Name: 챔버 기술을 사용하여 기본 조직의 장 타이트 접합 장벽 및 이온 투과성의 기능 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 배우세요 Ussing 챔버 기술로 장 상피 조직의 타이트 접합 이온 투과성을 평가하는 방법을. Claudin-15 녹아웃 마우스를 사용하여 나트륨 선택 투과성을 정량 분석하고 생리학적 기능을 실시간으로 측정합니다.

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이 작업은 17K00860(HH로) 및 19K20152(NI로)에서 지원됩니다. WH는 오츠카 도시미 장학금 재단이 2018-2021 년의 재정 지원을 인정하고자합니다.

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저자는 공개 할 잠재적 인 이해 상충이 없습니다.

이 실험에서, Ussing 챔버는 Cldn15-/- 및 WT 마우스의 소장에서 NaCl의 기준선 전기 파라미터 및 희석 전위를 측정하기 위해 사용되었다. Ussing 챔버 실험을 수행 할 때 실험에 사용 된 멤브레인 준비가 실행 가능한지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 일반적으로 포도당 또는 아데닐레이트 사이클라제 활성화제 포스콜린을 첨가하고 Isc (마우스에서 100-300 μA / cm2)에 적절한 상승이 있는지 여부를 확인함으로써 수행됩니다. 장 제제가 사용하기에 허용되는지 여부를 평가하는 또 다른 방법은 조직의 전도도를 보는 것입니다. 손상된 조직은 종종 정상 전도도(정상 전도도: 마우스의 경우 ~20-60 mS/cm2)보다 높은 반면, 근육층이 적절하게 벗겨지지 않은 조직은 정상보다 낮은 전도도를 갖는 경향이 있습니다(그림 2). 모든 Ussing 챔...

Ussing 챔버 방법은 덴마크 과학자 Hans Ussing에 의해 처음 개발되었습니다. Ussing은 NaCl이 가파른 농도 구배에 대해 피부를 가로 질러 수송 될 수 있다는 것을 관찰 한 후 개구리 피부를 가로 질러 나트륨 수송의 단락 전류를 측정하기 위해 처음 사용했습니다1. 그의 시스템은 피부의 양쪽에 접근 할 수있는 두 개의 챔버 사이에 장착 된 개구리 피부로 구성되었습니다. 각 챔버에는 순환되고 폭기된 링거의 용액이 들어 있었다. 피부 근처에 위치하여 포화 KCl-calomel 전극에 연결된 두 개의 좁은 한천 링거 브릿지는 포텐셔너에 의해 판독된 전위차를 측정하였다. 두 번째 한 쌍의 한천 링거 브리지는 배터리에 의해 제공되는 기전력을 인가하기 위해 AgCl로 포화된 KCl을 갖는 비커에 연결된 각 챔버의 반대쪽 끝에 위치하였다. 전위 분배기를 사용하여 전압을 조정하여 피부 전체의 전위차가 제로로 유지되어 단락 조건을 만들었습니다. 마이크로암페어 미터는 또한 피부를 통과하는 전류를 판독하기 위해 연결되었다(원래의 챔버 설계에 대해서는 ref.1 의 그림 참조).
지난 70 년 동안이 기술은 영양소와 이온 수송을 연구하기 위해 많은 다른 조직, 특히 장 조직에 적용되었습니다. 예를 들어, 콜레라-유도된 설사의 메카니즘은 이들 챔버에 토끼 장폐색을 장착함으로써 연구되었고, 콜레라 독소-유도된 설사가 cAMP2에 의해 매개된다는 것이 발견되었다. 또한, 이들 챔버는 또한 Na+-글루코스 공수송체 1 (SGLT1)3을 통한 글루코스 수송의 기초가 되는 메카니즘을 연구하는데 사용되었다. 우리 실험실은 장 상피 세포에서 세포 횡단 및 부세포 수송에 중점을 둡니다. Ussing 챔버 방법을 사용하여, 펩티드 수송을 부세포 나트륨 수송에 장애가 있는 클라우딘 15 녹아웃 마우스에서, 비가수분해성 디펩티드 글리실사르코신의 흡수를 측정하기 위해 어싱 챔버를 사용하여 평가하였다. 발광 Na+ 항상성이 양성자 결합 펩티드 수송에 중요하다는 것이 밝혀졌다4. 또한, 이들 챔버는 또한 세린 프로테아제 트립신5에 의한 프로테이나제 활성화 수용체 1의 점막하 활성화에 반응하여 뮤린 맹장에서의 음이온 분비를 조사하기 위해 사용되었다.
Ussing chambers는 또한 최근에 상피 조직에서 부세포 경로를 평가하기 위해 사용되었습니다. 부세포 경로는 두 개 이상의 세포가 만나는 지점에서 형성되는 단백질의 복합체인 타이트한 접합부에 의해 조절됩니다6. 장벽 기능 및 이온 선택성 (음이온 또는 양이온이 선택적으로 타이트 접합부를 통과 할 수 있는지 여부)은 클라우딘 패밀리 단백질의 존재에 의해 결정됩니다. 이들 중 일부는 장벽 (클로딘 3 및 7), 음이온 기공 (클로딘 10a) 또는 양이온 기공 (클로딘 2, 10b 및 15)7로 작용한다. 다른 방법들이 혈장 FITC 농도8을 수반하는 FITC의 경구 위관과 같은 부세포 경로를 평가하기 위해 사용되었다8, 또는 EDTA-Cr9; 그러나 이러한 기술은 분해능이 낮으며 이온 선택성 또는 장 부분의 특정 부분을 평가할 수 없습니다. 그러나 어싱 챔버는 표적 이온의 희석 전위를 평가하고, 따라서 타이트한 접합부의 이온 선택성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, NaCl을 사용하는 경우, Na+ 및 Cl-에 대한 타이트한 접합부의 선택성은 막의 한쪽(보통 점막측)을 희석하고 경상피 전위차의 변화를 측정함으로써 계산할 수 있다. Na+ 및 Cl-의 상대적 투과도는 Goldman-Hodgkin-Katz 방정식10에 의해 추정될 수 있으며, 타이트한 접합부의 선택성은 Kimizuka-Koketsu 방정식 11을 사용하여 추정될 수 있다. 따라서, 이들 챔버는 조직의 전기생리학적 파라미터를 측정하는 이점을 가지며, 그 결과 다른 낮은 분해능 방법보다 타이트한 접합부를 통한 이온의 통과에 대한 더 많은 정보를 제공한다.
Ussing 챔버 방법은 장에 국한 될뿐만 아니라 장에 관한 연구에서 널리 사용되지만 다른 많은 응용 프로그램도 있습니다. 예를 들어, 이들 챔버는 낭포성 섬유증, 및 구체적으로 염화물 채널 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR)12를 연구하는데 사용되어 왔다. 낭포성 섬유증은 CFTR13의 돌연변이에 의해 발생하며, 이는 호흡기 상피 세포에 의한 염화물 분비 및 유체 수송 장애를 초래하고, 결과적으로 더 두껍고 건조한 점액층14을 초래한다. 기도 상피 CFTR에 대한 연구는 질병을 이해할뿐만 아니라 질병을 치료하는 방법을 발견하기 위해이 챔버로 수행되었습니다. 예를 들어, 낭포성 섬유증을 일으키는 희귀 돌연변이를 가진 환자에서, 환자 호흡 상피 세포의 분석은 오르캄비 및 증폭기 공동요법15와 같은 치료법을 시험하는데 사용되어 왔다.
Ussing chambers는 또한 약물 섭취 및 약물 동태학을 연구하기 위해 인간 생검 조직과 같은 약물 전달 경로를 연구하는 데 사용되었습니다16. 장 흡수가 약물 전달의 유일한 경로는 아닙니다. 이들 챔버는 또한 비강 약물 전달 시스템을 연구하는데 사용되었다17. Ussing 챔버를 이용한 약물 전달 연구도 눈에 대해 수행되었습니다. 토끼 각막에서 투과성 및 흡수 연구는 조직 전반에 걸쳐 약물의 흡수를 증가시키기 위해 고안된 약물 인 Labrasol을 사용하여 수행되었습니다18. 또 다른 연구는 토끼 공막에서 경공막 약물 전달에 대한 벤질 알코늄 클로라이드의 효과를 조사했다19.
Ussing 챔버 방법은 네이티브 조직을 사용할 수 있기 때문에 유용합니다. 이와 같이, Caco-2 세포주와 같은 시험관내 모델보다 바람직하다. 그러나이 기술은 시편을 준비하는 데 기술과 시간이 필요하므로 높은 처리량 응용 분야에는 적합하지 않습니다. 세포 단일층의 전기생리학적 특성은 이들 챔버 내의 세포 배양 삽입물을 사용하여 연구될 수 있다. 최근의 발견은 상피 또는 내피 줄기 세포의 수확으로부터 배양물에서 성장한 미니 기관인 오가노이드의 배양을 허용하였다20. 오가노이드 배양은 단층에서 성장하도록 조작될 수 있고, 이로써 오가노이드를 Ussing 챔버21에 장착할 수 있게 한다. 다양한 상피 및 내피 조직의 오가노이드를 연구 할 수 있으며, 오가노이드 배양이 장기간 유지 될 수 있으므로 필요한 동물의 수를 줄입니다. 이것은 또한 시간이 많이 걸리고 힘든 조직 해부 및 준비 단계가 필요하지 않기 때문에 처리량을 증가시킵니다. 앞으로, Ussing 챔버 연구는 조직 수송을 연구하는 데 매우 유용 할 것이며 개인화 된 의학 분야에서 특히 중요 할 것입니다.
다음 프로토콜은 NaCl의 희석 전위를 측정함으로써 클라우딘 15 녹아웃 (Cldn15-/-) 마우스 및 야생형 (WT) 대조군의 소장에서 팽팽한 접합부의 permselectivity 및 장벽 기능을 평가하기 위한 어싱 챔버 방법의 적용을 입증한다. 타이트한 접합부(TJ)는 둘 이상의 세포가 상피 및 내피 조직에서 만나는 지점에서 형성된다. 이세포 타이트 접합 (bTJ), 특히 bTJ 내에서 발견되는 클라우딘 패밀리 단백질은 TJ7의 장벽 기능 및 투과성을 결정하는 것으로 생각된다. Cldn15-/- 마우스는 메가 소장22 및 클라우딘 154,23,24를 통해 발생하는 장 Na+ 재활용의 손실로 인해 감소된 영양 섭취 능력을 갖는다. Cldn15-/- 마우스는 Na+ 항상성을 손상시켰으며, 이는 TJ의 permselectivity를 연구하는 흥미로운 모델이 된다. 다음 프로토콜은 중간 소장에서 NaCl (PNa / PCl)의 희석 전위를 측정하여 NaCl에 대한 TJ의 투과성을 평가합니다. 간략하게, 멤브레인의 한쪽을 희석함으로써 발생하는 막 전위차의 변화 (M면 또는 S측, 둘 다 아래 프로토콜에서 측정됨)는 Na+ (PNa) 및 Cl-(PCl)의 투과성을 계산하는데 사용될 수 있고, 희석 전위 (PNa/PCl)는 타이트한 접합이 양이온성 또는 음이온성 선택성을 갖는지 여부를 보여줄 것이다.
이 프로토콜의 실험은 장 준비가 수직으로 장착되는 두 개의 반쪽으로 구성된 맞춤형 어싱 챔버 (그림 1A)를 사용하여 수행되었으며, 전압 클램프 증폭기, 전기 레코더, 전극, 소금 다리, 링거 용액, HEPES 버퍼 (150 mM NaCl), 희석 된 HEPES 버퍼 (75 mM NaCl), 장 준비 (장비에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조).

<table><tbody><tr><td># 3 폴리 에틸 튜빙</td><td>Hibiki</td><td></td><td>외경 1.0 mm; 내경 0.5 mm</td></tr><tr><td>#7 폴리 에틸 튜빙</td><td>Hibiki</td><td></td><td>외경 2.3 mm; 내경 1.3 mm</td></tr><tr><td>10 mL 잠금 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-10LZ</td><td></td></tr><tr><td>19g 바늘</td><td>Terumo</td><td>NN-1938R</td><td>바늘로 작업할 때 주의하고 날카로운 물건 용기에 버리십시오</td></tr>. <tr><td>23g 바늘</td><td>Terumo</td><td>NN-2332R</td><td>바늘로 작업할 때 주의하고 날카로운 물건 용기에 버리십시오</td></tr>. <tr><td>5mm 펀치</td><td>NA</td><td></td><td>NA 여과지와 파라필름 침에 구멍을 뚫는 데 사용하십시오</td></tr>. <tr><td></td><td>Seirin</td><td>NS</td><td>해부 플레이트에 조직을 고정하는 해부 핀으로 사용됩니다.</td>한천에 조직을 고정하는 해부 핀으로 사용하십시오</tr>.<tr><td></td><td>Fujifilm Wako</td><td>010-15815</td><td></td></tr><tr><td>Alligator clips</td><td>NA</td><td></td><td>전극을 증폭기</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fujifilm Wako</td><td>038-00445</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Fujifilm Wako</td><td>133-00845</td><td>이것은 희석의 삼투압 차이를 보정하는 데 사용됩니다. HEPES 완충액</td></tr><tr><td>D(+)-포도당</td><td>Fujifilm Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>해부 키트</td><td></td><td></td><td>, 가위와 구부러진 집게</td></tr><tr><td>해부 플레이트</td><td></td><td></td>가 필요합니다 <td>우리는 10cm 세포 배양 플레이트를 사용하고 실리콘 고무로 덮었습니다</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301-500ML</td><td>forskolin 재고 제조용</td></tr><tr><td>전기 레코더</td><td>TOA Electronics</td><td>PRR-5041</td><td>기타 동등한 전기 레코더는 상업적으로 이용 가능합니다</td>.</tr><tr><td>상피 전압 클램프 증폭기</td><td>Nihon Kohden</td><td>CEZ9100</td><td>다른 동등한 증폭기는 상업적으로 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>여과지, 사각형으로 잘라</td><td>NA</td><td></td><td>NA 5mm 펀치로 펀칭, 장 준비</td></tr><tr><td>미세 집게</td>를 잡는 데 사용 <td>Fast Gene</td><td>FG-B50476</td><td>근육 층의 무딘 해부</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Alomone Labs</td><td>F-500</td><td>DMSO에서 10mM 스톡을 만들고 최종 농도는 10 &마이크로입니다. M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H4034-1KG</td><td></td></tr><tr><td>인도메타신</td><td>시그마</td><td>I7338-5G</td><td>21 mM NaHCO3에 1 mM 스톡을 만들고 최종 농도는 10 &micro입니다. M</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fujifilm Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fujifilm Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>KCl/calomel 전극</td><td>Asch Japan Co.</td><td>SCE-100</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO<>4</td><td>Kanto 화학</td><td>32379-00</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-글루타민</td><td>후지필름 Wako</td><td>074-00522</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fujifilm Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>혼합 가스 (95% O2/5% CO2)</td><td>Shizuoka Oxygen Company</td><td></td><td>Ringer 용액</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fujifilm Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 전극</td><td>NA</td><td>NA</td><td>농축 NaCl 및 은선이 필요한 Handmade 전극</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fujifilm Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>O2 Gas</td><td>Shizuoka Oxygen Company</td><td></td><td>를 사용할 때 Ringer 용액 및 챔버를 버블링하는 데 사용됩니다.HEPES 완충액 파라 필름을 사용할 때 버블링 챔버에 사용</td></tr><tr><td></td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Ussing 챔버 pH 측정기를 밀봉하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td>DKK-TOA Corp</td><td>HM-305</td><td>HEPES 버퍼는 37 °C에서 pH 7.4로 조정해야합니다. C</td></tr><tr><td>pH 측정기 전극</td><td>DKK-TOA Corp</td><td>GST-5311C</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 고무</td><td>Shinetsu Chemical</td><td>KE-12</td><td>해부 플레이트를 채우는 데 사용되는</td></tr><tr><td>은선</td><td>NaCl 전극을 만드는 데 사용되는</td>은선 <td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 뚜껑이 있는 작은 항아리</td><td>NA</td><td></td><td>NA NaCl 전극</td></tr><tr><td>실체 현미경</td>에 사용 <td>Zeiss</td><td>Stemi 305</td><td>실체 현미경을 사용하면 깊이를 볼 수 있으므로 조직을보다 쉽게 해부 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>트리스 (Trizma 베이스)</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>HEPES 완충액의 pH를 조정하기위한 1M 용액 만들기</td></tr><tr><td>Ussing 챔버</td><td>Sanki Kagaku Kougei</td><td></td><td>이 챔버는 창문 직경이 5mm 인 맞춤형 연속 관류 Ussing 챔버입니다</td></tr><tr><td>워터 펌프 및 난방 시스템</td><td>Tokyo Rikakikai Co. Ltd.</td><td>NTT-110</td><td></td></tr></tbody></table> - 무수정유출

챔버 기술을 사용하여 기본 조직의 장 타이트 접합 장벽 및 이온 투과성의 기능 평가

Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique

Ussing 챔버 기술은 개구리 피부를 가로 지르는 나트륨의 세포 간 수송을 연구하기 위해 1951 년 덴마크 과학자 Hans Ussing에 의해 처음 발명되었습니다. 그 이후로,이 기술은 멤브레인을 가로 지르는 수송의 생리적 매개 변수를 연구하기 위해 많은 다른 조직에 적용되었습니다. Ussing chamber 방법은 네이티브 조직을 사용할 수 있기 때문에 다른 방법보다 바람직하므로 생체 내에서 일어나는 일에보다 적용 할 수 있습니다. 그러나 네이티브 조직이 사용되기 때문에 처리량이 낮고 시간이 제한되며 조직 준비에는 기술과 훈련이 필요합니다. 이 챔버는 다양한 조직에서 특정 수송체 단백질을 연구하고, 낭포성 섬유증과 같은 질병 병리 생리학을 이해하고, 약물 수송 및 섭취를 연구하고, 특히 장내 영양 수송에 대한 이해에 기여했습니다. 조직의 전체 상피 수송 과정을 감안할 때, 경상피 경로뿐만 아니라 부세포 경로도 중요합니다. 단단한 접합부는 장 전체에 걸친 조직 특이적 부세포 투과성의 핵심 결정 요인입니다. 이 기사에서, Ussing 챔버 기술은 경상피 전도도 및 희석 전위를 측정하여 이온의 부세포 투과성을 평가하는 데 사용됩니다.

이 백서에 표시된 결과는 완료된 더 큰 프로젝트의 일부인 결과입니다(ref.4,23,24 참조).
소장의 경상피 전기 전도도는 Cldn15-/- 마우스에서 감소된다. Cldn15-/- 마우스에서 중간 소장 세그먼트의 기준선 경점막 전도도(단락 조건 하에서)는 야생형 마우스에서 측정된 것보다 낮았다(도 3A; Cldn15-/- 및 야생형 마우스에서 각각 22.3 mS/cm2 및 48.7 mS/cm2</su...

장 상피는 영양 흡수뿐만 아니라 유해 물질에 대한 보호를 제공합니다. 정점-대부분의 상피 세포간 접합, 즉 타이트한 접합은 부세포 용질 및 이온 투과성을 조절한다. 여기에서, 점막 시트의 제조 및 어싱 챔버 기술을 사용하여 타이트한 접합부의 이온 선택성의 평가를 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog ...

이 프로토콜은 단단한 접합부의 운송 품질을 연구하는 데 사용됩니다. 희석 전위를 사용하여 투과 선택성을 측정하고 조직의 단단한 접합에 대한 이해를 얻을 수 있습니다. 이 기술은 구체적이며 상피의 기능적 연구를 위해 토착 조직을 사용합니다.또한,이 기술은 조직의 실시간 생리적 특성을 측정하여 매우 유용합니다. 가장 큰 도전은 조직 준비입니다. 기술을 연습하고이 비디오를 보는 것이 도움이 될 것입니다.조직 생존력을 확인하는 것도 중요한 단계입니다. 시작하려면 클라우딘-15 녹아웃 마우스에서 수집 한 장 조직의 원하는 세그먼트를 얼음처럼 거품이 많은 링거 (Ringer)의 용액에 넣고 지방과 결합 조직을 잘라냅니다. 지방과 결합 조직을 트리밍 한 후 장간막 부착물을 따라 잘라 각 세그먼트를 세로로 연 다음 세그먼트를 얼음처럼 차가운 링거 용액으로 되돌려 놓고 조각을 철저히 씻으십시오.근육층을 벗기려면 두 세 밀리리터의 신선한 얼음 차가운 거품이 나는 링거 용액을 해부 현미경 아래의 실리콘 고무로 덮인 해부 판에 붓고 핀을 사용하여 점막 쪽이 아래를 향하게하는 접시에서 한 장 조직 세그먼트의 끝을 고정하십시오. 미세한 포셉을 사용하여 근육층을 하부 점막에서 무뚝뚝하게 해부하여 조직에 구멍을 뚫거나 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오. 근육층이 제거되면 직경 다섯 밀리미터 개구부를 위해 충분히 큰 조각을 자르고 검은 색 배경을 사용하여 링거 용액 점막 측면으로 젖은 다섯 밀리미터 펀치 여과지 조각에 조직을 올려 놓고 여과지의 개구부가 주름없이 조직에 의해 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.장내 제제를 Ussing 챔버에 장착하려면 먼저 용액을 분해하기 전에 챔버에서 용액을 제거하십시오. 장내 준비 점막 측면이있는 여과지를 검은 색 표시를 사용하여 점막 측면 챔버 위에 아래로 놓아 챔버 창을 여과지의 구멍과 정렬하십시오. 장 시트를 움직이지 않고 혈청 측 챔버를 점막 측 챔버에 조심스럽게 연결하십시오.HEPES 버퍼로 두 챔버를 빠르게 리필하고 멤브레인에서 멀리 떨어진 각 챔버의 반대쪽 끝에 버블링을 배치하십시오. 솔트 브리지를 다시 연결하고 전압이 안정적인지 확인한 다음 전류를 펄스하여 시스템이 약 15분 동안 평형을 이루도록 하기 전에 연결이 정상인지 확인합니다. 희석 가능성 실험을 수행하기 위해, 먼저 챔버의 양쪽을 측면 당 다섯 밀리리터의 신선한 미리 예열된 HEPES 버퍼로 세척한다.녹화 시스템을 켜고 범위를 250밀리볼트로 설정합니다. 마커 위치를 설정하고 녹음 시스템을 측정하도록 설정하고 Ussing 챔버 시스템을 클램프 모드로 설정합니다. 측정 전위가 안정화되면 측정에 데이터를 사용하십시오.챔버의 점막 쪽에서 HEPES 버퍼를 75 밀리몰 염화나트륨으로 보충 된 5 밀리리터의 가온 희석 HEPES 버퍼로 신속하게 교체하십시오. 막 전위가 최고조에 달하면 점막 측의 희석 버퍼를 신선한 HEPES 버퍼로 교체하십시오. 조직이 생존 할 수 있도록하려면 혈청 측에 10 마이크로 몰의 포스콜린을 첨가하십시오.멤브레인 전위차가 최고점에 도달하고 감소하기 시작하면 실험은 끝났습니다. 경상피 전기 전도도와 기준선 단락 전류를 측정하기 위해 시연 된대로 챔버의 양면을 세척 한 후 5 밀리리터의 신선한 버블 링거 용액을 양쪽에 추가하고 기록 시스템의 범위를 2.5 볼트로 설정하십시오. 마커 위치를 설정하고, 녹음 시스템을 측정하도록 설정하고, Ussing 챔버 시스템을 클램프 모드로 설정합니다.단락 전류와 컨덕턴스가 안정화되면 기준 측정에 데이터를 사용하십시오. 조직이 생존 할 수 있도록하려면 입증 된대로 혈청 측에 Forskolin을 추가하십시오. 멤브레인 전위차가 최고점에 도달하고 감소하기 시작하면 실험은 끝났습니다.이 대표적인 분석에서, 중간 소장 세그먼트의 기준선 경점막 전도도는 야생형 마우스에서 관찰된 것에 비해 단락 조건 하에서 클라우딘-15 녹아웃 마우스에서 더 낮았고, 반면에 기준선 단락 전류는 더 높았다. 루미날 염화나트륨 희석시, 야생형 마우스에서 혈청 측에 대한 양의 전위차가 관찰되었지만, 클라우딘-15 녹아웃 마우스에서는 그 차이가 감소하였다. 유사하게, 염화나트륨의 상대적 투과성은 또한 녹아웃 동물에서 감소하였다.절대 투과성의 계산은 클라우딘-15 녹아웃 마우스에서 나트륨의 절대 투과성이 감소한 반면, 염화물의 절대 투과성은 감소하지 않았으므로, 상대적 투과성의 감소는 나트륨의 투과성의 감소에 기인한다는 것을 시사한다. 예상한 바와 같이, 챔버의 혈청 측에 포스콜린의 첨가는 녹아웃과 야생형 마우스 사이의 단락 전류의 변화에 큰 차이를 야기하지 않았다. 장 세그먼트가 Forskolin에 대한 충분히 큰 반응을 보였기 때문에, 막 제제는 실행 가능한 것으로 간주되었다.적절한 근육층 제거를 수행하고 조직이 실행 가능한지 확인하는 것이 중요합니다. 준비가 실행 가능한지 마우스의 해부 섹션을 헹구십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유기 전기 트랜지스터는 생균과 통합 위장관 상피 장벽을 가로 질러 이온 플럭스를 모니터링하는 데 사용된다. 본 연구에서, 칼슘 킬레이트 EGTA (에틸렌 글리콜 - 비스 (베타 - 아미노 에틸 에테르)-N, N, N ', N'-테트라 아세트산의 존재에 의해 유도 타이트 접합 중단, 관련된 이온 플럭스의 증가, 산)가 측정된다.

유기 전기 트랜지스터와 장벽 조직 혼란의 감지

이 프로토콜은 장 장벽 기능의 생체 외 모델로 절제된 장 조직 제제 또는 "장 주머니"의 사용을 설명합니다. 이 모델은 소화기 질환의 동물 모델에서 특정 장 부위에서 상피 장벽과 점액 겔 층 모두의 무결성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

예 생체 내 창자 주머 니나는 위장 질환 모델에서 점막 투과성을 평가하는

우리는 3 차원으로 성장 카코 -2 세포를 시험관 내 세포 배양 모델 및 마우스 창자의 생체 모델을 이용하여 장내 세로토닌 운반체 (SERT) 기능과 발현의 조절을 연구하는 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법은 다른 상피 수송의 연구에 적용 할 수있다.

방법은 3D로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는

두 가지 방법은 여기 장 장벽 기능을 결정 하 되 게 됩니다. 상피 미터 (볼트/옴)의 조직 문화 우물에서 직접 경작된 epithelia의 transepithelial 전기 저항 측정에 사용 됩니다. 쥐, FITC dextran gavage 메서드는 vivo에서창 자 침투성 결정 하 사용 됩니다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

여기에서 우리는 소장 오르가노이드의 장벽 무결성을 정량화하는 기술을 기술합니다. 이 방법이 살아있는 오르가노이드를 기반으로 한다는 사실은 시간 해결 방식으로 상이한 장벽 무결성 변조 물질 또는 이들의 조합에 대한 순차적 조사를 가능하게 한다.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

Dysregulated 장 상피 장벽 기능 및 면역 반응은 생리적인 모형의 부족 때문에 제대로 조사되지 않는 선동적인 장 질병의 특징입니다. 여기서는 생체 내 점막 투과성 및 백혈구 모집을 연구하기 위해 잘 혈관화되고 외부화된 장 세그먼트를 사용하는 마우스 장 루프 모델을 설명합니다.

표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

본 연구에서, 플루오레세인-이소티오시아네이트 표지(FITC) 덱스트란을 경구 위관영양을 통해 마우스에 투여하여 생체 내 및 혈장 및 대변 샘플 모두에서 장 투과성을 평가합니다. 장 장벽 기능은 많은 질병 과정에서 영향을 받기 때문에 이 직접적이고 정량적인 분석은 다양한 연구 분야에서 사용될 수 있습니다.

Fluorescein-Isothiocyanate-labeled dextran을 사용한 생쥐의 장 장벽 무결성 평가

이 연구는 오가노이드에서 소 장 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 제시하여 숙주-병원체 상호 작용 연구를 위한 향상된 접근성을 제공합니다. 여기에는 멤브레인 무결성 및 기능을 평가하는 방법이 포함되며, 소의 위장 생리학을 모방하는 in vitro 모델을 발전시킵니다. 이 접근법은 향상된 치료 전략을 포함하여 상당한 생물 의학 및 농업 이점을 약속합니다.

Small and Large Intestinal Monolayer interface를 사용한 소 오가노이드 기술의 발전

우리는 이온 채널의 기능에 대한 단일 지점에서 돌연변이의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

배우세요 Ussing 챔버 기술로 장 상피 조직의 타이트 접합 이온 투과성을 평가하는 방법을. Claudin-15 녹아웃 마우스를 사용하여 나트륨 선택 투과성을 정량 분석하고 생리학적 기능을 실시간으로 측정합니다.

챔버 기술을 사용하여 기본 조직의 장 타이트 접합 장벽 및 이온 투과성의 기능 평가

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