Name: 류코데플션 필터-유래 CD34+ 세포가 메가카요시테 분화 및 혈소판 형성을 연구하는 세포 공급원으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 배우세요 류코데플션 필터에서 CD34+ 조혈 전구세포를 분리하여 메가카요시테로 분화시키는 방법을. 이 기술은 혈소판 생성 메커니즘 연구와 약리학적 테스트에 활용됩니다.

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이 작품은 ANR (기관 국가 드 라 Recherche) 그랜트 ANR- 17-CE14-0001-1에 의해 지원되었습니다.

제어 인간 샘플은 연구가 수행 된 수혈 센터에 의해 모집 서면 통보 동의를 준 volonteer 혈액 기증자로부터 얻어졌다 (Etablissement 프랑수아 뒤 상 - 그랜드 에스트). 모든 절차는 프랑스 고등 교육 연구부에 의해 등록및 승인되었으며 AC_2015_2371 번호에 따라 등록되었습니다.기부자는 연구 목적으로 샘플을 사용하기 위해 CODHECO 번호 AC- 2008 - 562 동의 서에 승인을 받았습니다. 헬싱키 선언에 따라 인간 연구가 수행되었다.
1. LRF에서 CD34+ 셀(HP)의 추출 및 선택
<ol><li>
시약준비(LRF 1개)<ol>
<li>여과 된 용출 버퍼 25 mL 준비 : 21.25 mL 의 인산 완충식 살린 (PBS), 산 성산 - 점막 - 덱스트로스 (ACD) 및 1.25 mL의 변형 된 태아 보빈 혈청 (FBS). 0.22 μm을 걸기하고 37 °C에서 놓습니다.</li>
		<li>에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)의 2mM로 PBS 500mL를 준비한다.</li>
		<li>2개의 50mL 튜브에 25mL의 밀도 그라데이션 배지(DGM) (1.077 g/mL)를 폐기하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LRF 백 플러싱 양식(그림 1) 참고: 이 단계에서는 멸균 튜브 용접 기가 필요하며 열가소성 튜브의 멸균 연결을 허용합니다.<ol>
<li>먼저 LRF를 빈 600mL 이송 백과 LRF를 튜브세트(도 1A)에연결합니다. 생물 안전 캐비닛하에서, 빈 가방에 처리된 LRF(xLRF x 25 mL)의 수에 해당하는 필터링 및 준비된 용출 버퍼의 총 부피를 주입한다. 이어서, 30mL 주사기를 사용하여 LRF를 통해 가방의 전체 내용을 부드럽게 흡인시키고, 세포를 새로운 50mL튜브(도 1B)로이송한다.</li>
		<li>적혈구 퇴적물, Dextran 2%로 세포 현탁액을 반으로 희석하고 적혈구를 집계하기 위해 잘 섞는다. 실온(RT)에서 30분 동안 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62499/62499fig01.jpg"> 도 1: LRF 백 플러싱 양식. (a)LRF및 (ii) LRF에 대한 이송 가방의 멸균 연결 및(ii)튜브 세트의 대표적인 방식. (B)셀 수집을 위한 주사기의 연결의 대표적인 방식. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62499/62499fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="3"><li>
PBMC 컬렉션
	<ol>
<li>적혈구 퇴적에 따라 상체를 50mL 튜브로 제거하고 전송하여 PBS-EDTA 2 mM으로 채웁니다. 상체를 위에서 준비한 DGM에 부드럽게 오버레이합니다. 밀도 그라데이션의 표면 평면을 손상시키지 않고 상체가 부드럽게 흐르게 하십시오. RT에서 400 x g의 원심 분리기는 브레이크 오프 모드에서 30 분 동안.</li>
		<li>일회용 이송 파이펫으로 PBMC 레이어를 수집합니다. 각 DGM 튜브에서 새로운 멸균 50 mL 튜브로 세포를 전송합니다. 각 튜브를 PBS-EDTA 2m로 채우고 200 x g에서 PBS-EDTA 2 mM50mL로 두 번 세척하여 RT에서 10 분 동안 브레이크 모드로 세척하십시오.</li>
		<li>파이펫 을 끄고 50 mL PBS-EDTA 2 mM로 셀 펠릿을 풀. 참고: 야간 동안 4°C에서 교반하에서 수집된 세포를 유지하여 절차를 중지할 가능성이 있다. 이어서, 40 μm 셀 스트레이너로 서스펜션을 걸게 하여 형성된 응집체를 제거한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CD34+ 셀 선택
	<ol>
<li>실온에서 400 x g의 셀 수와 원심분리기를 10분 동안 결정합니다.</li>
		<li>CD34 선택 키트의 제조업체에 의해 상세한 PBS-EDTA 2 mM의 적절한 부피에서 슈퍼네티를 완전히 흡인하고 재연한다(108셀에 대한 PBS-EDTA의 300 μL). 적절한 농도에 FcR 차단 시약 및 CD34 마이크로비드를 추가합니다(108셀의 경우 50 μL).</li>
		<li>4°C에서 30분 후, CD34 셀(108셀당 500 μL)의 제조사에 의해 상세한 PBS-EDTA 2 mM의 적절한 부피로 셀 서스펜션을 세척하고 재연한다. 참고: 열당 최대 2 x 109 셀의 통과를 위해 열을 정렬할 때 선택 항목이 만들어집니다.</li>
		<li>자석의 젖은 열 위에 샘플을 전달합니다. PBS-EDTA 2 mM3mL로 두 번 세척하고 PBS-EDTA 2 mM의 5mL로 세포를 엘루트하십시오. 샘플의 순도를 향상시키기 위해 동일한 절차에 따라 새 컬럼에서 두 번째 실행이 필요합니다. 참고: 예상 수 6.1 x 105 셀/LRF(그림2A). LRF 수치가 높을수록 시약 및 메서드를 확장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CD34+ 셀 순도 평가
	<ol>
<li>CD34+ 선택 후 얻어진 100 μL의 알리쿼트에 추가, 인간 CD34-PE 항체의 2 μL 또는 IgG -PE (대조군)의 2 μL. 잘 섞고 4 °C에서 15 분 동안 인큐베이션하십시오.</li>
		<li>PBS와 원심분리기2mL을 400 x g에서 5분 동안 첨가하여 셀을 세척합니다. PBS의 200 μL에서 완전히 흡인 및 재중단.</li>
		<li>그림 2A 및 토론에서와 같이 흐름 세포측정에 의해 순도를 분석한다. 참고: 90% 이상의 CD34+ 셀의 순도가 예상됩니다(그림2Bii).</li>
		<li>CD34+ 셀을 직접 사용하거나 추가 사용을 위해 동결하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CD34+ 셀 동결 참고: CD34+ 세포 동결은 mL당 106세포의 밀도로 수행된다.<ol>
<li>CD34+ 세포 수 결정에 따라 다음과 같은 냉동 보존 매체를 준비합니다: (1) 60% 줄기간 + 40% FBS, (2) 40% 줄기간 + 40% FBS + 20% 디메틸 설프리산화물(DMSO) 및 4°C에서 냉각을 허용한다.</li>
		<li>CD34+ 셀을 실온에서 400 x g에서 5분 동안 원심분리하고 차가운 용액 1에서 펠릿을 다시 한 다음 즉시 차가운 용액 2 (v/v)에 추가합니다.</li>
		<li>냉동튜브를 즉시 -80°C 냉동고에 넣고 24시간 동안 냉동튜브를 액체 질소 탱크로 옮춥시다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 성숙한 프로플라틀 베어링 메가 카요세포를 생산하는 CD34+ 세포의 배양 및 분화
참고: 세포 배양프로토콜(도 3A),세포 배양 절차의 대표적인 방식은 이 섹션에 상세하다.
<ol><li>
CD34+ 셀 해동(필요한 경우)
	<ol>
<li>해동 용액 준비: PBS-20% FBS의 13mL및 15분 동안 37°C에 배치합니다. 냉동튜브를 작은 얼음 결정이 하나만 갈 때까지 37°C 의 수조로 빠르게 옮기습니다. 생물학적 배양 캐비닛하에서 전체 함량을 피펫하고, 예동 해동 용액의 13mL로 천천히 전송한다.</li>
		<li>셀 수와 셀 생존 가능성을 결정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 프로토콜, 1단계: 0일부터 7일까지 참고: 일반적으로 배양은 20,000개의 실행 가능한 세포/cm2에대응하는 40,000개의 실행 가능한 세포/mL의 밀도에서 잘 당 1 mL의 매체를 가진 24웰 플레이트에서 만들어집니다. 확장이 계획되어 있으면 이 밀도를 존중하는 것이 중요합니다.<ol>
<li>성장 매체 준비 : 혈청이없는 혈토포이틱 세포 팽창 매체 (이전에 37 °C로 가열)에서 페니실린 - 연쇄상 구균 - 글루타민 (PSG) 1x, 인간 저밀도 지단백 (hLDL)을 20 μg /mL, 메가 카르요시테 팽창 1x 및 줄기 줄기 11의 사이토카인 칵테일을 추가합니다.</li>
		<li>세포 파종 : 5 분 동안 실온에서 400 x g에서 해동 된 CD34 + 세포를 원심 분리합니다. 상체를 철저히 제거하고 배양 배지의 1mL에서 세포 펠릿을 재일시 중단하고 세포를 시드하는 적절한 부피를 결정하는 세포 수치 및 생존성을 수행한다.</li>
		<li>원심분리기 세포는 실온에서 400 x g를 5분 동안 원심분리하고 따뜻한 성장 배지의 적절한 부피로 펠릿을 재연한다. 7 일 동안 5 % CO2로 37 °C에서 세포를 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 프로토콜, 2단계: 7일부터 13일까지(그림 3B,13일째 대표 이미지) 참고: 일반적으로 배양은 25,000개의 실행 가능한 세포/cm²에 해당하는 50,000개의 실행 가능한 세포/mL의 밀도에서 잘 당 1 mL의 매체를 가진 24웰 플레이트에서 만들어집니다. 확장이 계획되어 있으면 이 밀도를 존중하는 것이 중요합니다.<ol>
<li>성숙 배지 준비: 혈청이 없는 조혈 세포 팽창 매체(이전에 는 37°C로 가열)에서 PSG 1x, hLDL 20 μg/mL, TPO at 50 ng/mL, SR1을 1 μM에 첨가한다.</li>
		<li>현미경의 밑에 세포를 검사합니다. 7일째에, 세포는 너무 냉수하지 않고 우물이나 플라스크를 채우면 둥글고 균일한 외관을 표시합니다.</li>
		<li>생물 안전 캐비닛 에서 15 mL 튜브에서 세포를 부드럽게 전달합니다. PBS로 우물을 씻으시면 됩니다. 그런 다음 셀 수를 결정하고 세포를 시드하는 적절한 부피를 계산할 수 있는 생존력을 결정합니다.</li>
		<li>실온에서 400 x g의 세포를 5 분 동안 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 이전 단계에서 계산된 웜 미디어의 적절한 부피에서 셀을 다시 일시 중단합니다. 세포를 37°C, 6일 동안 5%CO2로 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
13일째에 배양혈소판 방출
	<ol>
<li>프로스타글란딘 I2(PGI 2)의 0.5 μM과 0.02 U/mL의 어피라제를 배양에 추가하고 1mL 파이펫으로 5회 연속 파이펫을 연주합니다. 참고 : 혈소판은 이제 매체로 방출됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 유동 세포측정 분석(MK 페노티핑 및 배양 혈소판 수)
참고: 이 프로토콜은 선택한 배양 일에 셀의 페노티핑에 적용할 수 있습니다. 또한 배양 된 혈소판 방출의 수(도 4A,B)의측정을 허용합니다.
<ol><li>
MK 분석 준비
	<ol>
<li>다음과 같이 마이크로 센심 분리기 튜브의 네 세트를 라벨 : 제어로 표시되지 않은 세포, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488, 셀 + 5 μL CD34 - PECy7, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488 + 5 μL CD34 - 5 μL CD34 - PECy7. 튜브 당 최소 1.105 세포를 사용 하 여 튜브 당 1.106 세포를 초과 하지 마십시오. 세포측정관 및 상이한 항체당 세포 현탁액의 100 μL에 추가하십시오. 4 °C에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.</li>
		<li>그런 다음 튜브당 PBS-EDTA 2mM의 2mL을 넣고 상온에서 5분 동안 400 x g의 원심분리기를 추가합니다. 원심 분리 하는 동안, PBS-EDTA 2 mM + 7-아미노 락티노마이신-D (7AAD) (1/100)의 솔루션을 준비 하 고, 튜브 당 300 μL 용액을 허용.</li>
		<li>상체를 제거하고 7AAD와 PBS-EDTA 2 mM의 300 μL에서 펠릿을 차지합니다. 30분 이내에 유동 사이토미터를 통해 샘플을 실행합니다. 참고: 흐름 세포측정에 대한 분석 전략은 그림 3C 및 토론에표시됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
배양 혈소판 분석을 위한 튜브 준비
	<ol>
<li>다음과 같이 마이크로 센심 분리기 튜브의 네 세트를 라벨 : 제어로 표시되지 않은 세포, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488, 셀 + 20 μL CD42a - PE, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488 + 20 μL CD42a - PE. 배양에서 5회 연속 배관에 이어, 형광구의 보정수를 포함하는 세포형을 위해 튜브에서 서스펜션의 300 μL을 이송한다.</li>
		<li>30 분 동안 RT에서 어둠 속에서 항체를 추가하고 배양하십시오.</li>
		<li>30분 이내에 유동 사이토미터를 통해 샘플을 실행하고 5,000개의 구슬 을 통과하는 데 대한 인수를 설정합니다. 참고: 흐름 세포측정에 대한 분석 전략은 그림 4B 및 토론에서표시됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Deutsch, V. R., Tomer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+development+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte development and platelet production.</a> British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).</li>
<li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li>
<li>de Sauvage, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+megakaryocytopoiesis+and+thrombopoiesis+by+the+c-Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand.</a> Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).</li>
<li>Almomani, M. H., Mangla, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlmomani%2C+MH+%22StatPearls%22">StatPearls</a>. , (2020).</li>
<li>Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+mice+lacking+the+GPIb-V-IX+complex+question+the+role+of+this+receptor+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).</li>
<li>Delalat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+stem+cells+and+their+cotransplantation+with+or+without+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells.</a> Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).</li>
<li>Yin, T., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niches+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The stem cell niches in bone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).</li>
<li>Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+megakaryocytes+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells.</a> Bio-protocol. 5 (21), 1639(2015).</li>
<li>Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discarded+leukoreduction+filters%3A+a+new+source+of+stem+cells+for+research%2C+cell+engineering+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy.</a> Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).</li>
<li>Lapostolle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulating+hematopoietic+stem+cells+from+steady-state+blood+before+and+after+ex+vivo+culture+are+enriched+in+the+CD34%28%2B%29CD133%28%2B%29CXCR4%28low%29+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction.</a> Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).</li>
<li>Ivanovic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-blood+leuko-depletion+filters+as+a+source+of+CD+34%2B+progenitors+potentially+usable+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy.</a> Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor-dependent+enrichment+of+a+megakaryocytic+precursor+with+a+high+potential+to+produce+proplatelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets.</a> Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).</li>
<li>Do Sacramento, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+platelets+derived+in+vitro+from+CD34%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 914(2020).</li>
<li>Blin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+model+of+the+platelet-generating+organ%3A+beyond+bone+marrow+biomimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics.</a> Scientific Reports. 6, 21700(2016).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulence+activates+platelet+biogenesis+to+enable+clinical+scale+ex+vivo+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production.</a> Cell. 174 (3), 636-648 (2018).</li>
<li>Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+system+for+the+in+vitro+study+of+megakaryocytes+and+functional+platelet+production+using+silk-based+vascular+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).</li>
</ol>

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이 프로토콜은 혈액 유래 HP로부터 프로플라판을 방출하고 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 MK를 생산하는 방법을 설명합니다. HP는 혈액 은행의 부산물인 LRF로부터 수득되며, 세포 혈액 제품에서 백혈구를 오염시키는 것을 제거하고 불리한 반응을 피하는 데 사용됩니다. 이 방법은 비교적 간단하지만 몇 가지 점은 특별한주의를 기울일 자격이 있습니다.
밀도 그라데이션 배지(Step 1.3.1)에 대한 세포 현탁액의 침착은 혼합물(적색 함량)을 피하기 위해 부드럽게 수행되어야 한다. 이 단계가 신중하게 수행되지 않으면 이 시점에서 프로토콜을 중지해야 합니다. 마찬가지로, 또한 1.3.1 단계에서 브레이크는 분수를 혼합하지 않도록 오프 모드에 있어야합니다. 그렇지 않은 경우 HP 선택을 중단해야 합니다. 프로토콜에 표시된 바와 같이 섹션 1.4에서는 PBMC 수집 후 프로시저를 중단할 수 있습니다. 이 경우, 세포는 4°C에서 하룻밤 사이에 교반하에 유지될 수 있다. 그런 다음 ...

혈액 혈소판은 메가카요포이시스(MKP)로 알려진 상수 및 미세 조정 된 생산 공정에서 유래한 특수 대형 폴리플로이드 세포, 메가 카요사이클 (MK)에서 비롯됩니다. 이 과정의 정점에는 골수 환경(사이토카인, 전사 인자, 조혈 성 틈새)과 접촉하여 거대 핵증식 경로로 커밋할 수 있는 조혈선(HP)으로 증식하고 분화할 수 있는 조혈 줄기세포가있습니다. MKP의 주요 사이토카인인 다양한 사이토카인 및 특히 혈전포이에틴(TPO)의 영향하에서; MK는 다음 성숙의 두 가지 주요 단계를 겪습니다: 내막과 경계 막의 개발 (DMS). 이 완전히 성숙한 MK는 세포질 확장을 방출할 수 있는 부비동성 혈관에 가깝게 나타나며, 혈류하에서 방출되고 이후에 기능혈소판2로리모델링될 프로플라소판이 된다. 1994년3월 TPO의 복제는 HP 분화 및 MK 성숙을 허용하는 체외 배양 기술의 개발을 가속화함으로써 MKP 연구에 활력을 불어넣습니다.
혈소판 수(증가 또는 감소) 및 기능4,5의 관점에서 혈액 혈소판에 영향을 미치는 많은 병리들이있다. 인간 HP에서 시험관에서 MKP를 다시 수면할 수 있다는 것은 이 과정의 근간을 근로하고 궁극적으로 환자의 치료 관리를 위한 분자 및 세포 기계장치의 이해를 향상시킬 수 있었습니다.
인간의 HP의 다양한 소스는 적합하다 : 코드 혈액, 골수, 말초 혈액6,7,8. 말초 혈액에서 HP를 수확하는 것은 코드 혈액 또는 골수에서 회복하는 것보다 덜 물류 및 윤리적 문제를 제기합니다. HP는 백혈구 또는 버피 코트에서 복구 할 수 있지만, 이러한 소스는 비싸고 혈액 센터에서 항상 사용할 수 없습니다. 다른 프로토콜은, 더 저렴하고 수행하기 쉬운, 이전 CD34 구동절연4에대한 필요없이 인간의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 직접 복구를 허용4,8. 그러나, 메가카요세포의 순도는 이 방법으로 만족스럽지 못하며 PBMC로부터 CD34+ 셀을 선택하여 MK로의 최적의 분화를 권장한다. 이것은 백혈구를 제거하고 따라서 불리한 면역 반응을 피하기 위하여 혈액 은행에서 일상적으로 이용되는 백혈구 감소 필터 (LRF)에서 HP 정화를 구현하기 위하여 저희를지도했습니다. 실제로, 1998 년 이후, 혈소판 농축액은 자동으로 프랑스에서 백류오데트되었습니다. 이 과정이 끝나면 LRF가 폐기되고 LRF에 유지되는 모든 셀이 파괴됩니다. 따라서 LRF의 세포는 추가 비용 없이 쉽게 사용할 수 있습니다. LRF는 백혈구 또는 버피 코트에 의해 얻은 것과 가까운 셀룰러 함량을 가지고 있으며, 특히 CD34 + HP의 구성에서 놀랍도록 매력적인 소스10을만듭니다. 인간 HP 소스로서의 LRF는 이미 세포에 온전한 기능성 용량을 제공하는 것으로입증되었다(11). 이 소스는 실험실 연구에 대 한 풍부 하 고 저렴 한 되 고의 장점이 있다. 이 맥락에서 이 문서에서는 연속적으로 설명합니다: i) LRFs의 CD34+ HP의 추출 및 선택; ii) 2단계 최적화 된 문화, 이는 발판을 방출 할 수있는 MK의 메가 카요 사이클 경로 및 성숙에 HP의 헌신을 재구성; iii) 이러한 MK로부터 혈소판을 효율적으로 방출하는 방법; 및 iv) Phenotyping MK 및 배양 혈소판에 대한 절차.

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>558819</td><td></td></tr><tr><td>ACD</td><td>EFS-Alsace</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-PE&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-081-002</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD41-Alexa Fluor 488</td><td>Biolegend</td><td>303724</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD42a-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>559919</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>EFS-Alsace</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Tubes</td><td>BD Bioscience</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit UltraPure, human&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-100-453</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.OR</td><td>또는 동등한 재료</td></tr><tr><td>Compteur ADAM&nbsp;</td><td>DiagitalBio</td><td>NA</td><td>또는 동등한 재료</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Dutscher</td><td>55002</td><td>또는 동등한 재료</td></tr><tr><td>leuconostoc spp&nbsp의 Dextran;</td><td>Sigma</td><td>31392-50g</td><td>또는 동등한 재료</td></tr><tr><td>DMSO Hybri-max&nbsp;</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 m&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15575-039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>616201</td><td>또는 이와 동등한 재료</td></tr><tr><td>여과 장치 Steriflip PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Bioscience</td><td>Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Human LDL</td><td>Stemcell technologies</td><td>#02698</td><td></td></tr><tr><td>ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL</td><td>Bayer</td><td>MA038EX</td><td></td></tr><tr><td>Inserts</td><td>Fenwal</td><td>R4R1401</td><td>또는 동등한 재료</td></tr><tr><td>층류 후드&nbsp;</td><td>Holten</td><td>NA</td><td>아카이브 제품</td></tr><tr><td>LS Columms&nbsp;</td><td>밀테니 바이오텍</td><td>130-042-401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell</td><td>7861</td><td></td></tr><tr><td>펜 스트렙 글루타민 (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp;</td><td>또는 동등한 재료</td></tr><tr><td>PGi2</td><td>Sigma</td><td>P6188</td><td></td></tr><tr><td>Poches de transferts 600ml&nbsp;</td><td>Macopharma</td><td>VSE4001XA</td><td></td></tr><tr><td>사전 분리 필터(30&micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>StemRegenin 1 (SR1)</td><td>Stemcell technologies</td><td>#72344</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan Expansion Supplement (100x)</td><td>Stemcell technologies</td><td>#02696</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan-SFEM&nbsp;</td><td>스템셀 기술</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>스테리컵 듀라포어 0,22&마이크로; m PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>SVF Hyclone&nbsp;</td><td>Thermos scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>주사기 30 mL&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>SS * 30ESE1</td><td>또는 동등한 재료</td></tr><tr><td>주사기 필터 Millex 0,22 &micro; M PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Stemcell technologies</td><td>#02822</td><td></td></tr><tr><td>튜브 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.548.004 PP</td><td>또는 동등한 재료</td></tr><tr><td>튜브 15 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001 PP</td><td>또는 동급 재료</td></tr><tr><td>Tubulures</td><td>B Braun</td><td>4055137</td><td>또는 동급 재료</td></tr></tbody></table>

류코데플션 필터-유래 cd34+ 세포가 메가카요시테 분화 및 혈소판 형성을 연구하는 세포 공급원으로

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

자궁 내 의 팽창 및 발판을 연장하고 혈소판을 방출 할 수있는 거대 karyocytes로 인간의 조혈 선조의 분화는 혈소판 생물 발생의 메커니즘의 심층 연구를 할 수 있습니다. 사용 가능한 배양 프로토콜은 주로 골수 또는 코드 혈액에서 파생 된 조혈 선조에 기초하여 윤리적, 기술적, 경제적 우려를 제기합니다. 말초 혈액에서 CD34 세포를 얻기 위한 이미 유효한 프로토콜이 있는 경우에, 이 원고는 혈액 센터에서 쉽게 유효한 백혈구 필터에서 CD34+ 세포를 얻기 위한 간단하고 최적화된 프로토콜을 제안합니다. 이 세포는 8개의 혈액 기증에 대응하는 수혈 제품의 준비에 사용된 백혈구 필터에서 격리됩니다. 이러한 필터는 폐기해야 합니다. 이러한 필터에서 CD34+ 세포로 확인된 조혈 선조를 수집하는 상세한 절차가 설명되어 있습니다. 그들의 현상 진화를 토론하는 동안 proplatelet을 확장하는 성숙한 megakaryocytes를 얻는 방법 또한 상세합니다. 마지막으로, 프로토콜은 형태학적으로 그리고 기능적으로 네이티브 와 유사한 혈소판을 효율적으로 방출하기 위해 보정된 파이펫팅 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 기본 메커니즘을 해부하고 생체 내 혈소판 수율에 접근하는 과정의 다양한 단계에서 작용하는 약리학적 화합물을 평가하기위한 기초가 될 수 있습니다.

LRF에서 CD34+ 셀 추출 및 선택 여기서, Peytour외. 9로부터유래된 방법은 백혈구 제거 후 혈액 은행에서 사용할 수 있는 버려진 LRFs로부터 CD34+ 세포의 추출 및 선택을 설명한다. 백플러시 절차에 따라, 보통 1.03 x 109 ± 2.45 x 108 세포/LRF(Mean±SEM; n =155)는 94.88 ± 0.10%의 생존율로 회복된다(그림2A i). CD34 양성 선택 후, 평균 615.54 x 103 ± 12.28 세포/LRF가 얻어진다(n =155)(도 2A ii). 셀 수가 300,000 미만인 경우 절차가 올바르게 수행되지 않았으며 중지해야 한다는 결론을 내릴 수 있어야 합니...

이 프로토콜은 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 배혈구를 방출할 수 있는 배혈구를 생성할 수 있는 배혈구-발광식 CD34+ 조혈선 및 체외 분화 및 성숙을 얻는 데 관련된 모든 단계를 자세히 설명합니다. 이 절차는 거대 karyopoiesis를 통제하는 세포 및 분자 기계장치의 심층 분석에 유용합니다.

류코데플션 필터-유래 CD34+ 세포가 메가카요시테 분화 및 혈소판 형성을 연구하는 세포 공급원으로

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

이 프로토콜은 인간 조혈 선조를 얻고, 메가 카요세포로 그들의 분화를 유도하기위한 간단한 방법을 제안한다. 그것은 메가 karyopoiesis의 더 나은 이해를 위한 기초역할을 할 수 있습니다이 기술은 소스를 사용 하지만 조혈에 실험실 연구에 대 한 저렴 하 고 풍부한의 장점을 제공 합니다. 이 방법은 현재 그렇지 않은 GMP 조건에서 준비되어야 할 치료법에 사용되는 세포에 대한 메가 카요포에이스(megakaryopoiesis)를 더 잘 이해하는 데 사용됩니다.PBMC 컬렉션을 포함한 단계를 이해하는 것은 시각적 데모를 통해서만 완전히 완료될 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에, 빈 600 밀리리터 전송 가방에 백과 튜브 세트에 백류 감소 필터를 연결합니다. 바이오 안전 캐비닛에서 루코환원 필터당 25밀리리터의 여과된 용출 버퍼를 빈 백에 주입하고, 30 밀리리터 주사기를 사용하여 필터를 통해 가방 내용을 부드럽게 흡인시합니다.수집된 적혈구를 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고, 세포 현탁액을 2%dextran으로 반으로 희석시. 잘 섞어서 혈액 세포를 집계하고 실온에서 30 분 동안 세포가 퇴적할 수 있도록합니다. 적혈구가 50 밀리리터 튜브로 상체를 이송하고 2개의 밀리머 PBS EDTA 용액으로 튜브를 채웁니다.상피체의 절반을 25밀리리터의 밀도 그라데이션 배지에 부드럽게 오버레이하여 그라데이션 표면을 방해하지 않고 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리합니다. 일회용 파이펫을 사용하여 각 인터페이스에서 새로운 50 밀리리터 튜브로 셀을 전송합니다. 세척당 2밀리머 PBS EDTA의 50 밀리리터에서 세포를 두 번 세척하십시오.두 번째 세척 후, 계산에 대한 신선한 PBS EDTA의 단일 50 밀리리터 볼륨에 펠릿을 다시 중단. 여기서는 야간 동안 섭씨 4도에서 교반하에서 수집된 세포를 유지함으로써 절차를 중지할 수 있다. CD34+셀 선택을 위해, 세포 수를 결정하고 10개 세포에서 8세포에 10당 2밀리머 PBS EDTA의 300마이크로리터에서 세포 펠릿을 회수한다.FC 수용체 차단 시약의 적절한 부피와 CD34 마이크로비드 50마이크로리터를 10개당 8번째 세포에 첨가한다. 섭씨 4도에서 30분 후, 2개의 밀리머 PBS EDTA로 세포를 씻고, 10개 세포에서 10개세포당 신선한 2밀리머 PBS EDTA의 500마이크로리터에서 펠릿을 재보습한다. PBS EDTA를 사용하여 자기 컬럼의 가습및 크기를 적절히 조정한 다음 컬럼에 샘플을 추가합니다.세탁당 2밀리미터 PBS EDTA의 3밀리리터로 컬럼을 두 번 세척합니다. CD34+셀을 제외하기 전에 용출당 2밀리미터 PBS EDTA의 5밀리리터 볼륨이 있습니다. 마그네틱 비드 선택 된 세포의 순도를 평가하기 위해, 적절한 인간 항체의 2 개의 마이크로 리터를 분리 된 세포의 100 마이크로 리터 알리쿼트에 추가하고 섭씨 4도에서 15 분 동안 배양하기 전에 잘 섞는다.인큐베이션에 이어, PBS에서 세포를 세척하고 혈동 세포측정에 의한 세포 시료의 순도 분석을 위해 PBS의 200 마이크로리터에서 펠릿을 재중단한다. 계산 후, 원심분리에 의해 CD34+세포를 수집하고 즉시 차가운 용액에서 펠릿을 10의 밀도로 재차리밀리리터당 6개의 세포로 재차 후 2개의 콜드 액스탈에 세포 현탁액을 신속하게 추가한다. 그런 다음 냉동고 튜브를 영하 80도 냉동고에 24시간 동안 즉시 놓은 후 냉동고 튜브를 액체 질소 저장장치로 옮춥시다.이 대표적인 연구에서, 세포는 대략 95%의 생존력으로 입증된 바와 같이 백혈구 감소 여과에 의해 회복되었다. 자기 비드 선택 후, 90% 이상의 순수 CD34+세포 집단이 얻어졌다. 세포 증식은 전형적으로 배양의 1 주일 후에 감소합니다, 그러나 세포 생존성에 있는 중요한 변경없이.7일째까지 CD34+세포는 CD41, 특이적이고 초기 마커 또는 메가카요시테 및 혈소판 개발을 발현하기 시작해야 한다. 10일째에, 배양에 있는 세포의 대다수는 일반적으로 메가karyocytes를 표현하는 성숙한 CD41로 발전합니다. 13일까지, 메가카요세포 프로 혈소판 연장 및 혈소판 방출은 빛 현미경검사법에 의해 관찰될 수 있다.배양에 방출된 CD41, CD42, 8개의 양성 혈소판의 총 수는 형광구의 보정된 수를 사용하여 정량화될 수 있다. 이 방법은 메가카요포에이스의 기본 메커니즘을 강화하고 시각적으로 혈소판 수율을 증가하기위한 길을 열어줍니다. 이 방법이 지루한 것처럼 보이지만 인내심을 가지고 모든 지역을 미리 준비해야합니다.우리의 중요한 관심사 메가 karyopoiesis 비록 우리는 CD42 세포를 얻는 것은 조혈 통로 를 통해 이용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

여기 우리는 전체 murine 간, 조직 소화, 세포 강화, 그리고 유동세포계측법 절연을 요구하는 과정에서 CD133 표현 간 줄기 세포와 암 줄기 세포의 절연을 설명합니다. 우리는 고급 단일 세포 분리 및 clonal 확장 메서드를 포함합니다.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

이 비디오는 거핵세포의 분화와 혈소판 형성을 위한 기술을 보여줍니다. 인간 탯줄 혈액에서 분리된 조혈 줄기 전구 세포는 트롬보포이에틴이 존재하는 상태에서 성숙한 거핵세포로 분화합니다. 성숙한 거핵세포는 프로혈소판(proplatelet)이라고 하는 세포질 확장을 생성하며, 이는 개별 혈소판을 생성합니다.

거핵세포와 혈소판 형성의 분화를 위한 체외(In vitro) 방법

여기에서는 인간 항응고 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 말초 혈액 단핵 세포에서 자기 비드 분리에 의해 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 5일 동안 배양한 후 인간 단핵구는 미성숙 수지상 세포로 분화되고 비임상 환경에서 실험 절차를 수행할 준비가 됩니다.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

매우 순수한 인구의 없으며 코드에서 얻어질 수 있다 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34 방법+ 셀 고립과 megakaryocyte 차별화는 여기에 설명 된.

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

여기서, 우리는 4개의 골수성 혈통에 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성 및 사이토카인 유도분화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 적용은 CD34+ 세포의 골수성 분화에 대한 골수성 질환 돌연변이 또는 소분자의 영향에 대한 조사를 포함한다.

인간 코드 혈액 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 범골수성 분화

이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

여기서는 메가카요세포 분화의 특성화를 위한 면역페노티핑 전략을 제시하고, 이 전략이 형광 활성화 세포 선별기로 다른 단계에서 메가카요사이클을 분류하는 방법을 보여준다. 방법론은 인체 에 있는 문화에서 생성된 거대 karyocytes뿐만 아니라 인간 1차 조직에적용될 수 있다.

인간 1차 출처에서 인간 MK의 면역페노티핑 및 세포 분류 또는 헤마토포이틱 전조자로부터 시험관내 분화

시알리다아제 처리를 사용하여 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 탈시알릴화된 인간 단핵구 유래 수지상 세포(mo-DC)를 생성하는 독특하고 포괄적인 프로토콜이 제시됩니다. 또한, mo-DC의 표현형 및 기능적 특성을 평가하고, 시알리다아제 처리가 mo-DC의 성숙 수준을 어떻게 향상시키는지를 평가하는 방법이 기재되어 있다.

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differenting Sialylated Phenotypes (시알릴화 표현형이 다른 단핵구 유래 수지상 세포 생성)

배우세요 류코데플션 필터에서 CD34+ 조혈 전구세포를 분리하여 메가카요시테로 분화시키는 방법을. 이 기술은 혈소판 생성 메커니즘 연구와 약리학적 테스트에 활용됩니다.

류코데플션 필터-유래 CD34+ 세포가 메가카요시테 분화 및 혈소판 형성을 연구하는 세포 공급원으로

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