Name: 마우스 신선한 골수 이별의 프로플라츠 형성 역학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 배우세요 마우스 신선한 골수 이별을 이용한 프로플라츠 형성 실시간 관찰 방법을. 6시간 내에 대식세포 형태 변화와 프로플라츠 확장을 정성적·정량적으로 분석할 수 있습니다.

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저자들은 장 이브 린켈, 줄리 보셔, 패트리샤 래퍼, 모니크 프룬드, 케티 크네즈-히퍼트에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 ANR (기관 국가 드 라 Recherche) 그랜트 ANR-17-CE14-0001-01 및 ANR-18-CE14-0037에 의해 지원되었습니다.

모든 동물 실험은 유럽 표준 2010/63/EU및 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회 (코미테 레지오날 데티크 앙 마티에르 디에리포앙 마티에르 데테리션 애니멀 스트라스부르)에 따라 수행되었습니다.
1. 시약 준비
<ol><li>표 1에설명된 대로 시약을 준비한다.<ol>
<li>스톡 I의 경우 각 분말을 별도로 녹입니다. 준비의 진동이 295 mOsm / L보다 높은지 확인하십시오. 이 용액은 1 년 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>Tyrode의 버퍼 준비를 위해 표 1에설명된 대로 솔루션을 만들고 증류수로 100mL로 볼륨을 조정하고 0.1g 의 무수D(+) 자당을 추가합니다. 필요에 따라 1 N HCl을 사용하여 pH 7.3에 적응하고 295 mOsm / L로 진동합니다. 세균성 성장을 방지하기 위해, 페니실린 G를 추가 10 U/mL 최종 농도 및 연쇄절제술 황산염 0.29 mg/mL 최종 농도. 0.22 μm 모공을 통해 최종 솔루션을 필터링합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 실험 설정 준비
<ol><li>실험 당일, 37°C에서 티로드의 완충액을 따뜻하게 하고 현미경의 가열 챔버를 켜서 온도를 37°C로 끌어올립니다.</li>
	<li>타이머, 인큐베이션 챔버, 5mL 주사기, 21G, 집게, 면도날, 파스퇴르 파이펫, 유리 슬라이드 및 15mL 원심분리관(그림1A)과같은 필요한 모든 도구를 준비합니다.</li>
</ol>3. 마우스 골수의 격리
<ol><li>CO2 질식 및 자궁 경부 탈구에 의해 8-12 주 세 C57BL/6 마우스를 안락사. 이것은 유능하고 자격을 갖춘 사람에 의해 신속하게 수행해야합니다.</li>
	<li>미생물 오염을 방지하기 위해 대퇴골을 제거하기 전에 마우스 몸을 70 % (v /v) 에탄올에 담가 둡니다. 해부에 대해 70% 에탄올에 감염된 기기를 사용하십시오. 두 대퇴골을 수집하고 부착 조직을 제거하여 청소하십시오. 에탄올에 빠르게 침지한 후, 2mL 티로드의 버퍼를 포함하는 15mL 원심분리기 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>날카로운 면도날을 사용하여 표피를 자르고 2mL Tyrdode의 버퍼로 채워진 5mL 주사기를 사용하여 골수를 플러시합니다. 이를 위해 21G 바늘을 대퇴골(무릎 쪽)의 개구부로 도입하고 플런저를 천천히 눌러 그대로 골수 실린더(도1B,C)를회수한다. 골수 수집 세션을 가능한 한 짧게 유지하십시오(10분 미만).</li>
</ol>4. 골수 단면 및 인큐베이션 챔버에 배치
<ol><li>3mL 플라스틱 파이펫을 사용하여 그대로 있는 골수를 유리 슬라이드에 조심스럽게 옮기십시오. 샘플이 건조를 방지하기 위해 버퍼로 덮여있는 것이 중요합니다(그림 1D). 참고: 조직을 해리시킬 수 있는 가위를 최소화하기 위해 흐름 리플로우를 피하십시오.</li>
	<li>스테레오 현미경 (10x)에서, 플러시 시 압축 되었을 수 있습니다 골수의 끝을 잘라. 그런 다음 날카로운 면도날로 트랜스버라클 섹션을 잘라냅니다. 섹션은 상세한 관찰을 허용하지만 메가 카요 세포가 압축 (일반적으로 0.5mm 주위 두께)에 의해 손상되지 않도록 충분히 얇아야한다(그림 1E,F). 참고: 단면은 날카로운 면도날과 돋보기 아래로 제작되어 두께를 약 0.5mm로 조정합니다. 균일한 두께의 섹션만 선택됩니다. 이 절차는 복잡하지 않지만 표준화에는 약간의 경험이 필요합니다.</li>
	<li>플라스틱 파이펫을 사용하여 티로드의버퍼(그림 1G)가들어 있는 1mL 튜브에 10개의 섹션을 수집합니다.</li>
	<li>직경 13mm(도1H)의인큐베이션 챔버로 섹션을 조심스럽게 옮겨주세요.</li>
	<li>버퍼를 흡인하고 5 % 마우스 혈청으로 보충 된 Tyrode의 버퍼의 30 μL로 볼륨을 조정합니다. 참고: 이 단계에서 약리학 제가 첨가하여 프로플라틀형성에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.</li>
	<li>섹션을 멀리 배치합니다. 차원 22 x 55mm의 커버슬립으로 자체 접착제 챔버를 밀봉하십시오. 기포의 형성을 피하기 위해 고집하면서 커버 슬립을 경사(도 1I).</li>
	<li>챔버를 37°C의 가열 챔버에 놓습니다. 이 순간부터 크로노미터가 시작됩니다(T= 0h). 실험은 37°C(T= 6h)에서 6시간 동안 실행됩니다.</li>
</ol>5. 골수 의 실시간 관찰
<ol><li>골수 경전을 관찰하기 위해 비디오 카메라에 결합된 반전된 위상 대비 현미경(배율용 40x 렌즈)을 사용합니다. 관찰을 시작하기 전에 세포가 30 분 동안 배양하게하십시오. 관찰하는 동안 메가 카요세포가 움직이기 때문에 초점을 조정해야합니다. 참고: 다른 관찰 모드는 (예를 들어, DIC, 메가카요세포가 내인성 형광 마커를 표현하는 마우스를 이용한 형광)이 가능하지만, 위상 조영 현미경 검사는 길고 얇은 메가카요세포 확장을 명확하게 시각화하는 것이 최적입니다. 30분 후, 골수 세포는 점차 적으로 항층층을 형성하여 병자의 주변으로 이동합니다. 1h의 배양 후, 메가카요세포는 큰 크기와 폴리로부트핵(도1J,K)으로식별될 수 있다. 인큐베이션의 3 시간 후, 메가 카요세포의 수는 증가하고 일부는 긴 확장을 가지고있다.</li>
	<li>메가카르요세포의 변신을 녹화하기 위해 동영상을 만드세요.</li>
</ol>6. 프로플라츠판 확장 메가카요세포의 정량화
<ol><li>인큐베이션챔버(도 1K)의각 섹션을 지역화하기 위해 맵을 그립니다.</li>
	<li>1h 후 각 섹션의 주변에 보이는 메가카요세포(즉, 거대한 폴리로부트 셀)를 식별하고 도면에 위치를 플롯합니다. 3 및 6 시간 후에이 절차를 반복하십시오. 참고: 도면에 기초하여, 각 메가카요세포는 시간이 지남에 따라 쉽게 위치할 수 있으며, 분석된 형태의 진화(예: 크기, 변형, 프로플래틀렛 연장 등). 또 다른 가능성은 특정 탐색 소프트웨어의 사용입니다.</li>
</ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Bessis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+platelet+genesis%3B+in+vitro+study+by+cinemicrophotography%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography.</a> Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).</li>
<li>Becker, R. P., De Bruyn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmural+passage+of+blood+cells+into+myeloid+sinusoids+and+the+entry+of+platelets+into+the+sinusoidal+circulation%3A+A+scanning+electron+microscopic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation.</a> American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).</li>
<li>Muto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scanning+and+transmission+electron+microscopic+study+on+rat+bone+marrow+sinuses+and+transmural+migration+of+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archivum+Histologicum+Japonicum%22%5BJournal%5D)">A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells.</a> Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Kaushansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+megakaryocyte+progenitor+expansion+and+differentiation+by+the+c-Mpl+ligand+thrombopoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin.</a> Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
<li>Ortiz-Rivero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3G%2C+through+its+GEF+activity%2C+induces+megakaryocytic+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101(2018).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease%3A+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li>
<li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li>
<li>Balduini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+receptors%2C+extracellular+proteins+and+myosin+IIA+orchestrate+proplatelet+formation+by+human+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에서 우리는 골수에서 성장한 프로혈소를 확장하기 위하여 거대 karyocytes의 효율성을 평가하는 간단하고 저렴한 체외 방법을 기술합니다. 마우스에 대한 골수 각질 모델은 네 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 고급 기술 기술이 필요하지 않습니다. 둘째, 메가카요세포-연장 프로플라틀을 얻는 데 필요한 시간은 매우 짧고, 절제 방법에 대해서만 6시간밖에 되지 않는데, 이는 마우스 전조자로부터 시작되는 종래의 배양 방법에 대한 최소 4일에 비해 이다. 셋째, 소량의 조직만이 필요하며 얻어진 결과가 재현가능하다는 점을 감안할 때, 최소(보통 실험 조건당 6마우스)에 필요한 마우스의 수를 감소시켜 이러한 실험을 경제적이고 윤리적으로 효율적으로 만듭니다. 마지막으로, 그러나 중요한 것은, 이 방법의 힘은 그들의 자연 환경에서 완전히 발전한 거대 카르요세포의 사용에 있습니다, 문화 조건의 잠재적인 유물에 의해 시험관에서 가려질 수 있는 표현형을 드러내는 귀중한 증명할 수 있는. 이것은 이전에 생체 <e...

골수 각질 기술은 1956년 티에리와 베시스에 의해 처음 개발되어 혈소판 형성1의초기 이벤트로서 쥐 메가카요세포 세포질 확장의 형성을 기술하였다. 위상 대비 및 촬영 기술을 사용하여, 이 저자는 신장과 수축의 동적 움직임을 보여주는 세포질 확장과 "오징어 같은"혈전 세포로 성숙한 둥근 메가 카요세포의 변환을 특징으로. 이 팔은 팔을 따라 그리고 끝에서 작은 붓기와 filiform될 때까지 점진적으로 얇아집니다. 시험관 및 액체 매체에서 얻어진 이러한 전형적인 메가카요세포 신장은 고정형 골수에서 관찰된 혈소판과 일정한 유사성을 가지며, 여기서 거대 카르요퀴트는 혈중 벽으로 시누치성 벽을 통해 긴 연장을 돌출하여 혈액 순환2,3로돌출된다. 1994년 TPO의 발견 및 복제는 골수 에 기재된 것과 유사한 프로플라틀 확장을 형성할 수 있는 배양에서 메가카르요사이클을 구별할 수 있게4,5,6. 그러나, 메가카요세포 성숙은 배양 조건에서 훨씬 덜 효율적이며, 특히 골수 성숙 메가카요세포의 광범위한 내부 멤브레인 네트워크는 배양 된 메가 카요사이클로 저개발되어 혈소판 생물 발생7,8의메커니즘에 대한 연구를 방해한다.
우리는 여기에 Thiéry와 Bessis에 따라 골수 박멸 모델을 자세히 설명, 마우스 메가 카요 사이클의 실시간 proplatelet 형성에 따라, 이는 완전히 자신의 네이티브 환경에서 성숙한, 따라서 체외 유물과 오해에서 가능한 우회. 야생 형 성인 마우스에서 얻은 결과는 프로 플라틀릿, 그들의 형태 및 프로 플라츠의 복잡성을 확장하는 메가 카요사이클의 능력을 설명하기 위해 제시된다. 또한 메가카요세포 기록 과정에서 데이터 정확성과 견고성을 보장하기 위해 품질 검증을 위한 신속한 정량화 전략을 도입했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 이전에 책 장9로출판된 방법의 최신 버전입니다.

<table><tbody><tr><td>5 mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS + 05S1</td><td></td></tr><tr><td>21 게이지 바늘</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>커버 월 배양 챔버</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70324-02</td><td>깊이 : 0,2 mm</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H-3375</td><td>pH 조정 to 7.5</td></tr><tr><td>Human serum albumin</td><td>VIALEBEX</td><td>승인 약물 : n&deg; 3400956446995</td><td>20%(200mg/mL -100mL)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>BVBW8448</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72200-40</td><td>22 mm x 55</td></tr><tr><td>mm 현미경</td><td>Leica Microsystems SA, Westlar, Germany</td><td>DMI8 - 514341</td><td>에어 렌즈</td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Leica Microsystems SA, Westlar, Germany</td><td>K5 CMS GmbH -14401137</td><td>이미지 해상도 : 4.2 megapixel</td></tr><tr><td>Mouse serum</td><td>BioWest</td><td>S2160-010</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>시그마</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10,000 units/mL 페니실린, 10,000 &mu; g/mL 스트렙토마이신 및 29.2mg/mL 글루타민</td></tr><tr><td>면도날</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>설탕 D (+)</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 신선한 골수 이별의 프로플라츠 형성 역학

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

메가카요포이시스의 마지막 단계는 성숙한 거대 카르요세포, 소위 프로플라츠에서 세포질 확장으로 이어집니다. 체외에서 -분화 된 메가 카요세포를 사용하여 프로 플라츠판 형성에대해 많은 것을 배웠습니다. 그러나, 기존의 문화 시스템이 골수 내부의 장소를 취하는 분화 / 성숙 과정을 충실하게 재구성하지 않는다는 증거가 증가하고 있다. 이 원고에서는 1956년 티에리와 베시스가 원래 설명한 절묘한 방법을 제시하여 자신의 토착 환경에서 성숙한 거대 카르요세포들을 시각화하여 잠재적인 유물과 오해를 우회합니다. 신선한 골새끼는 마우스의 대퇴골을 플러시하여 수집되고, 0.5mm 단면으로 슬라이스하고, 생리적 완충액을 함유하는 37°C의 인큐베이션 챔버에 배치된다. 메가카요세포는 축출 주변에서 점진적으로 볼 수 있게 되고 비디오 카메라에 결합된 반전된 현미경으로 최대 6시간까지 관찰됩니다. 시간이 지남에 따라, 메가 카요 세포는 구형 형태를 가지고 다른 두꺼운 확장을 개발하거나 광범위한 분기와 많은 얇은 proplatelet을 확장, 모양을 변경합니다. 정성적 및 정량적 조사가 모두 수행됩니다. 이 방법은 수많은 거대 카르요세포가 존재하므로 간단하고 재현 가능하며 빠르며, 그 중 절반은 배양 마우스 메가카요세포에 대한 4일에 비해 6시간 만에 프로플라틀렛을 형성한다는 장점이 있다. 돌연변이 마우스의 연구 외에도, 이 방법의 흥미로운 적용은 배양에서 발생할 수 있는 분화 과정을 방해하지 않고, 프로플라틀 확장 과정에 대한 약리학제제의 간단한 평가이다.

질적 결과. 실험의 시작 부분에서, 모든 세포는 골수 단면도에서 압축됩니다. 세포가 각성의 주변에서 명확하게 보이려면 30분이 걸립니다. 메가카요세포는 큰 크기로 인식될 수 있으며, 그 진화는 시간이 지남에 따라 연구될 수 있다(크기, 모양, 동적, 프로혈소판 연장 및 혈소판 방출)(그림2A). 작은 거대 카르요세포는 직경 20에서 30 μm 사이이며, 성숙한 둥근 메가카요세포는 확대된 세포질로 더 큽니다(직경 &gt; 30μm). 몇 가지 어두운 메가카요세포가 관찰될 수있다(도 2C). 이들은 0.5%를 초과해서는 안 되는 죽은 세포를 나타냅니다. 이 값보다 높은 비율은 샘플 준비 문제를 나타냅니다. 핵의 형태는 초점을 변화시킴으로써 쉽게 시각화될 수 있다.
정량적 결과. 메가카요세포는 6.2에 설명된 대로 수동...

여기서, 우리는 골수 각질 방법을 자세히, 샘플 준비에서 현미경 슬라이드 분석에, 프로 플라츠판을 형성하는 그들의 생리 환경에서 분화 한 메가 카요 세포의 능력을 평가하기 위해.

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

이 절차의 전반적인 목적은 그들의 네이티브 환경에서 성숙한 마우스 거대 카르요세포에서 proplatelet의 형성을 실시간으로 따르는 것입니다. 이 방법은 간단하고 재현 가능하며 빠르다는 장점이 있습니다. 하나는 많은 메가 카요 사이클을 분석하고 시험관내 마우스 거대 카르요세포에 관해서는 문화의 첫날을 기다리는 대신 6 시간 만에 프로 플라플라인의 형성을 시각화 할 수 있습니다.이 방법의 흥미로운 응용 프로그램은 특히 프로 플라틀렛 확장의 단계에서 약제 학적 치료 또는 유전 돌연변이의 효과를 연구 할 수있는 가능성입니다. 여기서는 체외 문화의 경우와 같이 분화 과정에 간섭이 없습니다. 이 비디오는 골수를 플러싱하고 절단하는 이러한 주요 단계를 보장하는 데 도움이됩니다.또한 혈전성 질환의 결함 특성화에 정말 유용한 형태와 거대 카르요사이클을 분류하는 방법에 대해서도 설명했습니다. 우선, Tyrode의 버퍼를 섭씨 37도에서 따뜻하게 하고 현미경의 난방 실을 켜서 온도를 섭씨 37도까지 끌어올립니다. 타이머, 인큐베이션 챔버, 5 밀리리터 21 게이지 주사기, 집게, 면도날, 파스퇴르 파이펫, 유리 슬라이드 및 15 밀리리터 원심분리기 튜브와 같은 필요한 모든 도구를 준비합니다.21 게이지 바늘을 무릎 쪽의 대퇴골 개구부에 도입하여 티로드의 완충제 두 밀리리터로 골수를 씻어내고 플런저를 천천히 눌러 그대로 골수 실린더를 회수합니다. 3분 짜리 플라스틱 파이펫을 사용하여 그대로 있는 골수를 유리 슬라이드에 조심스럽게 부드럽게 전달합니다. 플러시 에 압축 되었을 수 있습니다 골수의 끝을 잘라.그런 다음 날카로운 면도날을 사용하여 0.5mm 두께의 얇은 대지 부분을 잘라 메가 카요사이클을 손상시키지 않도록합니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 티로드의 버퍼가 들어 있는 1밀리리터 튜브에 10개의 섹션을 수집합니다. 조심스럽게 13 밀리미터의 직경을 가진 잠복챔버로 섹션을 전송합니다.버퍼를 흡인하고 5%의 마우스 세럼으로 보완된 Tyrode의 버퍼30 마이크로리터로 볼륨을 조정합니다. 단면을 멀리 배치합니다. 22~ 55mm 커버 슬립으로 자체 접착제 챔버를 밀봉하여 공기 포기의 형성을 피하기 위해 커버 슬립을 절제합니다.챔버를 섭씨 37도에 가열실에 놓습니다. 크로노미터를 시작하고 섭씨 37도에서 6시간 동안 실험을 실행하여 메가카르요세포의 변형을 기록하기 위해 비디오를 만듭니다. 30분 후, 골수 세포는 모노층을 형성하는 해종의 주변으로 점차 이동한다.1시간 동안 배양한 후, 메가카요세포는 큰 크기와 폴리로부트된 핵으로 식별할 수 있다. 메가카요세포의 수는 3시간 동안 인큐베이션을 한 후 증가하고 일부는 긴 연장을 가지고 있습니다. 맵을 그려 인큐베이션 챔버의 각 섹션을 지역화합니다.1시간 후 각 섹션 의 주변에 거대한 폴리로직화된 세포인 눈에 보이는 메가카요세포를 식별하고 도면에 위치를 그립니다. 3시간 6시간 후에 이 절차를 반복합니다. 메가카요세포는 인큐베이션 챔버를 밀봉한 후 3시간 6시간 후에 그들의 형태에 따라 수동으로 계산되고 분류된다.그들은 작은 으로 분류 됩니다., 두꺼운 의도, 그리고 프로 플래틀렛 확장. 매핑의 도움으로 시간이 지남에 따라 진화를 따를 수 있습니다. 결과는 각 관측 시간에 각 클래스의 백분율로 표시됩니다.고전적으로, 주변에서 보이는 거대 카르요세포의 절반은 야생형 마우스 골수의 경우 6시간 동안 프로플라츠를 확장한다. 둥근 메가카요세포의 운명은 시간이 지남에 따라 순차적인 이미지를 캡처하여 프로플라츠판을 형성하는 방법을 이미지했습니다. 이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 중요한 것은 실험 기간 동안 섭씨 37도에서 이절을 유지하는 것입니다.온도가 다른 온도로 결과를 변경할 수 있습니다. 흥미롭게도, 외래 프로토콜은 내향성 현미경 실험 후에 사용될 수 있습니다. 결국 골수 의 거대 카르요세포는 자연적으로 형광이 될 것이며, 그들의 행동은 쉽게 조사 될 수 있습니다.이것은 가능하게 동일 동물에 다른 처리를 결합하고 마우스의 수를 감소시다. 결론적으로, 이 절제 방법은 빠르고 간단하며 외부 프로플라틀에 천연 거대 핵세포의 용량에 대한 많은 정보를 제공한다. 결과 질적 및 정량적 발견은 혈전성 질병의 우리의 이해에 열쇠입니다.생리학적 또는 병리학적 맥락에서.

proplatelet-formation-dynamics-of-mouse-fresh-bone-marrow-explants

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 거핵세포의 분화와 혈소판 형성을 위한 기술을 보여줍니다. 인간 탯줄 혈액에서 분리된 조혈 줄기 전구 세포는 트롬보포이에틴이 존재하는 상태에서 성숙한 거핵세포로 분화합니다. 성숙한 거핵세포는 프로혈소판(proplatelet)이라고 하는 세포질 확장을 생성하며, 이는 개별 혈소판을 생성합니다.

거핵세포와 혈소판 형성의 분화를 위한 체외(In vitro) 방법

이 비디오에서는 박테리아 지질다당류와 면역글로불린 정맥 주사에 대한 반응으로 골수 유래 대식세포가 활성화되는 것을 보여줍니다.

항체에 반응하는 마우스 골수 유래 대식세포의 활성화(Activation of mouse bone marrow-derived macrophages in response to antibos)

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

매우 순수한 인구의 없으며 코드에서 얻어질 수 있다 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34 방법+ 셀 고립과 megakaryocyte 차별화는 여기에 설명 된.

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

우리는 여기에서 2개의 광자 현미경 검사를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈의 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet를 화상 진찰하는 방법을 설명합니다.

인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

여기에서는 인간 골수의 생체 내 구조의 복잡성을 반영하는 구현하기 쉽고 표준화된 미세생리학적 시스템을 설명하여 광범위한 정상 및 병리학적 사건을 미세하게 연구할 수 있는 관련 모델을 제공합니다.

생리학적 또는 종양적 맥락에서 상주 세포 간의 역학 및 상호 작용을 조사하기 위한 인간 골수 3D 모델

본 프로토콜은 마우스에서 매우 균일한 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)를 정제, 확장 및 특성화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 증식 및 분화 가능성이 높은 BMSC를 대량으로 획득할 수 있도록 하여 마우스 모델을 지원하고 전임상 연구를 발전시킵니다.

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

배우세요 마우스 신선한 골수 이별을 이용한 프로플라츠 형성 실시간 관찰 방법을. 6시간 내에 대식세포 형태 변화와 프로플라츠 확장을 정성적·정량적으로 분석할 수 있습니다.

마우스 신선한 골수 이별의 프로플라츠 형성 역학

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