Name: 폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 hiPSC에서 3D 폐 오르간노이드를 분화시키는 방법을. 이 기술은 폐 발달 및 질병을 체외에서 모델링하여 원발성 폐 조직 확보의 어려움을 극복하고, 유전자 돌연변이와 세포 독성 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 재생 의학에 대 한 캘리포니아 연구소에 의해 지원 되었다 (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

이 연구 프로토콜은 UCSD의 인간 연구 보호 프로그램 (181180)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 유도 만능 줄기 세포에서 최종 엔도드름 유도 (1 일 - 3)
<ol><li>천천히 해동 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 (BM) 매트릭스 배지 얼음에 30 분 전에 사용하기 전에. 감기 DMEM/F12에서, 혼합물은, GFR BM 매트릭스 배지를 희석시켜 이 매체의 50%를 구성한다. P1000 파이펫 팁을 냉동실에 놓아 사용하기 전에 식힙니다.</li>
	<li>얼음 차가운 DMEM/F12로 제조된 500 μL의 500 μL의 500 μL로 12웰 플레이트의 각 웰을 코팅합니다. 원하는 수의 우물이 코팅되면, 우물에서 여분의 중간 혼합물 및 /또는 거품을 제거하고 20 분 동안 얼음이나 냉장고에 접시를 놓습니다. 그런 다음, 접시를 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이터로 이동하여 겔화하고 건조시합니다.</li>
	<li>hiPSC가 70-90%의 연결성에 도달하면 해리 전에 10 μM의 Rho 관련 키나아제(ROCK) 억제제 Y-27632를 추가합니다. 매체를 흡기하고 인산염 완충식식염(PBS)으로 한 번 씻으세요. 세포 분리 배지(0.5mL/12웰 플레이트의 우물)를 첨가하여 hiPSC를 해리하고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 20분 동안 배양한다.</li>
	<li>인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에 줄기 세포 패세이징 배지(표 1)의 0.5mL/12웰을 추가합니다. P1000 팁을 사용하여 세포를 부드럽게 세분하여 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 15 mL 원심분리기 튜브로 해리된 세포를 전송; 원심 분리기는 300 x g에서 5 분 동안.</li>
	<li>10 μM ROCK 억제제(Y-27632)로 보충된 mTeSR Plus 배지의 1mL로 세포 펠릿을 흡인하고 재중단한다. 셀 수를 수행합니다. 12웰 GFR 지하 막 중간 코팅 플레이트의 웰 당 ROCK 억제제 Y-27632로 보충된 mTeSR 1mL에 2.0 x 105 hiPSC를 추가합니다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오. 참고: 셀 파싱 번호는 셀라인당 최적화되어야 합니다. 도금 후 24 시간, 우물은 50 %-70 % 컨할 수 있어야합니다.</li>
	<li>1일째에는 mTeSR 플러스를 흡권하고 인간 활성제 A의 100 ng/mL과 GSK3β 억제제/Wnt 활성제 CHIR99021의 5 μM으로 보충된 최종 엔도드름(DE) 유도 매체(표 1)를 첨가한다. 참고: GSK3β 억제제/Wnt 활성제 CHIR99021을 가진 DE 매체는 성공적인 분화를 위해 1DE 유도의 20-24 시간 이내에 제거되어야 합니다.</li>
	<li>2일과 3일째, 100 ng/mL의 활성제 A로 보충된 DE 유도 매체로변경합니다. 참고: DE 분화는 총 72h를 초과해서는 안되며 효능이 감소합니다. 4일째, 대형 세포 다이오프가 관찰되면 총 DE 미디어 노출 시간을 6-12h감소시.</li>
	<li>DE 효율을 분석하기 위해 FOXA2 및/또는 SOX17의 유동 세포측정 또는 면역 형광 분석을 통해 90% 이상의 CXCR4 및/또는 cKit 발현을 확인합니다(그림 2a).</li>
</ol>2. 전방 전구 배분 (AFE) 유도 (4 일 - 6)
<ol><li>4일째에는 AFE 유도용 10μM SB431542 및 2μM 도르소모핀으로 보충된 무분유 기저형(SFBM)(표 1)으로 배지를 변경합니다. 매일 AFE 미디어를 3일(일4일, 5일, 6일)에 변경합니다.</li>
	<li>AFE 효율을 분석하려면 면역 형광 염색 (도 2b)을 통해 SOX2, TBX1 및 FOXA2의 강력한 발현을 확인합니다.</li>
</ol>3. 폐 전구 세포 (LPC) 분화 (7 일 - 16)
<ol><li>7일째, 얼음 에 GFR 지하 막 매트릭스 배지를 해동. AFE 미디어를 흡입하고 1배 PBS로 잘 씻으세요. 세포 분리 용액 1mL을 추가하고 37 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>담금질 매체 1mL(DMEM/F12의 2% FBS)를 세포 분리 용액을 함유하는 우물에 추가합니다. 셀을 위아래로 부드럽게 배관하여 응집체로 유지합니다. 모든 세포가 15mL 원심분리기 튜브로 분리되어 전달되는지 확인하십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상체를 제거하고 인간 재조합 골 형태 호르몬-4(BMP4), 0.1 μM 의 모든 트랜스 망막산(RA), GSK3β 억제제/Wnt 활성제 CHIR99021, 및 10μM의 10μm-암분억제제로 보충된 담금질 매체에서 세포 펠릿을 재중단한다.</li>
	<li>셀 수를 수행합니다. 2.5 x 105 셀을 차가운 GFR 지하 막 매트릭스 배지의 100 μL에 넣고 잘 섞고 물방울을 12웰 플레이트의 우물에 놓습니다. 배지가 중합할 수 있도록 37°C에서 30-60분 동안 플레이트를 배양한다. 1mL의 LPC 미디어를 추가하여 10 μM의 ROCK 억제제 Y-27632를 잘 추가하여 중간 낙하가 완전히 침수되고 하룻밤 사이에 37°C에서 배양할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>LPC 유도 후 8, 24 시간, ROCK 억제제 Y-27632를 제거하기 위해 LPC 매체를 변경합니다. 총 9-11일 동안 LPC 배지를 격일로 변경합니다. 참고: 매체가 24시간 이내에 노란색이 되면 매일 매체를 변경합니다.</li>
	<li>LPC 효율을 분석하기 위해 세포내 전사 인자 NKX2-1의 견고한 발현을 확인하거나 표면 마커 CD47hi/CD26low15 또는 CPM18(도 2c)에 대한 유동 세포측정을 수행한다. 심하게, LPC 스페로이드는 둥글고 투명해야한다 (그림 2c). 참고: NKX2-1의 효율이 30% 미만인 경우 폐 오르간노이드 분화를 진행하지 마십시오.</li>
</ol>4.3D 폐 오르간성 유도 (16일 - 22일)
<ol><li>17일째, 얼음 위에 GFR 지하 막 매트릭스 배지를 해동합니다. LPC 유도 매체를 흡인합니다. 그런 다음 2 μg/mL의 디스파제(1mL)를 우물에 넣고 P1000 파이펫으로 중간/디스파제 혼합물을 다시 분리한다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 혼합물을 다시 트리튜트하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>디스파제와 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기다. 차가운 PBS (2-3 mL)를 사용하여 우물을 씻고 디스파스 / 셀 혼합물을 다시 중단하십시오. 원심 분리기는 400 x g에서 5 분 동안. 수동으로 중간 /세포 펠릿 층을 분리하지 않도록주의하여 상체를 제거하십시오. 차가운 PBS 세척을 반복하고 원심 분리기 튜브를 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
	<li>상체를 수동으로 제거한 다음 원추형 원심분리기 튜브에 트립신 기반 해리 솔루션 2mL을 추가합니다. 37°C에서 12분 동안 배양합니다.</li>
	<li>인큐베이션 후 P1000 파이펫 끝으로 셀을 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 원물 원심 분리기 튜브에 동일한 양의 담금질 미디어를 추가하고 5 분 동안 400 x g 로 회전합니다. 슈퍼칸트와 암석 억제제 Y-27632의 담금질 배지 + 10 μM에서 세포를 재흡입한다. 참고: 성공적인 폐 오르가노이드 유도는 세포가 단일 세포가 아닌 응집체로 내장될 때 발생하며, 그에 따라 파이펫팅을 조정합니다.</li>
	<li>셀 수를 수행합니다. 우물당 5.0-8.0 x 104 셀을 얻는 데 필요한 부피를 계산합니다. AliquotLPC 세포는 400 x g에서 5 분 동안 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브및 원심 분리기로 집계 됩니다. 세포 펠릿을 동요하지 않도록 주의하면서 과도한 상신제제거합니다. 잔류 용지의 10 μL만 둡니다.</li>
	<li>감기 GFR-지하 막 매트릭스 배지의 200 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포 배양 막 인서츠(직경 6.5mm, 0.4 μm 모공, 폴리에스테르 멤브레인)에 첨가한다. GFR-지하 멤브레인 매트릭스 배지가 중합할 수 있도록 37°C에서 30-60분 동안 플레이트를 배양한다.</li>
	<li>섬유아세포 성장 인자-7(FGF7) 7(10 ng/mL), FGF10(10 ng/mL), GSK3β 억제제/Wn으로 보충된 3D 오르간성 유도 매체(표 1)의 1mL추가 CHIR(3 μM), 표피 성장 인자(EGF) (10 ng/mL), 및 멤브레인 삽입의 바칼탈 챔버에 대한 ROCK 억제제 Y-27632의 10 μM. 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다.</li>
</ol>5.3D 폐 오르가노이드 분기 (23 일 - 28 일)
<ol><li>FGF7(10 ng/mL), FGF10(10 ng/mL), GSK3β 억제제/Wnt 액티비티어 CHIR9902로 보충된 3D 분기 매체(표 1)로 의 변경 11 (3 μM), RA (0.1 μM), EGF (10 ng/mL), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) / 태반 성장 인자 (PlGF) (10 ng/mL). 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다. 참고: 3D 분기 분화 분화의 6일째에는 여러 분기 오르가노이드가 있어야 합니다(그림 2).</li>
</ol>6.3D 폐 오르간성 성숙 (29 일 - 34 일)
<ol><li>29일째에는 3D 분기 매체와 동일하지만 덱사메타손(50nM), cAMP(100 μM), 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX), 인포디세라이제 억제제(IBMX) 및 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX) 및 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX) 및 3-이소비제세라이체 억제제(Ibutylxthin)의 첨가와 동일하여 3D 성숙 배지(표 1)로 변경한다. 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다. 참고: 3D 성숙 후 24시간 이내에 분기 오르가노이드가 투명 구체로 확장되고 변경되어야 합니다.</li>
</ol>7.3D 폐 오르간성 면역 세포 화학
<ol><li>3D 전체 폐 오르가노이드 분석을 위해, 4°C에서 1h에 대한 4% 파라포름알데히드(PFA)로 멤브레인 삽입물에서 GFR-지하 막 매트릭스 배지를 수정한다. 파라핀 왁스에 포함되고 표준 게시된 프로토콜당 슬라이드에 장착합니다.</li>
	<li>염색하기 전에 항원 검색을 수행합니다. 기도 마커는 KRT5, MUC5AC 및 SCGB3A2를 포함한다. 폐포 마커는 SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 및 HOPX(그림 3)를 포함한다.</li>
</ol>8. 통로, FACS 또는 냉동 보존을 위한 GFR 지하 막 매트릭스 배지에서 전체 폐 오르가노이드 제거
<ol><li>GFR-지하 멤브레인 매트릭스 배지에서 오르가노이드를 분리하려면 기저 챔버에서 미디어를 제거하고 apical 챔버에 2 μg/mL의 디스파스(1mL)를 추가한다.</li>
	<li>P1000 파이펫으로 중간/디스파제 혼합물을 부드럽게 세리팅하고 인큐베이터에 15분 동안 배치합니다. 혼합물을 부드럽게 세리트리트하고 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>1mL의 차가운 PBS(4°C)를 추가하고 매트릭스 배지로 오가노이드를 15mL 원심분리기 튜브로 옮춥니다. 5 분 동안 400 x g 에서 회전합니다. 셀 펠릿을 방해하지 말고 상체를 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>1mL 냉장 PBS로 한 번 더 씻고 400 x g 에서 5 분 동안 회전하십시오. 중간/세포 혼합물을 방해하지 말고 주관체를 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>원추형 원심분리기 튜브에 1mL의 세포 분리 용액을 추가하고 GFR-지하 막 매트릭스 배지/세포 혼합물을 부드럽게 세자리로 처리합니다. 인큐베이터에 12분 동안 세포를 응집체 또는 냉동 보존용으로 배치하거나 단일 세포 현탁액에 대해 20분 간 배치하십시오.</li>
	<li>담금질 매체의 동일한 볼륨을 추가하고 5 분 동안 400 x g 에서 아래로 회전합니다. 담금질 매체 + 10 μM의 ROCK 억제제 Y-27632에서 재연한다. 참고: 이 단계에서는 남은 지하 막 배지가 튜브에서 볼 수 없습니다. 잔여 매체가 남아 있으면 8.5 및 8.6 단계를 반복하십시오.</li>
	<li>셀 수를 수행합니다. 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 볼륨을 계산합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

3D 전체 폐 오르가노이드 (WLO)의 성공적인 분화는 성장 인자와 소분자에 노출되는 시간, 패세후 세포 밀도 및 hiPSC의 품질을 포함하여 세부 사항에주의를 기울여 다단계 6 주 프로토콜에 의존합니다. 문제 해결의 경우 표 2를 참조하십시오. hiPSC는 약 70%-80%의 컨할 수 있어야 하며, 해리 전에 5% 미만의 자발적인 분화를 해야 합니다. 이 프로토콜은 "mTeSR 플러스"매체를 요구합니다. 그러나, 일반 "mTeSR" 매체는 또한 비교 결과사용 하 고 저렴 한. 세포 외 매트릭스의 경우, 우리는 GFR 지하 막 매트릭스 배지를 사용합니다. 우리는 차별화를 줄이기 위해 ReLesR ( 재료의 표 참조)를 사용하여 hiPSC를 통과합니다.
엔도름 분화 중에 세포는 미디어 변경 전과 후에 매일 시각화되어야 합니다. 지정된 성장 인자/소분자는 조기 분해를 방지하기 위해 베이스 배지에 매일 신선하게 첨가해야 합니...

폐는 배아, 의사, 캐날리큘러, 충류, 및 미세 혈관 성숙1,2 - 6 개의 별개의 단계에서 발전하는 복잡하고 이질적이며 역동적 인 기관입니다. 후자의 두 단계는 조산이 발생하지 않는 한 태아 발달 중에 독점적으로 발생하는 반면, 인간 발달에서 산후적으로 발생합니다3. 배아 단계는 내피 세균 층에서 시작하여 기관및 폐 싹의 신진으로 끝납니다. 폐 발달은 상피 세포와 중간엽 세포 4 사이의 신호를 통해 부분적으로 발생합니다. 이러한 상호 작용은 폐 분지, 증식, 세포 운명 결정 및 발전 폐의 세포 분화를 초래합니다. 폐는 전도 영역(말기 기관으로의 기관) 및 호흡기 영역(폐포에 대한 호흡기 기관지)으로 나뉩니다. 각 영역은 독특한 상피 세포 유형을 포함; 기저, 분비, 모양, 브러시, 신경 내분비 및 이오노세포 세포를 실시하는 기도55, 호흡 상피에서 폐포형 I 및 II 세포가 뒤따른다. 많은 개발 및 다양 한 세포 유형의 부상에 대 한 응답에 대 한 아직 알 수 없습니다. iPSC 유래 폐 오르가노이드 모델은 인간의 폐 발달을 유도하는 메커니즘, 폐 기능에 대한 유전 적 돌연변이의 효과 및 1 차적인 인간 폐 조직에 대한 필요없이 전염성 요원에 대한 상피 및 메센키메 의 반응을 가능하게합니다.
배아 분화의 다양한 단계에 대응하는 마커는 CXCR4, cKit, FOXA2 및 SOX17을 위한 최종 엔도드름(DE)7, FOXA2, TBX1 및 SOX2를 위한 전방 전방 배구 내분방(AFE)8, 및 초기 폐선세포에 대한 NKX2-1을 포함한다. 배아 폐 발달에서, 전장은 등쪽 식도와 복부 기관으로 분할합니다. 오른쪽과 왼쪽 폐의 싹은 기관 bud10 주위에 두 개의 독립적 인 외설로 나타납니다. 형태 발생을 분기하는 동안 상피를 둘러싼 중간 근막은 탄성 조직, 부드러운 근육, 연골 및 혈관11을 생성합니다. 상피와 메센키메 사이의 상호 작용은 정상적인 폐 발달에 필수적입니다. 여기에는 FGF1012의 분비성 및 상피에 의해 생성된 SHH13이 포함됩니다.
여기서, 우리는 hiPSC의 지시된 분화에 대한 프로토콜을 3차원(3D) 전체 폐 오르가노이드(WLO)로 기술한다. LPC 단계에서 분류를 통해 폐 전구 세포의 절연을 통합하여 폐포-유사 14,15(distal) 오르가노이드 또는 기도를 만드는 유사한 접근법이 있지만, 16(근접) 오르가노이드, 또는 폐포 세포와 중간엽 마커 및 버드 팁 선조 오르가노이드를 발현하는 인간 폐 오르가노이드를 만들기 위해 복부 전방 전구 스페로이드를 생성합니다17 , 이 방법의 강도는 폐 상피 및 중간엽 세포 유형을 패턴화하여 체외에서 폐 분지, 성숙 및 확장을 조율하는 것이다.
이 프로토콜은 작은 분자와 성장 인자를 사용하여 최종 엔데름, 전방 전방 배구 내분 및 폐 선조 세포를 통해 다능성 줄기 세포의 분화를 지시합니다. 이 세포는 그 때 분기및 성숙을 포함하여 중요한 발달 단계를 통해 3D 전체 폐 오르가노이드로 유도됩니다. 분화 프로토콜의 요약은 도 1b 에 도시된 내분피 및 오르가노이드 분화의 대표적인 브라이트필드 이미지와 함께 도 1a에 도시된다. 도 1c,d 는 분화를 완료한 후 폐 상피 세포의 근위 및 탈모 집단의 유전자 발현뿐만 아니라 내피 분화의 유전자 발현 세부 사항을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 well plates</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12웰 인서트, 0.4um, 반투명</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-메르토에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Sigma</td> 레티노산이 없는 <td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA) 분획 V, 7.5% 용액</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life 햄</td><td>35050061</td><td></td>기술</tr><tr><td> s F12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s 수정된 둘베코' s 매체 (IMDM) + 글루타맥스</td><td>인비트로젠</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 대체품 (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>모노티오글리세롤</td><td>시그마</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 플러스 키트 (10/케이스)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>펜/연쇄상구균</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>줄기세포 기술</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td><td>R& D 시스템</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td><강한>성장 인자/소분자</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>액티브 A</td><td>R& D 시스템</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>올 트랜스 레티노산(RA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D 시스템</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>시그마-알드리치</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마-알드리치</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>도르소모르핀</td><td>R& D 시스템</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D 시스템</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D 시스템</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D 시스템</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>IBMX(3-이소브틸-1-메틸크산틴)</td><td>시그마-알드리치</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>R& D 시스템</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>VEGF / PIGF</td><td>R & D 시스템</td><td>297-VP/CF</td><td></td></tr><tr><td>1차 항체</td><td></td><td></td><td>희석 속도</td></tr><tr><td>CXCR4-PE</td><td>R& D 시스템</td><td>FAB170P</td><td>1:200 (F)</td></tr><tr><td>HOPX</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-398703</td><td>0.18055556</td></tr><tr><td>HTII-280</td><td>테라스 생명 공학</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>0.145833333</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>0.25</td></tr><tr><td>NKX2-1-APC</td><td>LS-BIO</td><td>LS-C264437</td><td>1:1000 (F)</td></tr><tr><td>proSPC</td><td>Abcam</td><td>ab40871</td><td>0.215277778</td></tr><tr><td>SCGB3A2</td><td>Abcam</td><td>ab181853</td><td>0.25</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-014</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>R& D 시스템</td><td>AF3075</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SPB (성숙)</td><td>7 Hills</td><td>48604</td><td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td></tr><tr><td>SPC (성숙)</td><td>LS Bio</td><td>LS-B9161</td><td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td></tr></tbody></table>

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3d 전체 폐 오르간노이드의 생성

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

인간 폐 발달 및 질병은 생물학적으로 관련된 체외 모델 시스템의 부족으로 인해 연구하기가 어려웠습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC)는 상피 및 중간 엽 세포 집단으로 만든 3D 다세포 폐 오르가노이드로 단계적으로 분화 될 수 있습니다. 우리는 다양한 성장 인자와 작은 분자를 효율적으로 생성하여 배아 발달 신호를 재구성하여 최종 엔도름, 전방 전방 전구 장부, 그리고 그 이후에 폐 선조 세포를 생성합니다. 이 세포는 그 때 감소된 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 매트릭스 매체에 내장되어, 그(것)들이 외부 성장 인자에 응하여 3D 폐 오르가노이드로 자발적으로 발전할 수 있게 합니다. 이 전체 폐 오르가노이드 (WLO)는 덱사메타손, 순환 앰프 및 이소부틸산틴에 노출 된 후 형성 형성 및 성숙을 포함한 초기 폐 발달 단계를 겪습니다. WlOs는 마커 KRT5 (기저), SCGB3A2 (클럽) 및 MUC5AC (잔)뿐만 아니라 HOPX (alveolar 타입 I) 및 SP-C (alveolar type II)를 표현하는 폐포 상피 세포를 발현하는 기도 상피 세포를 보유하고 있습니다. 중간엽 세포는 또한 평활근 액틴(SMA) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A(PDGFRα)를 포함하는 존재한다. iPSC 유래 WlOs는 몇 달 동안 3D 배양 조건에서 유지될 수 있으며 특정 세포 집단을 정화하기 위해 표면 마커를 위해 정렬될 수 있다. iPSC 유래 WlOs는 또한 폐 상피와 관혈 사이의 신호를 포함하여 인간의 폐 발달을 연구하고, 인간 폐 세포 기능 및 발달에 대한 유전 적 돌연변이를 모델링하고, 감염제의 세포 독성을 결정하는 데 활용될 수 있다.

도금 후 24시간, 1일째, iPSC는 50%-90%의 컨할 수 있어야 합니다. 2일째에 DE는 90%-95%로 응모해야 합니다. DE 유도 하는 동안, 그것은 일반적인 세포 죽음을 관찰 하는 4 4 하지만 부착 된 세포는 소형 조약 돌 형태를 유지 합니다 (도 2b). 대부분의 부착 세포가 분리되고 활성 A를 사용하여 DE 미디어에 대한 노출을 6-12 h로 단축하는 것을 고려하는 경우 분화를 중단합니다. AFE 유도 하는 동안, 세포 죽음은 최소한의, 그리고 세포는 준수 남아, 하지만 더 작고 더 이질적 나타납니다. 7일째에 세포를 전달하는 것은 이중 양성 SOX2와 FOXA2의 수율이 &gt;80%인 경우에만 이루어져야 합니다. 3D LPC 유도를 위한 지하 막 매트릭스로 전달한 후, 작은 스페로이드가 먼저 나타나고, 성장하고 일부는 분기를 시작할 수 있습니다. 성공적인 내피 분화를 위한 유전자 발현 프로파일은 SOX2 및 FOXA2의 존재와 함께 SOX17 증가, FO...

이 기사는 근접성 및 말단 상피 폐 세포를 메센키메와 함께 포함하는 3차원 전체 폐 오르가노이드로 유도된 다능성 줄기 세포의 단계 현명한 분화를 설명합니다.

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

이 프로토콜은 유도 된 다능성 줄기 세포를 사용하여 인간의 폐 질환과 접시의 발달을 모델링하기 위해 폐 세포로 분화합니다. 이 프로토콜은 1 차적인 인간 폐 조직을 얻고 배양하기 어렵기 때문에 중요합니다. 만능 줄기 세포에서 폐 세포를 분화의 주요 장점은 인간의 폐 발달 과 질병을 연구하기 위해 특정 폐 세포의 지속적인 공급을 갖는 것입니다.이 세포는 오랜 기간 동안 세포 배양에서 유지될 수 있고, 미래의 응용을 위해 냉동 보존될 수 있고, 유전자 돌연변이를 연구하기 위하여 유전으로 조작될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후보 인 레이첼 맥비카 (Rachel McVicar)가 될 것입니다. 실험을 시작하기 전에, 천천히 감소 성장 인자, 또는 GFR, 얼음에 지하 막 매트릭스 매체를 해동하고, 차가운 DMEM F12의 동일한 볼륨으로 희석.사용 전에 냉장고에 P1000 팁을 놓습니다. 다음으로, 50%GFR 지하 멤브레인 매트릭스 배지의 500 마이크로리터로 12웰 플레이트의 각 웰을 코팅하고, 우물에서 임의의 초과 배지 혼합물 및 거품을 제거한다. 젖은 얼음 위에 우물 접시를 놓거나 냉장고를 섭씨 4도에 놓고 20 분 동안 설정한 다음 접시를 섭씨 37도 인큐베이터로 하룻밤 동안 옮습니다.높은 PSE가 70%의 연결성에 도달하면 인간 유도만능 줄기 세포에 10개의 마이크로몰러 ROCK 억제제 Y27632를 추가하고 해리 전에 한 시간을 기다립니다. 미디어를 흡인하고 PVS로 세포를 한 번 씻으세요. IPSC를 잘 당 500 마이크로리터의 세포 분리 매체를 추가하고 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 줄기 세포 통과 배지의 500 마이크로 리터를 잘 한다. P1000 팁을 사용하여 부드럽게 파이펫 셀을 사용하여 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 그런 다음 해리된 세포를 15 밀리리터 튜브및 원심분리기로 300회 G.Following 원심분리에서 5분간 전송하고, 배지를 흡습하고, 10마이크로몰러 ROCK 억제제로 보충된 mTeSR Plus 미디어의 1밀리리터로 세포 펠릿을 재연한다.세포를 계산한 후, 12웰 GFR 중간 코팅 플레이트의 각 웰에 다섯 번째 IPSC에 2회 10을 추가하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한다. 다음 날, 최종 엔데름 또는 DE 유도 매체를 추가하기 전에 mTeSR 플러스를 흡인. 2일과 3일에 DE 유도 매체를 변경합니다.4일째에는 DE 유도 매체를 세럼이 없는 기저매체로 대체하여 AFE 유도를 시작합니다. 6일 종료 후 AFE 효율을 분석하기 전에 3일간 매일 AFE 매체를 변경합니다. 7일째, GFR 지하 막 매트릭스 배지를 얼음위에 해동하여 나중에 사용한다.동시에, AFE 매체를 흡입하고 PVS로 우물을 세척하여 폐 전구 세포 분화를 진행한다. 잘 세포 분리 용액 1 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 세포 분리 용액을 포함하는 Wells에 담금질 매체 1 밀리리터를 추가합니다.셀을 위아래로 부드럽게 배관하여 응집체로 유지합니다. 모든 세포가 제거되었는지 확인하지만 원심 분리를 위해 15 밀리리터 원전 튜브로 5 분 동안 300 회 G로 옮기십시오. 상체를 제거하고 LPC 유도 매체에서 세포 펠릿을 다시 분리합니다.세포를 계산하고, 차가운 GFR 지하 막 매트릭스 배지의 100 마이크로 리터에 다섯 번째 세포에 2.5 배 10을 추가하고 잘 혼합한다. 12웰 플레이트의 우물에 물방울을 넣고 섭씨 37도에서 30~60분 동안 배양합니다. 다음으로, LPC 미디어 1밀리리터를 음부당 추가하여 중간 낙하가 완전히 잠기고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양할 수 있도록 합니다.8일째에는 LPC 배지를 변경하여 ROCK 억제제 Y27632를 제거합니다. 매일 미디어를 계속 변경하고 16일 말에 LPC 효율성을 분석하십시오. 17일, 우물을 씻고 밀리리터 디스파스당 2마이크로그램의 500마이크로리터를 추가합니다.P1000 파이펫으로 디스파제 혼합물을 피펫하고 15분 동안 배양한 다음 혼합물을 피펫하고 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션에 따라, 담금질 매체의 1밀리리터를 우물을 포함하는 디스파에 넣고 세포를 원뿔관으로 옮기는다. 원심분리기를 냉각된 PVS의 1밀리리터로 환원분리한 다음 원심분리를 반복합니다.그런 다음 세포 분리 배지의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 섭씨 37도에서 12분 동안 배양한 다음 담금질 매체와 원심분리기의 동일한 양을 다시 추가합니다. 담금질 매체의 1 밀리리터와 10 마이크로 몰라 ROCK 억제제 Y27632에서 펠릿을 다시 중단하십시오.셀 카운트를 수행하여 10번을 얻는 데 필요한 부피를 잘 당 4세포로 계산한다. 그런 다음 Aliquot는 LPC 세포 응집체의 부피를 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로, 300배G.Remove 에서 5분 동안 세포 펠릿을 교반하지 않고 과잉 슈퍼네티얼을 제거하고 10 마이크로리터의 잔류 매체를 남겼다. 감기 GFR 지하 막 매트릭스 배지의 200 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포 배양 막 삽입으로 세포를 전송한다.섭씨 37도에서 30~60분간 배양하세요. 인큐베이션 후, 삽입물의 바소포탈 챔버에 3D 오르간성 유도 배지 1밀리리터를 넣고 6일 동안 매일 신선한 배지로 교체한다. 23일, 매체를 3D 분기 매체로 전환한 다음 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다.29일, 3D 성숙 매체로 변경하고, 앞으로 6일 동안 격일로 배지를 계속 교체한다. DE 유도의 4일째에, 연결된 세포는 소형 조약돌 형태를 표시합니다. 핵으로 오버레이된 결정적인 엔도름 마커 CXCR4 및 SOX17이 발현되어 내피 분화를 확인하였다.전방 전경 유도는 7일째에 보다 단단히 압축된 세포를 보여주는 형태학으로 확인되었으며, 마커 FOXA2 및 SOX2는 핵으로 오버레이되었다. 3D 폐 전구세포의 생성은 리포터 세포주에서 NKX2-1 GFP의 3D 스페로이드 및 내인성 발현으로 확인되었다. 전체 폐 오르가노이드로 3 주 분화 한 후, 폐 마커는 면역 세포 화학에 의해 분석되었다.핵에 의해 오버레이된 형태발생 SOX2 및 SOX9를 분기마커는 오르가노이드에서 관찰하였다. 기저 세포의 두 마커인 동축 폐 마커 P63 및 KRT5는 클럽 세포에 대한 마커인 SCGB3A2와 함께 성공적으로 검출되었다. 탈경 폐 마커는 알포올라 타입 II 세포를 위한 프로 SPC 및 SPB 마커를 유도하였다.그리고 폐포 타입 I 세포의 HOPX 마커. 또한, NKX2-1 및 ZO1은 핵과 겹쳐진 발현되었다. 메센키메 폐세포 마커 PGFR 알파는 SOX9과 공동 발현된 섬유아세포에 대한 마커로, 불실의 메센키메를 나타냈다.비멘틴도 발현되었고 폐 전체에 분산되었다. 이 절차에 따라 폐 오르가노이드는 유도된 다능성 줄기 세포유래 내피 및 면역 세포와 투자될 수 있다. 폐 발달 및 질병은 상피 세포 집단과 중간엽 세포 집단 사이 신호에 의해 또한 내피 세포 및 대식세포에서 생깁니다.3D 폐 조직 모델 시스템은 인체 질환 및 치료법을 연구하는 데 임상적으로 관련이 있습니다.

generation-3d-whole-lung-organoids-from-induced-pluripotent-stem

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 효율적으로기도에게 상피 세포를 성숙 마우스 배아 줄기 세포 유래 최종 내배엽 지시합니다. 분화 기술은 정의 된 무 혈청 배양 환경에서, 폐 계통 사양을 직접 3 차원 decellularized 폐 지지체를 사용한다.

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

여기, 우리는 생물 학적 및 생물 의학 연구에 모델 인간의 폐 질병에 3D 폐 조직 문화를 생성 하는 데 적합 한 절제 환자 조직에서 인간의 정밀 컷 폐 agarose 가득 조각의 준비에 대 한 프로토콜 제시.

질병 모델링에 대 한 인간의 3D 폐 조직 문화 (3D-Ltc)의 생성

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

여기서, 우리는 자기 조직에 의하여 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 발달적으로 관련있는 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 만드는 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 발달 단서의 순차적 활성화에 의존하고 매우 복잡하고 기능적으로 관련된 인간 심장 조직을 생성합니다.

다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성

이 프로토콜은 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 근위 분화를 유도하여 인간 기도 상피를 충실하게 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하는 방법을 제시한다.

성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 인간 폐 오가노이드 및 근위 분화 확립

이 프로토콜은 화학적 발암을 통해 유도된 정상, 전종양 및 편평 세포 암종 병변을 나타내는 쥐 구강-식도 3D 오가노이드를 생성하고 특성화하는 주요 단계를 설명합니다.

3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

이 프로토콜은 인간 만능 줄기세포를 사용하여 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제시합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

여기에서는 피더 세포없이 렌티 바이러스 시스템을 이용하여, 환자 유래의 섬유 아세포와 같은 활막에서 인간 - 유도 된 다 능성 줄기 세포를 생성하기위한 프로토콜을 기술한다.

류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜의 목표는 흑색종 종양 침투 림프구를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 프로토콜을 보여주는 것입니다.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

배우세요 hiPSC에서 3D 폐 오르간노이드를 분화시키는 방법을. 이 기술은 폐 발달 및 질병을 체외에서 모델링하여 원발성 폐 조직 확보의 어려움을 극복하고, 유전자 돌연변이와 세포 독성 연구에 활용됩니다.

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성

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