그리고 마스크 파일은 자동으로 여기에 목록을 채웁니다. 마스크 파일이 데이터 파일에 맞게 이루어지고 있는지 확인하고 목록의 데이터 파일과 해당 마스크 파일을 강조 표시하여 이 작업을 수행할 수 있습니다.데이터 파일의 첫 번째 프레임이 표시되고 선택한 마스크 파일도 표시됩니다. 여기. 우리는 우리의 마스크 파일이 손에 분석에 적합한 것을 볼 수 있습니다. 마스크 파일은 사용자가 별도로 제공할 수도 있습니다.현재 데이터 파일에서 마스크 파일을 만들고자 하는 경우 이미지 J.In 순서를 사용하여 마스크 파일을 만들려는 이미지 J에서 먼저 이미지를 엽니다. 그런 다음 다각형 선택 도구를 사용하여 셀 가장자리를 클릭하여 마스크 파일 만들기를 시작할 수 있습니다. 마스크를 완료한 경우 전체 다각형에 연결하려면 두 번 클릭합니다.이 작업이 완료되면 편집, 선택 및 마스크 만들기로 향합니다. 반전된 마스크가 만들어집니다. 데이터 파일과 동일한 이름을 사용하여 이 마스크 파일을 저장한 다음 _mask_file 저장하려고 합니다.이제 사용자 지정 마스크 파일을 제공하는 경우 자동 검색 소프트웨어에 해당 마스크 파일이 있는 위치를 알려주는 것이 중요합니다. 이렇게 하려면 마스크 파일 찾기 버튼을 클릭하고 마스크 파일이 있는 디렉토리로 이동합니다. 그런 다음 새 마스크 파일이 목록을 여기에 채웁니다.분석을 실행하기 전에 모든 단일 데이터 파일에 대한 마스크가 있어야 합니다. 이제 데이터 집합이 로드되고 마스크 파일, 프레임 속도 및 픽셀 크기가 올바르게 조정되고 선택한 디렉터리가 완료되면 마지막으로 분석의 일부로 분류를 포함할지 여부를 결정할 수 있습니다. 분류 버튼을 전환하면 외식 이벤트를 감지하는 것 외에도 각 외식 이벤트는 4개 클래스 중 하나로 분류됩니다.분석 실행 방법을 결정한 후 분석 단추를 클릭하여 분석을 시작할 수 있습니다. 실행 표시기는 노란색으로 전환되어 분석이 진행 중임을 나타내고 분석이 완료되면 녹색으로 돌아갑니다. 분석이 완료되면 실행 표시기에서 노란색에서 녹색으로 변경되는 대로 선택한 디렉터리 내에 새 데이터 파일 폴더가 나타났습니다.데이터 파일 폴더 내에서 분석 실행의 각 이미지에 해당하는 분석 파일을 찾을 수 있습니다. 또한, 각 이미지 세트에 대한 외세포증의 빈도와 같은 요약 정보를 포함하는 셀 통계 파일이 여기에 있다. 각 이미지 집합에 대해 X 위치, Y 위치 및 외식 이벤트가 발생하는 위치에 대한 프레임 번호에 대한 정보가 포함된 형광 추적 파일이 있습니다.또한, 각 외세포 이벤트 주변의 관심 영역의 평균 형광은 외세포증 전, 도중 및 이후에 모두 제시된다. 또한 X, Y 및 측두식 위치의 유사한 정보를 포함하는 추적 파일도 있습니다. 그러나 분류 확인란을 선택하면 4개의 클래스 중 하나에 속하는 외식 이벤트의 가능성을 나타내는 4개의 추가 열이 있습니다.전체 소포 퓨전 순간, 전체 소포 융합 지연, 키스 앤 런 순간, 또는 키스 앤 런 지연. 외세포 이벤트는 0.5보다 크고 관제된 4개 클래스 중 가장 높은 확률인 경우 4개 클래스 중 하나에 속합니다. 이 경우, 여기서 첫 번째 외식 이벤트는 전체 소포 융합 인스턴트 클래스에 속하며, 이는 4개 클래스보다 높은 수이며 0.5보다 크다.또한, 각 이미지 세트에 대한 다른 피쳐 파일이 많이 있는데, 이는 외세포증의 분류 중에 사용되며 추가 분석을 위해 관심을 가질 수 있다. 마지막으로, 외세포증의 공간 적 정수 조직을 감지하기 위해 Ripley의 K 분석을 사용하려면 먼저 마스크 파일을 중성염 마스크 파일과 소마 마스크 파일로 분할하여 시작합니다. 이미지 J.We에서 마스크를 먼저 열어 백그라운드 픽셀을 선택하려면 색상 피커를 사용하려고 합니다.그리고 이런 식으로 마스크 파일을 채울 때 올바른 값입니다. 다음으로 다각형 선택 도구를 사용하고 체세포 영역을 간략하게 설명합니다. 이제 이 작업을 위해서는 약간의 주관적인 수동 의사 결정이 필요합니다.우리는 거친 타원을 제안합니다. 완료되면 편집, 선택 및 마스크 만들기로 이동합니다. 마지막으로, 원래 마스크 파일로 돌아와 편집하고 채우기를 사용하여 소마를 채우고, 이제 별도의 neurite 및 soma 마스크 파일을 가지고 있습니다.당신이 당신의 별도의 neurite 및 소마 마스크 파일을 저장한 후, 여기에, 나는 마스크 파일이 neurite에 대한 neur를 강조하고 소마를 강조로, 우리는 MATLAB에 와서 neurite 2D 네트워크 MATLAB 파일을 엽니 다. 여기에서 현재 폴더를 탐색하여 모든 분석 데이터를 증착한 디렉터리로 이동합니다. 일단 우리가 그것을 완료 하면, 우리는 다음 우리의 새로운 마스크 파일의 마스크 이름 경로 변경 됩니다., neurite.그래서이 경우, 나는 마스크 파일 폴더 아래에 내 neurite 마스크 파일이 있습니다. 그런 다음 CSV 파일 이름을 형광 추적 파일이 있는 곳으로 변경합니다. 이 경우 데이터 파일 폴더에 남아 있으므로 데이터 파일이 슬래시되고 형광 추적 CSV 파일의 이름이 있습니다.완료되면 실행을 실행할 수 있습니다. 그러면 neurite 마스크 파일의 골격 버전을 만들고 마스크 파일 폴더 아래에 CSV 파일로 입금하여 여기에서 볼 수 있습니다. 다음으로 소마에 대한 CSV 파일도 생성합니다.이렇게 하려면 CSV 마스크 작성자 파일을 엽니다. 소마 마스크의 경로와 CSV 파일을 만들 이름을 입력할 수 있습니다. 여기 그냥 가서 바로 점 CSV추가와 같은 정확한 파일 이름을 사용했다.실행중이며, 뉴라이트와 함께 새 소마 CSV 파일이 생성되었음을 알 수 있습니다. 중성염 마스크와 소마 마스크 모두에 대한 CSV 파일을 만든 후에는 Ripley의 K 분석을 실행할 수 있습니다. 이렇게 하려면 R Studio로 이동하여 Ripley의 K 분석 R 파일을 엽니다.신경 마스크와 뉴런 데이터 포인트에 주의를 기울이기 위해 여기에 두 가지 주요 변수가 있습니다. 뉴런 마스크는 실행하려는 마스크 파일을 가리킵니다. 이 경우 먼저 소마 마스크 파일을 실행하고 있습니다.모든 neurite 마스크 파일과 별도로 모든 소마 마스크 파일을 실행하려고 합니다. 여기, 나는이 분석을 위해 사용할 두 개의 뉴런이 있습니다. 그러나 Ripley의 K 분석에 원하는 만큼 사용할 수 있으므로 이 코드를 복사하여 붙여 넣은 다음 뉴런 마스크에 대한 코드를 복사하여 붙여넣기하고 변수를 3으로 변경하고 그 이후로 변경하면 됩니다.두 번째 변수는 뉴런 데이터 포인트입니다. 여기에서 모든 추출된 R 파일을 피처에 의해 생성된 파일을 가리키려고 합니다. 이제 내 퓨전 통계라는 이름이 붙여졌으며, 이것이 여기에서 읽는 것입니다.언급 했듯이, 나는 우리가 함께 리플리의 K를 집계 할 수 있도록 함께 분석되고있는 두 번째 소마 마스크 파일과 뉴런이 있습니다. 이러한 경로를 올바른 경로로 변경한 후 코드를 사용하고 지역을 실행하고 모두 실행합니다. 실행이 완료되면 그룹화된 Ripley의 K 값과 밀도 플롯을 포함하여 여러 플롯이 생성됩니다.이러한 검색은 내보내기, 이미지 저장 및 적절한 이미지 형식, 디렉터리, 파일 이름 및 마지막으로 저장을 누르면 저장할 수 있습니다. 여기에서 우리는 TIRF 현미경 을 사용하여 체외에서 이틀에 심상광을 발현하는 12 murine 피질 뉴런에서 대표적인 결과를 봅니까. A에서는, 우리는 클래스로 분할 된 외세포증의 주파수를 참조하십시오.여기서 우리는 전체 소포 융합 즉시 다른 클래스보다 더 자주 발생하는 것을 볼 수 있습니다. B에서는 모드 분포를 볼 수 있어 전체 소포 융합이 모든 이벤트의 절반 이상을 차지한다는 것을 확인할 수 있습니다. C에서는 열맵으로서 외세포증의 공간 분포를 결정합니다.우리는 외식 사건의 대부분이 소마 근처의 핫스팟뿐만 아니라 중성염의 단부 끝에 클러스터되어 있음을 알 수 있습니다. D에서 우리는 외세포 사건이 통계적으로 현저하게 클러스터되고, 이 클러스터의 크기가 반 미크론에서 1개의 미크론 크기에 구역이 있다는 것을 결정할 수 있습니다. 자동화된 분석 프로그램을 사용하여 편견없는 방식으로 외세포 이벤트를 올바르게 식별하고 분석하면 분석 효율성이 향상되고 재현성과 엄격함이 향상됩니다.검출의 정확성을 보장하기 위해 이미징 중에 소음에 대한 높은 신호를 유지하는 것이 중요합니다. 외세포 이벤트 또는 기타 pH 에 민감한 일시적인 이벤트를 캡처하려면 모든 이벤트를 캡처하고 반감기 또는 형광의 피크 변화와 같은 추정을 개선할 수 있을 만큼 빠르게 이미징 주파수가 필요합니다. 우리는 이 프로그램이 뉴런 개발에서 pH에 민감한 형광을 정확하게 포착하기 위한 것이 아니라 다른 세포 유형도 효과가 있음을 입증했습니다.그러나 다른 세포 유형을 사용하는 경우 다른 세포 유형의 일시적인 이벤트의 뚜렷한 동작으로 인해 정확도의 차이를 확인하는 것이 중요합니다. 이 분류는 현재까지 뉴런 개발에만 사용되었습니다. 그리고 실제로 우리는 이 프로세스가 그밖 세포 모형또는 뉴런에 있는 나중에 발달 시간 점에 존재한다는 것을 모릅니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 비만 세포에서 외포작용(exocytosis)을 시각화하는 기술을 보여줍니다. 세포는 형광 리포터인 FITC-dextran으로 배양되며, 이는 산성 pH가 형광을 소멸시키는 분비 과립(SG) 내부의 세포에 의해 흡수됩니다. 과립 엑소사이토시스(granule exocytosis)가 자극되면 배지의 더 높은 pH는 융합된 SG 내부의 리포터 형광을 유도하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

비만 세포에서 분비 과립의 외세포작용(Exocytosis)을 시각화하기 위한 체외 기술(An In vitro technique to visualize exocytosis of secretory granules in mast cells)

Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

삼투성 스트레스에는이 과정을 발표 하는 신경 전달 물질의 양과 exocytosis 영향을 줍니다. 전송 전자 현미경 검사 법 함께 전기 화학 방법 결합 수 있습니다 사용 하는 방법을 exocytosis 활동, 소포 quantal 크기, 출시 하는 신경 전달 물질의 양과에 extracellular 삼투성 압력의 효과 연구 설명 동안 exocytosis.

분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

여기 우리는 규제 exocytosis의 라이브 셀 이미징 방법 선발. 이 메서드는 기자로 서 FITC-dextran, 리소좀과 관련 된 세포에 축적을 활용 합니다. 이 간단한 메서드는 또한 유전자 조작 하기 어려운 셀에 규제 exocytosis의 다른 모드 사이 구별 수 있습니다.

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

미세 패턴 세포에 리소소피 외세포증의 라이브 이미징이 이 과정의 공간 적정화를 허용한다. 마이크로 패턴을 이용한 형태 학 정상화는 세포 프로세스의 공간 분포에 대한 일반적인 규칙을 발견하는 뛰어난 도구입니다.

마이크로 패턴 세포에서 세포 외세포증의 주당 측량 파라미터를 정량화

이 프로토콜은 막 에바인딩 exophers의 형태로 C. elegans 세포에 의해 생성된 큰 골체 및/또는 세포기관 압출(~4 μm)의 검출 및 수량에 대한 접근 법을 설명합니다. 우리는 이 파편 추방 기계장치의 해부를 용이하게 하는 데 필요한 긴장, 성장 조건, 채점 기준, 타이밍 및 현미경 고려 사항을 설명합니다.

C. 예르간에서 큰 Exopher 소포에서 생체 신경 골집 및 세포구 압출에서 득점에 대한 정량적 접근

배우세요 TIRF 현미경 영상에서 엑소시토시스 사건을 자동으로 검출하고 분석하는 MATLAB 기반 컴퓨터 비전 파이프라인을 사용하는 방법. 이 소프트웨어는 네 가지 융합 모드로 사건을 분류하고 R Studio에서 Ripley's K 함수를 통해 시공간적 군집화를 평가하여 세포 생물학 연구의 재현성과 객관성을 향상시킵니다.

엑소시토시스의 자동 검출 및 분석

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