Name: S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 배우세요 S 단계에서 레이저 미세 조사를 이용한 DNA 손상 복구 단백질 모집 동역학 분석 방법을. 형광 표지 PCNA로 S 단세포를 식별하고 공초점 현미경으로 실시간 관찰합니다.

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저자들은 M. 파가노뿐만 아니라 D. 시모네스키, A. 마르지오, G. 탕의 원고에 대한 비판적 검토에 감사드립니다. B. 미와타니-Minter는 R. 미와타니와 비 민터의 지속적인 지원에 감사를 표했습니다. G. 로나는 K. 로나네 쥬라스와 G. 로나에게 지속적인 지원을 해준 것에 대해 감사를 표했습니다.

<ol><li>Aleksandrov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+in+complex+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics in complex DNA lesions.</a> Molecular Cell. 69 (6), 1046-1061 (2018).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H., Podhorecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response%3A+Analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: Analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Herce, H. D., Rajan, M., Lattig-Tunnemann, G., Fillies, M., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+permeable+DNA+replication+and+repair+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">A novel cell permeable DNA replication and repair marker.</a> Nucleus. 5 (6), 590-600 (2014).</li>
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<li>Zhang, F., Shi, J., Chen, S. H., Bian, C., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+domain+of+EXO1+recognizes+poly%28ADP-ribose%29+in+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PIN domain of EXO1 recognizes poly(ADP-ribose) in DNA damage response.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10782-10794 (2015).</li>
<li>Rona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+recruitment+of+the+FBXL10-RNF68-RNF2+ubiquitin+ligase+to+sites+of+DNA+damage+controls+H2A.Z+loading%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading.</a> elife. 7, (2018).</li>
<li>Young, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIMELESS+forms+a+complex+with+PARP1+distinct+from+its+complex+with+TIPIN+and+plays+a+role+in+the+dna+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response.</a> Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+to+study+in+vivo+cellular+responses+to+simple+and+complex+dna+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56213(2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensin+I+recruitment+to+base+damage-enriched+DNA+lesions+is+modulated+by+PARP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1.</a> PLoS One. 6 (8), 23548(2011).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+site-specific+induction+of+oxidative+DNA+damage+reveals+differences+in+recruitment+of+repair+proteins+to+heterochromatin+and+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).</li>
<li>Zerjatke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cell+cycle+analysis+based+on+an+endogenous+all-in-one+reporter+for+cell+tracking+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification.</a> Cell Reports. 19 (9), 1953-1966 (2017).</li>
<li>Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infection+of+cultured+cells+induces+oxidative+stress+and+attenuates+cellular+base+excision+repair+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity.</a> Mutation Research. 845, 403054(2019).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae+infection+induces+reactive+oxygen+species+and+DNA+damage+in+A549+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae infection induces reactive oxygen species and DNA damage in A549 human lung carcinoma cells.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4405-4413 (2008).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amsterdam). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Muster, B., Rapp, A., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+DNA+damage+induction+and+DNA+repair+pathway+activation+by+continuous+wave+visible+light+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of DNA damage induction and DNA repair pathway activation by continuous wave visible light laser micro-irradiation.</a> AIMS Genetics. 4 (1), 47-68 (2017).</li>
<li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+human+NTH1%2C+a+homolog+of+Escherichia+coli+endonuclease+III.+Direct+identification+of+Lys-212+as+the+active+nucleophilic+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (34), 21585-21593 (1998).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 94 (14), 7429-7434 (1997).</li>
<li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).</li>
<li>Taccioli, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku80%3A+product+of+the+XRCC5+gene+and+its+role+in+DNA+repair+and+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination.</a> Science. 265 (5177), 1442-1445 (1994).</li>
<li>Marsin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+XRCC1+in+the+coordination+and+stimulation+of+oxidative+DNA+damage+repair+initiated+by+the+DNA+glycosylase+hOGG1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44068-44074 (2003).</li>
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</ol>

저자는 제시 된 작품의 출판이 니콘 공사에 의해 후원되었다고 말합니다. 저자는 경쟁적인 이해관계가 존재하지 않는다고 선언합니다.

중요한 단계 및 잠재적 프로토콜 문제 해결/수정 미세 조사를 위한 적당한 조직 배양 용기는 성공을 위해 중요합니다. 대부분의 고해상도 이미징 시스템은 0.17mm 커버 유리 두께에 최적화되어 있습니다. 더 높거나 낮은 두께의 이미징 챔버 또는 플라스틱 폴리머로 만든 이미징 챔버(405nm 이미징에 최적화되지 않음)를 사용하면 이미지 품질을 크게 줄일 수 있습니다. 유리 표면을 사용할 때 세포 접착력을 향상시키기 위해 치료된 조직 배양인지 확인하십시오. 그(것)들이 처리되지 않는 경우에, 이 챔버는 세포를 종자하기 전에 폴리 D-lysine와 예를 들면, 코팅될 필요가 있을 것입니다. 챔버 커버 글래스로 세포를 도금 할 때, 이상적인 세포 밀도는 세포 주기 요철과 세포에 추가 스트레스를 피하기 위해 가장 중요합니다. 실험 전에 현미경 성분의 적절한 열 평형은 안정적인 온도를 유지하기 위해 시간 경과 이미징 전반에 걸쳐 초점을 유지하는 데 매우 중요하며 시간과 샘플에 걸쳐 균일한 DDR을 보장해야합니다.
세포가 미세 조사 전에 건강한 상태에 있어 관절 데이터를 줄이는 것이 중요합니다. 세포가 감염 후/선택 후 불규칙한 형태학이 있는 경우, 형태학이 정상으로 돌아올 때까지 세포가 여러 구절을 통해 진행되도록 합니다. 항상 사용되는 세포 선이 마이코플라즈마 오염이 없는지 확인하십시오. 마이코플라즈마 감염의 많은 부작용 중에서도 숙주 세포에 DNA 손상을 일으키고 DDR 경로14,15에영향을 줄 수 있다. 세포 배양에서 마이코플라즈마를 검출하는 가장 민감한 방법은 PCR(DAPI 또는 Hoechst로 의 검출)을 통해서입니다.
관심있는 수리 단백질의 최적의 과발현은 내인 성 수준과 유사해야하지만 검출을 위해 충분히 높어야합니다. 바이러스 벡터, 감염 시 바이러스 성 티터 및 감염 시간의 길이에 사용되는 프로모터는 모두 이상적인 발현 수준에 맞게 조정할 수 있습니다. 일관된 결과를 위해 개별 세포 클론을 분리하여 균일한 발현 수준과 정상 세포 형태를 보장합니다. 적절한 세포 주기 및 DNA 복구 마커 기능에 대한 내인 성 수준보다 높은 태그PCNA를 과발현하지 않는 벡터 구조를 사용하는 것이 좋습니다. PCNA 과발현의 낮은 수준조차도 S-위상 세포를 차별하기에 충분합니다. 레트로 바이러스 pBABE 벡터는 성공적으로이 목적을 위해 사용 되었습니다 (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA는 임의의 단황레드(예: mPlum, mCherry, mRuby 등) 또는 단황 녹색 형광 단백질(예: mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald 등)으로 태그할 수 있으며, 이는 대체 태그 POI와 결합될 수 있습니다. 형광 태그 POI를 과도하게 표현하는 것은 몇 가지 제한사항과 고려 사항이 있습니다. 형광 태그는 정상적인 단백질 기능 및 국소화를 방해 할 수 있습니다. 따라서 태그(N 또는 C-단자)의 위치를 고려해야 합니다. 비 단황 변이체의 올리고머화가 POI의 기능에 영향을 줄 수 있기 때문에 항상 단황 형광 단백질을 사용합니다.
레이저 설정은 광학 경로의 많은 구성 요소가 세포로 전달되는 실제 전력에 영향을 미치기 때문에 각 이미징 시스템에 대해 결정되어야 합니다. 레이저 미세 조사는 흥분 파장에 따라 여러 종류의 DNA 병변을 유발할 수 있으며, FRAP 레이저의 전력 출력 및 사전 감광제(Bromodeoxyuridine 또는 Hoechst)가 사용된 경우. 405 nm 레이저산화 DNA 손상을 일으킬 수 있습니다., 단일 및 이중 좌초 휴식16,17. 더 높은 레이저 출력 설정을 사용하면 DSB의 양이 증가합니다. 이 프로토콜에서 사전 감세화 방법은 활용되지 않았지만 이러한 기술은 문헌에서 크게 다루어지고 아래 토론에서 다시 제한됩니다. 우리의 의견으로는, 원하는 병변이 생성되는 경우에 시험하는 가장 좋은 쪽은 알려진 DNA 손상 통로 특정 유전자의 모집을 위한 시험에 의하여입니다. NTHL1 또는 OGG1의 모집, BER 통로의 성분은 산화 된 DNA 기지10,11,17,18,19,FBXL10 또는 XRCC5의 존재를 나타내는 동안8,20,21의존재를 나타낸다. XRCC1의 모집은 산화된 DNA 염기와 단일 좌초 휴식(SSB)22,23의존재를 나타낼 수 있다. XPC(즉, RAD4)는 자외선(UV)17,24에의해 생성된 부피가 큰 DNA 교반을 제거하는 NER의 좋은 지표이다. 외인성 단백질을 모집하면 특정 불규칙성을 유발할 수 있기 때문에 내인성 DNA 수리 단백질 또는 마커(예: 이중 좌초 휴식의 경우 γH2A.X)의 면역형염색은 특정 DNA 병변의 존재를 확인할 수 있다. 대안적으로, DNA 병변의 특정 모형에 대하여 제기된 항체는 또한 이용될 수 있었습니다. 전달된 레이저 전력을 조정하기 위해, 거주 시간과 레이저 전력을 모두 변경할 수 있습니다.
수학적 모델링의 도움으로 POI의 채용 특성에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 상세한 운동 분석(예: 여러 DNA 바인딩 도메인의 기여, 다른 신호 이벤트에 대한 민감성 등)을 수행할 수 있습니다. 자동화된 채용 평가 및 셀 트래킹을 결합하여 강력한 워크플로우 1,25를만들 수 있습니다.
DNA 사전 감도의 장점과 한계 미세 조사 전에 DNA의 사전 민감화는 DNA 복구 단백질 모집을 위해 일반적으로 사용되는도구입니다(16,17). 미세 조사 전에 DNA를 민감하게 하는 것은 DSB에 더 취약하게 만듭니다. DNA 사전 감작을 위한 2개의 일반적인 방법은 Bromodeoxyuridine (BrdU) 또는 Hoechst 염료를 가진 세포의 전처리입니다. 높은 레이저 전력에서 미세 조사를 할 수 없는 시스템의 경우, 이러한 방법은 DSB와 같은 DNA 병변을 유도하는 데 필요할 수 있습니다. 그러나, DNA 사전 감감각은 중요한 합병증을 소개할 수 있습니다. BrdU(10μM의 최종 농도에서 사용)는 DNA에 적절하게 통합하기 위해 24시간(또는 사용된 세포주에서 전체 세포 주기와 동등한 시간)에 첨가되어야 하며 세포 주기간섭(26)을유발할 수 있다. Hoechst 33342 (1 μg/mL의 최종 농도에서 사용)는 긴 잠복 기간 후에 세포 독성이지만 염료로 핵을 포화시키는 충분한 시간이 필요합니다. 따라서, 그것은 단지 적용 해야 15-20 마이크로 조사 전에 분; 그렇지 않으면 채용 데이터가 일치하지 않습니다. 이러한 방식으로 염색된 세포는27,28시간이상 문화권에 보관할 수 없다. Hoechst 33342 염료와 같이 세포 투과성이 없는 Hoechst 33358을 사용하지 않도록 하십시오. 사전 감광은 또한 실험 중 불필요한 분산을 소개하고 세포 밀도의 차이에 더욱 민감하게 실험하게 할 수 있습니다 (이것은 통합 된 염료 / 세포의 양에 영향을 미치기 때문에).
공초점 현미경 검사법의 장점과 한계 공초점 현미경 검사법의 화상 진찰 속도는 와이드 필드 현미경 검사법과 비교할 때 제한될 수 있습니다. 그러나 공진 스캐너가 장착된 공초점 현미경은 회전 디스크 현미경 검사법의 속도에 가까워지는 이미징 속도(해상도 비용)를 크게 향상시킬 수 있습니다. 3가지 기능을 통해 A1R HD25 공초점 시스템은 여기에 제시된 프로토콜에 대한 탁월한 선택입니다. 첫째, 시스템의 25mm FOV는 단일 스캔 필드(일반 설정에서 5-10셀 대)에서 15-20셀 사이를 이미지할 수 있게 해 주며, 통계 분석을 위해 충분한 세포를 얻는 데 필요한 수집 횟수를 제한합니다. 둘째, FRAP 모듈과 2개의 스캔헤드를 사용하면 셀을 순차적으로 이미지화하고 미세하게 조사할 수 있습니다. 마지막으로 공진스캐너와 갈바노 스캐너를 모두 사용하는 유연성은 형광의 담금질을 최소화하는 뛰어난 속도로 고시간 해상도 이미징과 느린 스캐닝 속도를 이용하여 더 높은 신호 대 노이즈 비율로 이미지를 생성하는 고공간 해상도 이미징 사이에서 쉽게 전환할 수 있는 기능을 제공합니다. 전술한 유연성을 위해 사용된 시스템은 보다 널리 이용 가능한 공초점 현미경 구성과 유사하게 허용되었지만, 제시된 실험(마이크로 조사 및 후속 이미징 모두)에 갈바노 스캐너만 사용되었습니다.
미세 조사의 장점과 한계 미세 조사는 타의 추종을 불허하는 공간 및 시간적 해상도를 제공하지만 제한없이는 아닙니다. 레이저 미세 조사에 의한 DNA 손상은 자연적으로 발생하는 손상 제에 비해 핵의 특정 부분에 고도로 클러스터된다. 따라서, 미세 조사로 인한 크로마틴 반응은 균질적으로 분산된 손상에 비해 다를 수 있다. 추가적으로, 미세 조사는 시간이 많이 걸리고 단지 수십 개의 세포에서 만 수행 될 수있다, 큰 인구 기반 생화학 적 방법 (크로마틴 분획, 면역 침전, ChIP) 한 번에 세포의 수천을 공부하여 증가 견고성을 제공 할 수 있지만. 전통적인 생화학 기술로 미세 조사로 관찰을 확인하는 것은 신뢰할 수있는 결론을위한 효과적인 전략입니다. 특정 FOV에 있는 많은 세포의 동시 미세 조사가 가능하더라도, 화상 진찰 시스템은 작업을 수행하는 데 더 많은 시간이 필요합니다. 따라서 DNA 병변에 매우 빠르게 채용되는 단백질의 역학을 측정하면 동시에 사용되는 미세 조사에 가능한 ROI의 수가 제한됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 이미징 시스템에서 단일 1024 픽셀 긴 ROI의 마이크로 조사는 1000 μs 거주 시간 및 3000 μs 를 사용하여 3088 ms를 사용하여 1032 ms를 소요하여 완료하는 데 걸리는 시간을 제공합니다. 여러 회 선을 사용하는 ROI는 미세 조사를 완료하는 데 필요한 시간을 크게 증가시킬 것입니다 (예를 들어, 7 x 1024 픽셀 긴 ROI는 1000 μs 거주 시간 및 3000 μs 거주 시간을 사용하여 21598 ms를 사용하여 14402 ms를 사용합니다). 이번에는 이미지 수집에서 손실되며 고려해야 합니다. 빠른 모집 이벤트를 이미징할 때 가능한 가장 짧은 ROI를 사용하고 한 번에 하나의 셀만 마이크로 조사합니다.
동기화 방법에 대한 장점 과 제한 세포 주기 특정 연구 결과에 대 한, 기존 방법은 특정 세포 주기 단계로 세포의 동기화 또는 형광 기자를 사용 하 여 세포의 특정 세포 주기 단계를 식별 하는 것을 포함. 그러나 이러한 각 메서드는 고유한 도전과 한계를 제공합니다.
FUCCI 시스템3 (CDT1과 Geminin의 형광 단백질 태그 잘린 형태에 의존)는 세포 주기 연구에 특히 유용한 도구이지만 세포 주기의 S와 G2 단계 사이의 분화에 관해서는 한계가 있습니다. Geminin 수준은 이미 중반 S 단계에서 높고 M 단계까지 높은 상태를 유지하므로 이러한 단계를 분리하기가 어렵습니다. FUCCI 시스템을 사용하면 현미경의 두 개의 광학 채널이 POI 이미징에 사용할 수 없음을 의미합니다.
비암 세포주는 혈청 (혈청 기아)에서 발견되는 성장 인자의 제거에 의해 G0으로 동기화될 수 있어 세포에 DNA 손상을 거의 또는 전혀 유발하지 않을 수 있습니다. 그러나, 대부분의 암 세포 주 부분적으로 그들의 미디어에 혈 청의 적절 한 금액 없이 세포 주기를 통해 진행 을 계속 합니다. 추가적으로, 세포는 부분적으로 늦은 G1, 초기 S 단계에 의해 동기화를 잃기 시작합니다. 혈청 기아 외에도 세포 주기 동기화를 달성하기 위한 수많은 화학 적 방법이 있습니다. 하이드록수에레아, 아피디콜린 및 티미딘 블록은 세포를 초기 S 단계로 동기화하기 위해 DNA 복제를 중지하는 방법입니다. 이러한 방법은 저렴 하 고 간단 하는 동안, 그들은 DNA 손상 결과 복제 스트레스를 소개 합니다. 이러한 DNA 복제 억제제는 H2A의 인산화를 유도하는 것으로 나타났다. X, DSBs2,29의잘 알려진 마커 . 태그-PCNA를 S-phase 세포에 대한 마커로 사용하는 방법은 화학적 동기화로 인한 동맥의 가능성을 감소시키고 혈청 기아에 비해 광범위한 세포주에 적용될 수 있다.
결론 DNA 손상은 돌연변이 병변이 세포의 악성 변환으로 이어질 수있는 유전 질환의 원동력입니다. DNA 합성 기계를 표적으로 하는 것은 암 같이 과증증성 질병의 처리에 있는 근본적인 치료 전략입니다. 이러한 질병을 보다 표적으로 한 방식으로 치료하기 위해서는 DNA 병변을 복구하는 단백질에 대한 더 나은 이해가 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 기존의 동기화 방법으로 제시된 과제를 최소화하여 가능한 유물을 줄이고 실험의 재현성을 증가시킴으로써 S 단계의 미세 조사 기반 연구를 지원합니다.

몇몇 DNA 복구 통로는 세포에서 생길 수 있는 DNA 병변의 다른 모형을 해결하기 위하여 발전했습니다, 모두는 공간과 시간 둘 다에서 높게 통제됩니다. 세포 주기의 가장 취약한 기간 중 하나는 DNA 합성이 발생할 때 S 단계입니다. 확산은 삶의 기본이지만, 또한 중요한 도전을 제공합니다. 세포는 돌연변이가 미래 세대에게 전해지는 것을 피하기 위하여 그들의 게놈의 충실한 복제를 보장할 필요가 있습니다. 따라서, 증식은 종양학 분야의 치료 접근법의 발달을 위해 사용된 내정간섭의 치료 포인트를 제공합니다.
DNA 병변에서 단백질 모집을 연구하는 데 사용되는 모든 주요 기술은 강점과 한계를 가지고 있습니다. 미세 조사는 이온화 방사선 유도 된 foci (IRIF), 크로마틴 -면역 침전 (ChIP) 또는 생화학 분획의 면역 형광 화상 진찰과 같은 대체 방법의 대부분보다 더 나은 공간 및 측두성 해상도1을 갖는다. 그러나, 마이크로 조사는 다수의 세포를 동시에 샘플링할 수 있는 전술한 기술의 견고성을 결속시한다.
S 단계에서 DNA 수리를 조사하기 위해 비동기 세포 배양 집단에서 S 상 세포를 구별할 수 있어야 합니다. 세포의 동기화 또는 다른 세포 주기 단계의 시각화를 포함하는 이 문제를 해결하기 위하여 많은 잘 알려진 방법이 있습니다. 그러나 두 가지 접근 법은 중요한 도전과 가능한 유물을 소개합니다. 초기 S 상에서 세포를 농축하는 데 널리 사용되는 화학 적 동기화 방법 (예를 들어, 이중 티미딘 블록, 아피디콜린 및 하이드록수유레아 처리)는 복제 스트레스의 유도를 통해 동기화를 달성하고 결국 DNA 손상 자체. 이것은 S 상2에서DNA 복구 프로세스를 연구하기 위하여 이 방법의 사용을 제한합니다. 혈청 기아 및 방출을 통한 동기화는 비변형 세포주에 비해 세포 주기 진행을 위한 성장 인자에 덜 의존하는 암 세포주를 주로 제외하는 제한된 수의 세포주에만 적용됩니다. 형광 유비퀴틴 세포 주기 표시기 (FUCCI) 시스템은 세포 주기를 연구하는 데 특히 유용한 도구이지만 S와 G2 세포 주기 단계3을 분화 할 때 근본적인 한계를 가지고 있습니다.
여기서 는 형광 태그PCNA를 S 상에 대한 비침습적 마커로서 사용함으로써 화학 세포 주기 동기화 방법의 단점을 제한하면서 FUCCI 시스템보다 더 특이성과 유연성을 허용하는 것으로 나타났다. 단일 마커로서 PCNA는 비동기 집단에서 S-위상 세포를 강조할 수 없을 뿐만 아니라 S 상(즉, 조기, 중, 또는 후기 S-phase)4내의 세포의 정확한 진행을 보여줄 수도 있다. 태그가 붙은 PCNA의 낮은 발현 수준은 세포 주기 진행 및 DNA 복구 과정 모두에 대한 최소한의 간섭을 보장합니다. 중요한 것은, PCNA는 또한 여러 DNA 병변의 수리에 관여하고 국소 유도된 DNA 손상 부위1,4로모집되기 때문에 적절한 DNA 손상 유도에 대한 내부 통제 역할을 한다.
여기에 제시된 실험은 S 단계에서 EXO1b의 채용 역학을 측정하는 방법과 이것이 잘 확립 된 PARP 억제제인 olaparib에 의해 어떻게 영향을받는지 보여줍니다. EXO1b 뉴클레아제 활성은 불일치 수리(MMR), 뉴클레오티드 절제 수리(NER), 이중 좌초 브레이크(DSB) 수리를 포함한 광범위한 DNA 수리 경로와 관련이 있다. S 단계에서 EXO1b는 DNA 절제술5동안 3'sSDNA 오버행의 형성을 통해 상동성 재조합(HR)에서 중요한 역할을 한다. EXO1b는 검사점 활성화의 역할과 함께 DNA 복제에 더욱 연루되어 정체된 DNA 포크뿐만 아니라복제5에서가닥 변위 중 지연가 닥치는 가닥에서 프라이머 제거 및 오카자키 단편 성숙을 다시 시동하고 있다. 손상된 DNA 부위에 대한 EXO1b 모집은 폴리(ADP-ribose)(PAR)6,7과의직접적인 상호 작용에 의해 조절된다. EXO1b의 수많은 세포 주기 특이적 의미로 인해 PCNA를 이용한 S-Phase 특정 채용 연구에 탁월한 선택입니다.

<table><tbody><tr><td>염화암모늄</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>포름 알데히드 담금질</td></tr><tr><td>용 Anti-EXO1 토끼 폴리 클로날 항체</td><td>Proteintech</td><td>16253-1-AP</td><td>1 차 항체</td></tr><tr><td>Anti-phospho-Histone H2A. X (Ser139) 항체, 클론 JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td>일차 항체</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td>BSA 차단용</td></tr><tr><td>BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine)</td><td>Merck</td><td>19-160</td><td>사전 민감화제</td></tr><tr><td>Citifluor&trade; 마운트 솔루션 AFR3</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>17973-10</td><td>이미징용 PBS 함유 안티페이</td></tr>드 <tr><td>솔루션 DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>핵산 염색</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td>세포 배양 배지 HEK293T세포용</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Vehichle control and dissolution solvent</td></tr><tr><td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgene</td><td>#126542</td><td>바이러스 발현 벡터, EGFP-FBXL10</td></tr><tr><td>EXO1b-AcGFP&nbsp; (pRetroQ에서)</td><td></td><td></td><td>EXO1b cDNA를 이용한 맞춤형 클로닝은 pRetroQ-AcGFP1-N1 벡터의 NheI, BamHI 부위에 클로닝하였다.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco 16140071</td><td></td><td>배지 보충제</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>A1896701 현미경 검사용 페놀 레드 유리 배지</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>HEK293T 세포</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>세포주 바이러스 포장용</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>라이브 셀 이미징 배지를 보충하는 버퍼링제</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>사전 감작제</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A (수정) Medium</td><td>Life Technologies</td><td>16600-108</td><td>U-2 OS 세포용 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55117</td><td>세포주기 마커에 적합한 비바이러스 PCNA 구조체</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55994</td><td>세포주기 마커에 적합한 비바이러스 PCNA 구조체</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA (in pBABE)맞춤형</td> <td>클로닝</td><td>na</td><td>mPlum-PCNA cDNA는 pBABE (puro)</td></tr><tr><td>Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead 및 Controller</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>컨포칼 이미징 시스템</td></tr><tr><td>Nikon LUN4 레이저 유닛</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>excitation system</td></tr><tr><td>Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP 레이저 유닛</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>FRAP 레이저 유닛</td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements Confocal Controller Software</td><td>Nikon</td> 의 BamHI, SalI 부위에서 Addgene #55994로부터 복제되었다.<td>컨</td><td>포칼 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td></td>과 <td>도립 에피 형광 현미경 기반</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-LAPP 모듈식 조명 시스템</td><td>Nikon</td><td>과</td><td>조명 시스템</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry (in pRetroQ)</td><td></td><td></td><td>NTHL1 cDNA를 pRetroQ-mCherry-N1 벡터의 NheI, SalI 부위에 복제했습니다.</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 챔버 커버글라스(4웰)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>Live cell microscopy cell culture chamber</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1060</td><td>PARP inhibitor</td></tr><tr><td>Opti-MEM reduced serum media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Dilution medium for transient transfection</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 수용액(32%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>pBABE (hygro)</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>레트로바이러스 발현 벡터(낮은 발현 수준용)</td></tr><tr><td>pBABE (neo)</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>레트로바이러스 발현 벡터(낮은 발현 수준용)</td></tr><tr><td>pBABE (퓨로)</td><td>Addgene</td><td>#1764</td><td>레트로바이러스 발현 벡터(낮은 발현 수준용)</td></tr><tr><td>pBABE (zeo)</td><td>Addgene</td><td>#1766</td><td>retroviral expression vector (for low expression levels)</td></tr><tr><td>PCNA 항체 (PC10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-56</td><td>primary antibody</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Media supplement</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td>Increase viral infection efficiency</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>레트로바이러스 발현 벡터</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td>Takara</td><td>632505</td><td>레트로바이러스 발현 벡터</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-C1</td><td>Takara</td><td>632567</td><td>레트로바이러스 발현 벡터</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Takara</td><td>632568</td><td>레트로바이러스 발현 벡터</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>바이러스 패키징 벡터</td></tr><tr><td>나트륨-피루브산</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td>보충제 라이브 셀 이미징 매체</td></tr><tr><td>Triton X-100 수용액 (10%)</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>세포 투과화 완충액을 위해 PBS에 희석</td></tr>, <tr><td>Trypsin-EDTA 솔루션 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>PBS에 희석하여 세포</td></tr><tr><td>분할 U-2 OS 세포</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; HTB-96</td><td>현미경 실험을 위한 최적의 세포주</td></tr><tr><td>범용 마이코플라스마 검출 키트</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td><td>PCR 기반 마이코플라스마 검출 키트</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>바이러스 단백질 외피 벡터</td></tr></tbody></table>

s 단계 동안 dna 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA 손상 복구는 반응성이 높은 환경에서 세포의 유전 적 무결성을 유지합니다. 세포는 대사 활동 또는 UV 방사선과 같은 내인성 및 외인성 소스로 인해 다양한 유형의 DNA 손상을 축적할 수 있다. DNA 복구없이, 세포의 유전 코드는 단백질의 구조와 기능을 훼손하고 잠재적으로 질병을 일으키는 손상된다. 
다양한 세포 주기 단계에서 다른 DNA 수리 경로의 현면역학을 이해하는 것은 DNA 손상 복구 분야에서 매우 중요합니다. 현재 형광 현미경 검사는 DNA 손상 유도 후 다른 수리 단백질의 모집 역학을 측정하는 훌륭한 도구를 제공합니다. 세포 주기의 S 단계 도중 DNA 합성은 DNA 복구에 관하여 세포 운명에 있는 특이한 점입니다. 그것은 실수에 대한 전체 게놈을 선별하는 독특한 창을 제공합니다. 동시에, DNA 합성 오류는 또한 비 분할 세포에서 발생하지 않는 DNA 무결성에 위협을 제기합니다. 따라서, DNA 복구 과정은 세포 주기의 그밖 단계에 비교된 S 상에서 현저하게 다르고, 그 다름은 제대로 이해되지 않습니다. 
다음 프로토콜은 405 nm 레이저 라인을 갖춘 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 로컬로 유도된 DNA 손상 부위에서 S 상에서 DNA 수리 단백질의 역학의 제조 및 측정을 설명합니다. 태그된 PCNA(mPlum와 함께)는 AcGFP-표지된 수리 단백질(즉, EXO1b)과 결합된 세포 주기 마커로서 S 상에서 DNA 손상 모집을 측정합니다.

세포는 또한 어떤 세포 주기 단계에 달려 있는 특정 방식으로 DNA 병변의 각 모형을 다룹니다. 예를 들어, 마이크로 조사 후, 이중 좌초 휴식(DSB)은 세포 주기 단계에 따라 비동형 종결 결합(NHEJ) 또는 HR에 의해 처리됩니다. 세포 주기의 S 및 G2 단계 도중 가장 광범위하게 작용하는 핵은 적당한 HR을 위해 결정적인 DNA 오버행을 만듭니다. S 상에서 세포의 평가를 촉진하기 위해 PCNA는 단일 색 세포 주기 마커로 사용되었습니다. 도 1A는 세포 주기 진행 중 mPlum-PCNA의 국소화 프로파일을 나타낸다. PCNA는 G1 및 G2 상에서 핵에 완전히 균일한 분포를 갖는다(또한 핵에서 주로 제외되는 동안). S 단계에서 PCNA는 핵에서 밝은 반점으로 시각화할 수 있는 DNA 복제 부위를 국소화합니다. 초기 S 상 세포에서, 반점은 세포의 핵을 통해 상대적으로 작고 동등하게 분포된다. S 단계 중반으로 진행하면 반점이 흐려지고 핵과 핵의 둘레를 향해 더 많이 국한됩니다. 후반 S 단계에서는 PCNA가 후기 복제사이트(그림 1B)에집중됨에 따라 반점이 감소하지만 점점 더 커집니다. 중요한 것은, pBABE 벡터 백본으로부터의 외인성 PCNA 발현은 내인성 수준보다 적었지만 세포 주기 진행 및 DDR의 잠재적 인 유물을 최소화하는 현미경 검사법에 의한 검출에 충분했다. 도 1C는 내인성 수준에 비해 PCNA 과발현의 정도를 나타낸다. mPlum-PCNA에 해당하는 밴드는 크기가 커서 느리게 마이그레이션됩니다.
우리는 S 단계에서 이러한 병변에 EXO1b의 PARP1/2 의존적 채용을 조사하기 위해 미세 조사 중에 DSB를 도입하는 것을 목표로했습니다. 도 2A는 저용량 에너지(1000 μs 거주 시간)가 EGFP-FBXL10, DSB 응답자(FRUCC 복합체 8의성분)의 모집을 유도하지 않는 반면, NTHL1-mCherry의 모집을 유도하기에 충분했지만, 염기 절제 수리(BER) 경로 단백질, 산화 DNA 손상1,12, 121의부위에 모집하는 것을 나타낸다. 3000 μs 거주 시간, EGFP-FBXL10 및 NTHL1-mCherry 모집, 산화 병변과 DSB를 모두 생성 하는 레이저 출력을 시연. 이러한 결과 강화, 도 2B는 γH2A.X에 대 한 염색 면역 fluorescence 보여줍니다 (DSB 마커), 이는 분명히 더 높은 에너지 용량을 사용 하는 경우. PCNA는 레이저 거주 시간 설정으로 적절하게 모집하기 때문에 성공적인 미세 조사를위한 세포 주기 마커와 마커 역할을합니다. 중요하게도, 외인성 및/또는 내인성 형광 단백질 태그 PCNA 모두 유사하게 행동함에 따라 이 리포터 기능에 사용될 수있다(도 3). 내인성 태그 PCNA는 PCNA 궤적13의 하나의 대립구체에 첫 번째 엑시온과 함께 프레임에 mRuby를 삽입하여 설계되었다 (세포선은 외르그 맨스펠트의 종류 선물이었다).
도 4A 및 도 4C는 S상 세포에서 AcGFP 태그EXO1b의 모집을 나타낸다. EXO1b는 약 1 분 정도 미세 조사 사이트에 축적의 최대 수준에 도달하고 천천히 나중에 DNA 병변에서 분리하기 시작합니다. 미세 조사 부위의 농축은 그래프의 &gt; 1 상대 형광 장치에 의해 표시됩니다. olaparib의 존재에서, 1 분에 레이저 스트라이프에 EXO1b의 축적은 차량 제어에 비해 상당히 적습니다. 이러한 결과는 문헌6,7과일치한다. 도 4B는 프로토콜의 점 6에 설명된 바와 같이 정량화(영역 A, B 및 C)에 대한 대표 영역을 보여 줍니다. 도 4D는 마이크로 조사에 사용되는 세포에서 내인성 EXO1b 및 외인성 EXO1b-AcGFP의 유사한 발현 수준을 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg"> 그림 1: PCNA의 국소화 패턴. (A)이미지는 U-2 OS 세포에서 세포 주기 전반에 걸쳐 안정적으로 통합된 외인성 PCNA의 국소화 패턴을 보여준다. (B)이미지는 U-2 OS 셀에서 S 상(초기, 중, 후기)의 상이한 단계에서 PCNA 포시 패턴을 보여준다. (C)영상에 사용되는 U-2 OS 세포에서 내인성 및 외인성 수준의 PCNA를 나타내는 서양 블롯. 배율 막대는 20 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">μm을 나타냅니다.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg"> 도 2: 최적화된 레이저 출력을 통해 DSB의 유도. (A)레이저 설정은 다양한 형태의 DNA 손상을 유도하도록 최적화할 수 있다. EFP-FBXL10 및 NTHL1-mCherry를 안정적으로 발현하는 U-2 OS 세포는 각각 DSB및 산화 병변 부위를 식별하는 데 사용되었다. 405 nm 레이저 라인을 가진 마이크로 조사는 1000 μs 또는 3000 μs 의 거주 시간을 가진 비동기 U-2 OS 세포에서 수행되었다. 스케일 바는 20 μm을 나타낸다.(B)γH2A.X에 대한 면역형광 염색은 mRuby 태그 내생 PCNA를 갖는 인간 망막 색소 상피 세포(hTERT RPE-1)에서 수행되었다. 세포는 1000 μs 또는 3000 μs 가거주 시간으로 미세 조사 후 5분 후에 고정 및 처리되었습니다. 배율 막대는 20 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">μm을 나타냅니다.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg"> 그림 3: 내인성 mRuby-PCNA 및 외인성 mPlum-PCNA를 1000 μs 또는 3000 μs 레이저 거주 시간에 미세 조사 부위에 비교 모집합니다. 내인성 및 외인성 태그PCNA 는 S 단계 동안 복제 foci를 형성한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg"> 그림 4: S 단계에서 EXO1b의 PARP1/2 의존 모집. EXO1b-AcGFP 및 mPlum-PCNA를 안정적으로 발현하는 U-2 OS 세포는 3000 μs 거주 시간을 사용하여 405nm FRAP 레이저 라인으로 마이크로 조사되었다. (A)차량 제어(DMSO) 또는 olaparib(1 μM)를 통해 사전 처리 후 표시된 시점에서 마이크로 조사 된 세포의 대표적인 이미지. 스케일 바는 채용 분석을 위해 A, B 및 C 영역의 정의된 영역의 대표적인 이미지인 20 μm.(B)를나타낸다. 스케일 바는 20 μm을 나타낸다.(C)DNA 손상 모집 역학은 살아있는 세포 이미징에 의해 포착되었다. 상대적 평균 형광 값과 이미지는 12 분 동안 5 초마다 획득되었습니다. 각 조건에 대해, ≥30세포를 평가하였다. 평균 상대형광값(솔리드 블랙라인)과 표준 오차(그늘진 영역에 의해 시각화된 범위)가 시간에 대해 플롯되었다. 대시 라인은 마이크로 조사 후 1 분에서 채용 값을 보여줍니다. DMSO(n=32)와 올라파리브(n=31) 치료의 차이는 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 계산하였다. 아스테릭스는 p&lt;0.0001을 나타냅니다. (D)서양 블롯은 마이크로 조사에 사용되는 세포에서 내인성 EXO1b 및 외인성 EXO1b-AcGFP의 발현 수준을 비교한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 레이저 미세 조사에 의한 DNA 수리 단백질 모집 측정과 같은 하류 현미경 연구를 위한 S상 세포를 효율적으로 식별하는 비침습적 방법을 설명합니다.

S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

이 프로토콜은 세포 주기 단계를 고려하여 DNA 손상 복구 단백질의 공간 및 측두적인 모집을 이해하는 데 도움이됩니다. 세포 주기 차별을 위해, 우리는 다른 세포 주기 동기화 방법에 의해 소개된 유물을 우회하는 S 단계의 마커로 형광 단백질 태그 PCNA를 이용합니다. 이것은 레이저 기지를 둔 미세 조사와 결합된 DNA 손상 복구 단백질 운동학에 비교할 수 없는 현면 적 해결책을 줍니다.프로토콜의 일상적인 활용에 성공하면 공초점 이미징에 대한 기본적인 지식이 구축됩니다. 마이크로 조사 24시간 전에, 500마이크로리터에서 네 번째 세포에 총 8x10을 4웰 챔버 커버 글래스에 1밀리리터의 미디어에 플레이트. 미세 조사 1시간 전에 일반 성장 배지를 olaparib 또는 DMSO와 같은 차량 제어를 포함하는 이미징 매체와 교환합니다.이미징 하기 전에 적어도 4 시간, 환경 챔버와 현미경 구성 요소를 켭니다. 난방, 이산화탄소 공급 및 습도 조절장치를 켭합니다. 현미경으로 세포를 전송하기 전에 적어도 1 시간 레이저 라인과 함께 광원을 초기화.현미경 목표를 오일과 현미경 아래에 챔버 커버 유리를 배치합니다. 비동기 집단에서 S 상 세포를 선택하려면, S 단계에서 태그된 PCNA의 고유한 국소화 패턴을 위해 안구를 살펴보고 미세 조사를 위한 충분한 S 상 세포가 있는 시야를 선택한다. 관련 소프트웨어를 사용하여 이진 선을 삽입하여 미세 조사에 대한 관심 영역을 설정합니다.원하는 라인 수와 간격을 설정하려면 바이너리를 클릭한 다음 원하는 라인 수를 그리기 위해 인서트 라인, 원 및 타원을 선택한 다음 ROI를 클릭하여 이러한 이진 선을 자극 ROI로 변환한 다음 이진선을 ROI로 이동한 다음 ROI로 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 활성화 ROI S1로 사용을 선택합니다. 이 선을 시야에 배치하여 세포의 핵을 통과합니다. 마이크로 조사 전에, 이후 분석을 위해 PCNA foci를 식별하기 위해, A1 LFOV 컴팩트 GUI및 A1 LFOV 스캔 영역 창에 필요한 매개 변수를 설정하여 시야의 고해상도 이미지를 가져 와서 캡처 버튼을 누르십시오. 마이크로 조사를 설정하려면 ND 자극 탭을 열고 시간 일정 창에 액세스하여 일련의 사전 자극 이미지를 획득한 다음 Galvano 스캐너를 사용하여 일련의 자극 후 이미지를 수집합니다.시간 예약 창에 세 단계를 설정합니다. 인수 및 자극 열에서 3단계에 대해 각각 인수, 자극 및 인수를 선택합니다. 자극 단계의 경우 S1을 ROI로 설정합니다.Galvano XY 창에서 405 나노미터 레이저 라인에 대해 100% 레이저 출력을 설정하고 미세 조사를 위한 거주 시간을 설정합니다. 원하는 시간 경과 이미징을 원하는 시간 경과 및 간격에 설정하려면 시간 일정 A1 LFOV 컴팩트 GUI 및 A1 LFOV 스캔 영역 창을 사용합니다. A1 LFOV 컴팩트 GUI 창에서 이미징 중에 사진 표백을 줄이기 위해 레이저 전력 백분율, 게인 및 오프셋 설정을 최적화합니다.단백질의 역학에 따라 시간 일정 창에서 제 3 상 획득 행에 대해 원하는 간격과 기간을 설정하여 이미지 또는 총 타임랩스의 간격을 연장또는 단축한다. 마이크로 조사 및 후속 타임랩스 이미징을 실행하려면 지금 실행하십시오. 타임랩스 이미징의 끝에서 자극 ROI를 별도의 이미지로 저장하여 분석에 사용되는 다운스트림 소프트웨어에서 미세 조사 좌표를 식별하는 데 유용합니다.PCNA는 G1 및 G2 상에서 핵에 완전히 균일한 분포를 가지고 있습니다. S 단계에서 PCNA는 핵에서 밝은 반점으로 시각화할 수 있는 DNA 복제 부위를 국소화합니다. 초기 S 상 세포에서, 반점은 세포의 핵을 통해 상대적으로 작고 동등하게 분포된다.S 단계 중반으로 진행되는 동안, 반점은 흐리게되고 핵과 핵의 둘레를 향해 더 국한된다. 후반 S 단계에서는 스팟이 줄어들지만 PCNA가 후반 복제 사이트에 집중됨에 따라 점점 더 커집니다. 1, 000 마이크로초의 저용량 에너지는 이중 파손 대응자인 EGFP-FBXL10의 모집을 유도하지 않지만 산화 DNA 손상 부위에 모집되는 기본 절제 수리 경로 단백질인 NTHL1-mCherry의 모집을 유도하기에 충분합니다.3, 000 마이크로초가 거주하면서 EGFP-FBXL10과 NTHL1-mCherry가 모두 모집되어 산화 병변과 이중 좌초 된 휴식을 모두 생성하는 레이저 출력을 시연합니다. EXO1b는 1분 전후의 축적 및 미세 조사 부위의 최대 수준에 도달한 다음 DNA 병변에서 서서히 분리하기 시작합니다. olaparib의 존재에서, 1 분에 레이저 스트라이프에 EXO1b의 축적은 차량 제어에 비해 상당히 적습니다.현미경은 가열할 충분한 시간이 주어지며, 일관된 결과를 보장하기 위해 각 실험에 문화와 조건이 최적이라는 것이 중요합니다. 또한, 특정 DNA 병변을 테스트 하기 위해 다른 DNA 손상 기자와 레이저 설정을 최적화 하는 것이 중요 하다. 미세 조사에 따라 분획, 면역 침전 또는 ChIP와 같은 고전적인 생화학 적 방법으로 결과를 검증하는 것이 좋습니다.이러한 접근은 더 큰 세포 인구를 샘플링하여 통계적 강도를 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

임의의 점 kinematograms과 컴퓨터 - 생성 무척추 동물의 비디오 재생을 고용 op​​erant 조절 패러다임을 사용하는 도마뱀의 시각적 감도를 테스트.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

GFP - 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle - GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

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인간의 급성 신장 상해 (아키)는 신장 nephrons을 구성하는 상피 세포 손상으로 인한 일반적인 임상 문제, 그리고 아키는 50~70% 1 높은 사망률 속도와 연결되어 있습니다. 이 현상을 안내하는 메커니즘과 한계가 제대로 이해 남아 있지만 상피 세포의 파괴에 따라 nephrons은 재생에 제한 기능이 있습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 타겟 레이저 zebrafish 배아 신장의 신장 nephron 세포의 박리 또는 pronephros위한 기술을 설명합니다. 새로운 방법은 아키의 nephrotoxicity 유도된 모델을 보완하고 신장 nephron의 상피 조직이 재생된과 관련된 세포 및 분자 변경의 고해상도 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

배우세요 S 단계에서 레이저 미세 조사를 이용한 DNA 손상 복구 단백질 모집 동역학 분석 방법을. 형광 표지 PCNA로 S 단세포를 식별하고 공초점 현미경으로 실시간 관찰합니다.

S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

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