Name: 형광 활성화 핵 분류를 사용하여 신선 냉동 피질로부터 성인 인간 성상세포 집단의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 학습하세요 형광 활성화 핵 분류(FANS)를 사용하여 신선 냉동 인간 피질 조직에서 성인 성상세포 핵을 분리하고 정제하는 방법을. 이 기술은 전사체학 및 염색질 가용성 연구를 위한 고순도 세포 집단을 제공합니다.

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우리는 마운트 시나이 (Mount Sinai)의 이칸 의과 대학 (Icahn School of Medicine)의 병리학 및 신경 외과 회원들에게 비 식별 뇌 조직 조달과 ISMMS의 유세포 측정 CORE에 대한 전문가의 조언을 구해 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (N.M.T.), R61DA048207 (S.A.까지)에 의해 부분적으로 자금을 지원받았다.

참고 : 마운트 시나이 (ISMMS)의 이칸 의과 대학 (ISMMS)과 기관 검토위원회 (IRB)의 인간 과목 보호 프로그램은 연구의 윤리적 행위와 연방, 주 및 기관 규정 준수를 보장합니다. 이 연구에서, 사용된 모든 사후 표본은 비식별화되었고, 생물저장소를 통해 적절한 동의하에 획득되었으며, ISMMS의 IRB(HS#14-01007)에 의한 "인간 연구" 지정에서 면제되었다.
1. 완충액 준비
참고: 다운스트림 RNA 시퀀싱을 수행하는 경우 mRNA 분해를 방지하기 위해 RNase 오염 제거 솔루션으로 모든 작업 공간 및 도구를 철저히 처리하십시오.
<ol><li>용해 완충액을 준비하십시오.<ol>
<li>50 mL까지의 증류수H2O에 다음을 용해시킨다: 5.47 g의 수크로오스 (0.32 M 최종), 250 μL의 1 MCaCl2 (5 mM 최종), 150 μL의 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM 최종), 10 μL의 500 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) (0.1 mM 최종), 500 μL의 1 M 트리스-HCl (pH 8) (10 mM 최종), 50 μL의 트리톤 X-100 (0.1% 최종) 및 17 μL의 3 M 디티오트레이톨 (DTT, 1 mM 최종, 신선한 첨가) ( 물질의 표 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>수크로오스 버퍼 준비<ol>
<li>최대 50 mL의 증류된H2O에 다음을 용해시킨다: 30.78 g의 수크로오스 (1.8 M 최종), 150 μL의 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM 최종), 500 μL의 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM 최종), 17 μL의 3 M DTT (1 mM 최종, 신선한 첨가).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 동결된 조직을 단핵 현탁액으로 해리
<ol><li>빙냉 용해 완충액 4 mL를 7 mL 유리 조직 더서(grinder)에 첨가하고, 얼음 위에 보관하십시오. 신선하게 냉동된 인간 성인 피질 약 200-400 mg을 해부하고, 대략 50x를 더덕이고, 조직 균질액을 12 mL 초원심분리 폴리프로필렌 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>5 mL 피펫을 사용하여, 6.5 mL의 빙냉 수크로오스 완충액을 초원심분리 튜브의 바닥에 첨가하고, 수크로오스와 조직 균질물 사이의 층을 방해하지 않도록 주의한다. 참고: 추가 샘플을 처리하는 경우 더 가벼운 샘플에 용해 버퍼를 추가하여 튜브 중량의 균형을 조심스럽게 조정하십시오. 초원심분리 튜브의 정확한 균형은 로터의 손상을 방지하고 적절한 속도로 회전을 보장하는 데 필수적입니다.</li>
</ol>3. 초원심분리
<ol><li>용해물을 4°C에서 1시간 동안 24,400 rpm (101,814 × g)에서 초원심분리한다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액과 파편을 조심스럽게 흡인하십시오. 참고: 200mg 미만의 조직으로 시작하면 펠렛이 보이지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>600 μL의 포스페이트 완충 식염수 (PBS) (Ca2+,Mg2+ 무함유)를 핵 펠릿에 첨가하고, 재현탁하기 전에 10분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>핵 펠릿을 얼음 위에 재현탁시키기 위해 50 번 위아래로 피펫을 상하로 피펫하십시오.</li>
	<li>혈구 분석기를 사용하여 현미경으로 손상되지 않은 핵을 시각화하고 다음 단계로 진행하기 전에 재현탁물의 농도가 105 핵 / mL 이상인지 확인하십시오 (재현탁 된 핵 10 μL와 트리판 블루 10 μL를 결합).</li>
</ol>4. 항체 배양
<ol><li>FANS에 대한 샘플을 면역태그하기 위해, 500 μL의 재현탁된 샘플 펠렛, 490 μL의 1x PBS (Ca2+,Mg2+ 무함유), 10% BSA (0.1% 최종), 1 μL의 마우스 항-NeuN 항체 AF555에 접합된 (NeuN-AF555, 1:1000 최종 농도), 및 1 μL의 마우스 항-PAX6 항체 (PAX6-APC, 1:1000 최종 농도)를 첨가하였다. 참고: 다른 형광단에 접합된 대체 항체가 첨가될 수 있다 (논의 참조). 여기서, AF488에 접합된 마우스 항-OLIG2 (1:1000 농도)를 유리한 결과와 함께 사용하였다.</li>
	<li>필요에 따라 소량의 샘플을 사용하여 게이팅 파라미터를 설정하기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 전용 및 단색 제어를 수행합니다.<ol>
<li>AF555 단색 조절을 수행하기 위해, 20 μL의 재현탁된 샘플 펠렛, 970 μL의 1x PBS (Ca2+,Mg2+ 무함유), 10% BSA (0.1% 최종) 및 1 μL의 NeuN-AF555 항체 (1:1000 농도)를 첨가한다.</li>
		<li>APC 단색 조절을 수행하기 위해, 20 μL의 재현탁된 샘플 펠렛, 970 μL의 1X PBS (Ca2+,Mg2+ 무함유), 10 μL의 10% BSA (0.1% 최종), 및 1 μL의 PAX6-APC 항체 (1:1000 농도)를 첨가하였다.</li>
		<li>DAPI 전용 대조군을 수행하기 위해, 20 μL의 재현탁된 샘플 펠렛, 970 μL의 1X PBS (Ca2+,Mg2+ 무함유) 및 10 μL의 10% BSA (0.1% 최종)를 첨가한다 (DAPI는 나중에 첨가될 것이다, 4.4 참조). 참고: 두 개 이상의 항체를 사용하는 경우 단색 대조군 외에 형광-마이너스-원(FMO) 조절을 수행하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 및 대조군을 4°C에서 1 h 동안 어둠 속에서 회전하면서 인큐베이션한다.</li>
	<li>1:1000에 DAPI를 모든 샘플 및 컨트롤에 추가하고 정렬을 진행합니다.</li>
</ol>5. 형광 활성화 핵 분류 (팬)
참고 : 유세포 측정 / 분류 기술에 이미 능숙하지 않은 한 숙련 된 인력의 도움을 받아 기관 유세포 측정 시설을 사용하는 것이 좋습니다.
<ol><li>게이트는 아래와 같습니다.<ol>
<li>먼저, 각 샘플에 대해, 순방향 산란(FSC-A) 대 게이트에 의한 게이트 측면 산란(SSC-A)은 핵에 적합한 크기 범위의 입자를 포함하는데, 따라서 적혈구 및 파편을 배제한다(도 1A). 참고 : 매우 깨끗한 핵 준비는 더 작은 파편 클러스터와 핵 클러스터를 구별 할 수 있습니다.</li>
		<li>다음으로, 각 샘플에 대해, FSC-A 대 FSC-W(또는 FSC-A 대 FSC-H) 및 SSC-A 대 SSC-W(또는 SSC-A 대 SSC-H)에 의해 게이트하여 단일항 핵만을 포함한다(도 1B).</li>
		<li>다음에, 각 샘플에 대해, DAPI에 의한 게이트는 무손상 핵 일중항 (DAPI-고 게이티드 집단), 파편을 배제 (DAPI-낮은, 게이트 집단의 왼쪽에) 및 이중 (게이트 집단의 오른쪽에) (도 1C)을 포함한다.</li>
		<li>FACS 플롯에서 별개의 클러스터로 시각적으로 결정된 형광 제어를 기반으로 추가 게이팅을 설정합니다.<ol>
<li>DAPI 전용 대조군을 실행하여 항체가 없는 집단의 배경 염색을 결정한다(도 1D 및 도 2A).</li>
			<li>NeuN-AF555 전용 대조군을 실행하여 AF555에 대한 채널에서 NeuN+ 염색에 대한 컷오프를 확인하였다(도 2B).</li>
			<li>PAX6-APC 전용 컨트롤을 실행하여 APC 채널에서 PAX6+ 염색에 대한 컷오프를 확인합니다(그림 2C).</li>
			<li>더 많은 항체를 사용하는 경우 추가 단색 컨트롤을 실행합니다(그림 2D,E). 참고: 두 개 이상의 항체를 사용하는 경우, FMO 대조군은 모집단의 변화를 시각화하는 것이 좋습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>모든 컨트롤이 실행되면 NeuN+ 및 PAX6+ 컬렉션의 게이트를 설정된 임계값 이상으로 그립니다.<ol>
<li>뉴런을 수집하기 위해 NeuN+ 집단을 게이트한다(도 1E 및 도 2F).</li>
			<li>NeuN-집단으로부터 PAX6+ 집단을 게이트하여 성상세포를 수집한다(도 1E, F 및 도 2F).</li>
			<li>게이트하고 NeuN-PAX6-집단으로부터 추가적인 신경교세포 집단 (예를 들어, OLIG2+에 의해 여기에 나타낸 바와 같은 올리고덴드로세포 전구 세포)을 수집한다 (도 1F). 참고: 불분명한 집단으로 인해 유세포 분석 소프트웨어에서 적절한 게이팅 컷오프를 결정하는 것이 어려운 경우, 시각화되는 이벤트 수를 수정하는 것이 도움이 될 수 있습니다(FANS 플롯의 이벤트 수 증가 또는 감소).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>의도된 다운스트림 분석을 기반으로 적절하게 샘플을 수집합니다.</li>
</ol>6. 다운스트림 분자 분석을 위한 FANS 집단 수집
<ol><li>벌크 RNA 시퀀싱을 위해, PBS에서 50,000-500,000개의 핵을 수집한다(또한 섹션 7.1 참조).<ol>
<li>2 mL의 수크로오스 용액, 50 μL의 1 MCaCl2, 및 30 μL의 1 M Mg(CH3COO)2를 첨가하고, 10 mL까지의 PBS로 채운다.</li>
		<li>역전 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 10-15분 동안 900 × g 에서 원심분리한다.</li>
		<li>상청액을 흡인하고, RNA 추출 시약 1 mL에 재현탁시키고, 와류시키고, 드라이아이스 상에서 동결시키고, -80°C에서 저장한다.</li>
		<li>대안적으로, 샘플을 200 μL의 RNA 추출 시약 내로 직접 수집한다. 분류 후 RNA 추출 시약을 최대 1 mL까지 첨가하고, 분류된 샘플에 대한 시약의 1:1 비율을 유지한다. 소용돌이, 드라이 아이스 상에서 동결, -80°C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시퀀싱(ATAC-seq)을 이용한 트랜스포제-접근 가능한 크로마틴에 대한 벌크 분석을 위해, 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 코팅된 마이크로원심분리 튜브에서 PBS 중의 50,000-75,000 핵을 수집한다. 드라이 아이스 / -80 °C에서 핵을 동결하거나 즉시 ATAC 준비에 사용하십시오.</li>
	<li>sn RNA-seq 또는 ATAC-seq의 경우, PBS 중의 0.04% BSA에서 핵을 수집한다(또한 섹션 7.2 참조).</li>
</ol>7. 도서관 예비 준비 팁
<ol><li>벌크 핵 RNA 시퀀싱 라이브러리 준비<ol>
<li>RNA 추출 시약으로 수집 한 후 페놀 / 클로로포름을 첨가하고 에탄올로 상부 수층에서 RNA를 침전시켜 표준 페놀 / 클로로포름 RNA 추출을 수행 한 다음 튜브에서 DNase 소화 (15 분)를 수행하십시오.</li>
		<li>RNA 클린업을 수행하고 15 μL의 최종 부피의 물에 농축하십시오. 참고: 이 방법을 사용하여 성인 피질 샘플 300mg에서 회수되는 대표적인 방법은 ~300,000 NeuN+ 핵(정리 및 농축 후 총 RNA 15-20ng/μL)과 PAX6+ 핵(정리 및 농축 후 총 RNA 10-12ng/μL)이 ~250,000개입니다. 이 대표적인 수율은 샘플 품질, 게이팅 엄격성 및 RNA 회수에 따라 크게 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>정준 성상세포 마커(GFAP, SOX9), 10-포르밀테트라하이드로폴레이트 데하이드로게나제(ALDH1L1))의 높은 차등 발현과 뉴런 및 기타 세포계 마커의 고갈에 기초하여 성상세포의 농축을 확인하기 위해 시퀀싱 전에 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 수행한다(도 1G). 참고: 이중 음성 집단(NeuN-PAX6-)의 수집은 성상세포의 상대적 농축을 위한 보다 정확하고 다층적인 qPCR 품질 관리 분석을 가능하게 합니다(그림 2H).</li>
		<li>사후 샘플에서 예상한 바와 같이 낮은 RNA 무결성 수 값에 권장되는 키트를 사용하여 RNA-seq 라이브러리를 생성합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단일 핵 시퀀싱 라이브러리 준비<ol>
<li>기관 시퀀싱 코어를 통해 sn 시퀀싱을 수행합니다.</li>
		<li>나노유체 기반 처리 및 시퀀싱의 경우, 단일 핵 RNA-시퀀싱(snRNA-seq)의 경우 1x PBS + 0.04% BSA의 최소 60μL에 1 ×× 106 세포/ mL의 권장 농도를 사용하고, 1x PBS + 0.04% BSA의 최소 20 μL에서 106 세포/mL의 권장 농도를 1x PBS + 0.04% BSA로 시퀀싱(snATAC-seq)을 사용한 트랜스포자제-접근 가능한 크로마틴에 대한 단일 핵 분석의 경우 0.04% BSA를 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42(2008).</li>
<li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PsychENCODE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914(2008).</li>
<li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li>
<li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70(2015).</li>
<li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurogenesis-controlling+factor%2C+Pax6%2C+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li>
<li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li>
<li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6%3A+25th+anniversary+and+more+to+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li>
<li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li>
<li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue%3A+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li>
<li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+%CE%B1A%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li>
</ol>

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개략적인 프로토콜에 따른 실험 설계는 몇 가지 생물학적 및 기술적 요인을 고려한 후에 마무리되어야 한다. 출발 조직 샘플은 신선-고정되지 않고 신선하게 동결되고, 바람직하게는 핵 회복을 최대화하기 위해 짧은 사후 수집 간격을 갖는다. 경험에 비추어 볼 때, 최대 24 시간의 PMI는 적절한 핵 회복을 가능하게합니다. 그러나, 12 h 이하의 PMI는 무손상 핵 회복을 최적화하기 위해 바람직하다. 신체 저장 온도 및 조직의 pH 수준을 포함하는 PMI를 제외한 추가 인자는 또한 핵 수율에 영향을 미칠 수 있지만, 이들 연구14에서는 설명되지 않았다. 일화적인 경험으로부터, FANS 회복은 -80°C에서 5년까지 저장되는 동일한 조직과 필적하는 것으로 밝혀졌지만, 세포형 특이적 발현에 대한 저장의 가변성을 평가하기 위해 제어된 실험은 수행되지 않았다. 항체 인큐베이션 후 샘플을 세척하는 것은 고려가 필요할 수 있는 또 다른 변수이다. 일반적으로, 세척 단계는 전체 수율을 감소시키지만, 별개...

인간 성상세포의 분자 복잡성은 일차 조직에서 제대로 정의되지 않은 상태로 남아 있으며, 건강과 질병 모두에서 고해상도로 분리 및 특성화를위한 더 나은 도구가 필요합니다. 손상되지 않은 인간 뉴런과 글리아를 틈새 시장으로부터 분리하는 것은 신선한 뇌 조직 샘플의 제한된 접근, 신경교 및 신경 세포의 심하게 상호 연결된 특성, 처리 중 필연적 인 세포 활성화로 인해 어려운 것으로 입증되었으며, 이들 모두는 이러한 세포 유형의 분자 특성화를 제한합니다 생체 외1 . 형광 활성화 핵 분류 (FANS)는 살아있는 세포 분류의 대안으로 등장하여 동결 된 조직에서 핵 집단의 해리 및 면역 태깅을 가능하게합니다. 지난 10 년 동안 FANS는 다양한 뇌 표본 및 해부학 적 영역1,2,3,4에서 인간 신경 (NeuN +) 핵 집단을 분리하고 분자적으로 특성화하는 데 널리 사용되었습니다.
그러나, 인간 피질로부터 특정 신경교세포 하위집단을 분리하기 위한 유사한 방법들이 제한되어, 정상 및 병든 조직 둘 다에서 성상세포 복잡성에 대한 이해에서 정교함의 상대적 부족으로 이어졌다. 이를 위해, 이전에 발표된 프로토콜이 FANS4를 사용하여 인간 뉴런 집단을 단리하기 위해 채택되었고, 삼중-항체 조합을 사용하여 성상세포(및 올리고덴드로아교세포 전구인자)를 풍부하게 하는 방법이 검증되었고, 휴지 및 반응성 조건 모두에서 성상세포를 포획하였다5. NeuN-분획에서 성상세포에 대해 특이적으로 농축하기 위해, 성상세포 집단에 걸쳐 차등적으로 발현되는 것으로 알려진 두 개의 전사 인자 중 하나인 PAX6 또는 SRY-box 전사 인자 9 (SOX9)6,7에 대한 항체를 사용하였다. PAX6는 발아 영역에서 방사상 신경교세포 유사 전구물질 내에서 초기 태아 발달 동안 고도로 발현되며, 신경발생 및 교형성8,9,10,11 뿐만 아니라 망막 신경세포 사양 12에도 기여한다. 성인에서, PAX6는 휴지 인간 성상세포(6)에서 차별적으로 과발현되고, 인간 간질 조직 성상세포(13)에서 신경교모세서 산성 단백질(GFAP)과 단백질 공동발현을 나타낸다.
이 프로토콜은 FANS에 의한 신피질 뉴런 및 성상세포 풍부 핵 집단의 동시 분리를 기술한다. 성인 피질로부터 수집된 신선한(고정되지 않은) 스냅-냉동(즉, 신선한-냉동된) 사후 조직은 먼저 기계적으로 그리고 화학적으로 해리된다. 수크로오스 구배에서 용해 및 초원심분리 후, 핵이 유지되는 동안 세포질 및 세포외 성분은 폐기된다. 그런 다음 핵을 원하는 표적 혈통에 상응하는 형광 접합된 핵 항체로 표지하고 FANS를 사용하여 분류한다. 이 접근법에 따라, 성상세포의 농축은 수집된 PAX6+NeuN-집단에서 입증되며, 표적화된 qPCR 패널뿐만 아니라 하류 핵 RNA 시퀀싱에 의해 모두 검증된다.

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>70013073</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td><td>형</td><td></td><td>광 화합물 AF555에 접합된 MAB377A5MI 마우스 anti-NeuN (여기, 553 nm; 방출, 568 nm)</td></tr><tr><td>ANTI-OLIG2 항체 클론 211</td><td>형</td><td>광 화합물 AF488 MABN50A4MI에 접합된 마우스 anti-OLIG2 (여기, 499 nm; 방출, 520 nm)</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Counting Chamber</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110V</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 무수</td><td>Fisher</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기, 40 &마이크로; M</td><td>SP Scienceware</td><td>136800040</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA 라이브러리 키트</td><td>Illumina, Nextera</td><td>FC-121&ndash; 1030</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 조직 분쇄</td>기 <td>WHEATON</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>FACS 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD FACSAria III</td></tr><tr><td>마그네슘 아세테이트 테트라하이드레이트</td><td>Fisher</td><td>M13-500</td><td></td></tr><tr><td>PAX6 (PAX6/496) - 100 테스트</td><td>Novus</td><td>NBP234705J</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrator</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635005</td><td>낮은 RIN RNA 값에 권장되는 단편화 시간 2.5분.</td></tr><tr><td>설탕, 크리스탈 인증, ACS, 500mg</td><td>Fisher</td><td>S5500</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti 스윙 버킷 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, 1M 용액, pH 8.0, 분자 생물학 등급, 초순수</td><td>Thermo Scientific</td><td>J22638AE</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td>비이온 계면활성제 용해 완충액</td></tr><tr><td>TRIzol LS 시약</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>15596026</td><td>RNA</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter Optima XE-100</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 PP 9/16 X 3-1/2</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 증류수( RNAse-, DNAse-free)</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>증류수</td></tr><tr><td>초순수 EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr>이라고 합니다</tbody></table>.

형광 활성화 핵 분류를 사용하여 신선 냉동 피질로부터 성인 인간 성상세포 집단의 분리

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

인간 성상세포의 복잡성은 일차 인간 조직에서 제대로 정의되지 않은 상태로 남아 있으며, 격리 및 분자 특성화를위한 더 나은 도구가 필요합니다. 형광 활성화 핵 분류(FANS)는 동결된 보관 조직에서 인간 뉴런 핵(NeuN+) 집단을 성공적으로 분리하고 연구하는 데 사용할 수 있으므로 신선한 조직 취급과 관련된 문제를 피할 수 있습니다. 그러나, 유사하게 비신경세포(NeuN-) 요소로부터 아스트로아교세포를 분리하려는 노력은 결여되어 있다. 최근에 개발되고 검증된 면역태깅 전략은 세 개의 전사인자 항체를 사용하여 농축된 뉴런(NeuN+), 성상세포(쌍을 이룬 박스 단백질 6(PAX6)+NeuN-) 및 희소돌기아교세포 전구세포(OLIG2+NeuN-) 핵 집단을 병에 걸리지 않은, 신선한(고정되지 않은) 스냅 냉동 사후 인간 측두엽 신피질 조직으로부터 동시에 분리한다.
이 기술은 원발성 병리학적 간질 신피질에서 세포 유형 특이적 전사체 변경의 특성화에 유용한 것으로 나타났다. 전사체 분석은 PAX6+NeuN-분류된 집단이 범성상세포 마커에 대해 견고하게 풍부해지고 휴식 및 반응성 조건 모두에서 성상세포를 포획한다는 것을 확인했다. 이 논문은 단일 핵 (sn) 현탁액으로의 조직 해리를 포함하여 신선하고 냉동 된 인간 피질로부터 성상 세포가 풍부한 핵 집단을 분리하기위한 FANS 방법론을 설명합니다. 항-NeuN 및 항-PAX6 형광 접합된 항체를 사용한 핵의 면역태깅; 분류 중 민감도와 특이성을 최적화하고 성상세포 농축을 확인하기 위한 FANS 게이팅 전략 및 품질 관리 지표; 그리고 대량 또는 sn 해상도에서 다운스트림 전사체 및 크로마틴 접근성 시퀀싱에 대한 조달을 권장한다. 이 프로토콜은 다양한 병리를 가진 비 괴사성, 신선하고 냉동 된 인간 피질 표본에 적용 가능하며 24 시간 이내에 사후 조직 수집을 권장합니다.

핵은 12 h의 사후 수집 시간을 갖는 신선한(고정되지 않은) 스냅-냉동 측두엽 신피질 조직으로부터 수집되었다. 핵 현탁액 내로 조직을 해리시킨 후, 샘플을 NeuN, PAX6 및 OLIG2에 대한 항체와 함께 인큐베이션하고, 도 1 및 도 2에 도시된 게이팅에 따라 분류하였다. 핵은 NeuN+, PAX6+NeuN-, 및 OLIG2+NeuN-분류된 집단으로부터 수집되었다(도 1E, F 및 도 2F). 표적화된 qPCR 패널은 PAX6+(NeuN-) 집단에서 범성상세포 마커인 GFAP 및 ALDH1L1 에 대한 농축을 밝혀냈다(도 1G 및 도 2H). ...

우리는 하류 분자 분석에 사용하기 위해 인간 성상 세포 집단을 신선하게 냉동 된 조직으로부터 풍부하게하고 분리하는 방법을 개발했습니다.

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

이 프로토콜은 네이티브 틈새 시장에서 인간 성상 세포의 분자 기능을 연구하는 데 관심이있는 과학자들을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 활성화 핵 분류를 사용하여 벌크 인간 뇌 조직 표본으로부터 특정 세포 유형, 성인 성상세포의 분리 및 농축을 허용한다는 것이다. 이 방법론은 다른 적절한 형광-접합된 항체를 사용하여 뉴런 및 희소돌기아교세포 전구 세포와 같은 인간 신피질로부터 다른 세포 유형을 단리하는데 적용될 수 있다.신선한 냉동 인간 성인 피질 조직 샘플로부터 대략 200 내지 400 밀리그램의 조직을 해부하기 시작한다. 조직을 얼음 위에 얼음 차가운 용해 완충액 네 밀리리터가 들어있는 일곱 밀리리터 유리 조직 douncer에 넣고 조직을 약 50 번 갈아냅니다. 균질액을 12-밀리리터 초원심분리 폴리프로필렌 튜브로 옮긴다.5 밀리리터 피펫을 사용하여 6.5 밀리리터의 얼음처럼 차가운 수크로오스 버퍼를 수크로오스와 조직 균질물 사이의 계면을 방해하지 않고 초원심분리 튜브의 바닥에 첨가하십시오. 핵을 수집하기 위해, 용해물을 101, 814배 G에서 1시간 동안 초원심분리하고, 펠렛을 방해하지 않고 상청액 및 파편을 조심스럽게 흡인한다. PBS 중 0.1%BSA를 초원심분리 튜브에 첨가하여 핵 펠릿을 재현탁시키기 전에 얼음 상에서 10분간 인큐베이션한다.그런 다음 트리판 블루를 사용하여 광학 현미경으로 무손상 핵을 시각화하고 농도가 밀리리터 당 5 번째 핵보다 10 이상 있는지 확인하기 위해 분리 된 핵의 형광 활성화 분류를 위해 Alexa fluor 555 접합 마우스 항-NeuN 항체를 포함하는 항체 용액에 재현탁 된 샘플을 약 20 마이크로 리터를 첨가하십시오. 약 20 마이크로리터의 재현탁된 샘플을 APC 컨쥬게이션된 마우스 항-PAX6 항체를 함유하는 항체 용액에 첨가한다. 진탕으로 섭씨 네 도에서 1시간 배양한 후, 빛으로부터 보호하고, 모든 샘플 및 대조군에 1:1000 비율로 DAPI를 첨가한다.적절한 크기의 핵을 포함하고 적혈구와 파편을 배제하려면 제어 튜브를 사용하여 전방 및 측면 산란 영역으로 세포를 게이트하십시오. 일중항 핵 집단을 선택하려면, 전방 산란 영역 대 전방 산란 폭 또는 높이 및 측면 산란 영역 대 측면 산란 폭 또는 높이에 의한 게이트. DAPI에 의한 게이트는 손상되지 않은 핵 일중항 만 포함하고 파편과 이중을 배제합니다.임의의 추가적인 형광 대조군에 따라

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 새로 태어난 마우스에서 성상세포를 순수하게 제제하는 방법을 설명합니다.

성상세포 분리: 마우스 피질 성상세포의 순수한 준비를 얻는 방법

이 비디오는 다른 뇌 세포와 분리하여 쥐 성상세포를 배양하는 간단한 방법을 보여줍니다. 배양 중에 성상세포 특이적 배지를 사용하고 비성상세포 세포의 부착을 억제함으로써 이 방법은 성상세포를 선택적으로 배양합니다. 이러한 배양된 성상세포는 미세한 과정을 통해 성상 형태를 나타냅니다.

쥐 성상세포를 분리하고 배양하는 간단한 기술

이 동영상은 다양한 신경학적 응용을 위해 다양한 세포 집단을 연구할 수 있는 FANS(Fluorescence-activated nuclei sorting)를 사용하여 갓 냉동된 인간 뇌 조직에서 핵을 분리 및 분류하는 절차를 보여줍니다.

형광 활성화 핵 분류를 사용하여 뇌 조직에서 세포 집단 분리

Astrocytes 정상 뇌 개발 및 기능, 및 중앙 신경계 수리를 위해 필수적인 기초 생물학적 과정에 참여하는 다양한 세포로 인정되었습니다. 여기 중추 신경계 세포의 주요 클래스의 생물학을 연구하는 순수 마우스 astrocyte 문화를 얻기 위해 빠른 절차를 제시한다.

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

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향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

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Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

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여기서 우리는 출생 후 마우스의 중추 신경계의 다른 영역에서 유래 된 성상 세포의 고도로 농축 된 배양물을 생성하고 전사 인자의 강제 발현에 의해 기능적 뉴런으로 직접 전환시키는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

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성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

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형광 활성화 핵 분류를 사용하여 신선 냉동 피질로부터 성인 인간 성상세포 집단의 분리

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