Name: 인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 학습하세요 마우스 두개골 골수에서 메가카르요세포와 프로플라틀 형성을 실시간 이미징하는 방법을. 이 기법은 혈소판 생성 메커니즘을 생리학적 조건에서 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 우리가 실험실에서 기술을 설립 할 때 두 광자 현미경 실험에 대한 자신의 전문가 조언에 대한 플로리안 게르트너 (과학 기술 오스트리아, 클로스터뉴부르크, 오스트리아) 플로리안 게르트너 (과학 기술 오스트리아, 오스트리아)에 감사하고 싶습니다, 이미징 센터 IGBMC /CBI (일키르치, 프랑스)에서 이브 루츠 자신의 전문 지식과 두 개의 사진 현미경에 대한 도움. 우리는 또한 그의 기술적 인 도움에 대한 장 이브 린셀과 그림 1에서 스키마의 그림에 대한 이네스 기나드 감사합니다. 우리는 ARMESA (협회 드 Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique)의 두 광자 현미경 의 인수에 대한 지원에 감사드립니다. AB는 에타블리스 프랑수아 뒤 상 (APR2016)과 기관 내셔널 드 라 레체체 (ANR-18-CE14-0037-01)에서 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다.

<ol><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
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<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+kinase+2+%28Sphk2%29+regulates+platelet+biogenesis+by+providing+intracellular+sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P).</a> Blood. 122 (5), 791-802 (2013).</li>
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<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li>
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<li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361(2012).</li>
<li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127(2017).</li>
<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li>
<li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
<li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).</li>
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<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li>
</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

혈소판 형성의 메커니즘은 골수 환경에 크게 의존한다. 따라서, 인트라바이탈 현미경 검사는 실시간으로 프로세스를 시각화하는 분야에서 중요한 도구가되었습니다. 형광 메가카요세포가 있는 마우스는 조건부 형광 유전자 발현 카세트를 함유하는 어떤 플로스기자 마우스와 함께 메가카요사이클로 Cre 재조합을 발현하는 마우스를 교차시킴으로써 얻을 수 있다. 여기서, mTmG 기자 마우스는 (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10을Pf4-cre마우스(11)와교차하여, 메가카요사이클및 혈소판에서 강렬한 녹색 형광 라벨링을 허용하였다. 일부 누설은 단백구/대식세포 및 섬유아세포12,13을포함하는 백혈구에 있는 Pf4-cre 마우스로 보고되었다는 것을 주의하는 것이 중요합...

혈소판은 골수에 위치한 메가카요세포 전문 세포에 의해 생성된다. 메가카요세포가 혈소판을 순환에서 방출하는 정확한 방법은 뼈를 통해 실시간 이벤트를 관찰하는 기술적 도전으로 인해 오랫동안 불분명하게 남아 있습니다. 2광자 현미경 검사는 이 도전을 극복하는 것을 도왔고 혈소판 형성 과정을 이해하는 중요한 발전으로 이끌어 냈습니다. 생체 내 첫 번째 생체 내 메가카요세포 관측은 2007년 폰 안드리안과 동료들이 두개골1을통해 형광 메가카요사이클을 시각화하여 만들어졌다. 이는 젊은 성인 마우스의 전두엽 두개골에 있는 뼈 층이 수십 개의 미크론의 두께를 가지고 있고 근본적인 골수2에서형광 세포의 시각화를 허용하기에 충분히 투명하기 때문에 가능하였다.
후속 연구는 다양한 조건하에서 프로플라틀 형성을 평가하고 기본메커니즘을해독하기 위해이 절차를 적용3,4,5,6. 이러한 연구는 거대 카르요세포가 부비동성 혈관의 내피 장벽을 통해 프로플라틀레라고 불리는 돌출부를 동적으로 확장한다는 확실한 증거를제공했다(도 1). 이 프로플라슬은 그 때 부피에 있는 수백개의 혈소판을 나타내는 긴 조각으로 풀어 놓입니다. 혈소판은 다운스트림 장기의 미세 순환, 특히 폐7에서프로플라톤의 리모델링 후 형성될 것이다. 현재까지, 그러나, 정확한 프로세스 및 분자 기계장치는 논쟁의 대상이 남아 있습니다. 예를 들어, 프로플라슬의 신장에서 세포골격 단백질의 제안된 역할은 시험관 내 및 생체 내조건(3)사이에 다르며, 프로플라츠톤 형성의 차이는 염증조건6하에서입증되었다. 더 복잡한 것, 최근 연구는 프로 플라츠판 구동 개념에 이의를 제기하고 생체 내에서,혈소판은 본질적으로 메가 카요세포 수준8에서막 신진 메커니즘을 통해 형성된다는 것을 제안했다.
이 논문은 최소한의 침습 적 절차를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈에서 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet의 관찰을 위한 프로토콜을 제시합니다. 유사한 접근법은 이전에 다른 골수 세포, 특히 조혈 줄기 및 선조 세포9를시각화하기 위해 설명되었습니다. 여기서 초점은 측정 할 수있는 몇 가지 매개 변수를 자세히 메가 karyocytes 및 혈소판의 관찰에, 특히 proplatelet 형태와 혈소판 속도. 이 프로토콜은 형광 추적자와 약물을 주입하고 두개골 뼈를 통해 관찰하기 위해 경정맥에 카테터를 삽입하는 방법을 제시합니다. 칼변종 뼈는 반지가 뼈에 붙어 있도록 경미한 수술을 사용하여 노출됩니다. 이 링은 머리를 고정하고 호흡으로 인한 움직임을 방지하고 렌즈의 침수 매체로서 식염수로 채워진 컵을 형성하는 역할을합니다. 이 기술은 i) 용기 벽과 상호 작용하는 부비동 형상 및 거대 카르요세포가 실시간으로 관찰하는 데 적합합니다. ii) 프로플라츠 형성, 신장 및 방출 과정에서 메가카요세포체를 따릅니다. 및 iii) 혈소판 움직임을 측정하여 복잡한 부비동성 혈류를 모니터링합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 데이터는 최근에3로게시되었습니다.

<table><tbody><tr><td>GNU 옥타브 소프트웨어</td><td>GNU 프로젝트</td><td></td><td>https://www.gnu.org/software/octave/</td></tr><tr><td>&nbsp; Histoacryl 5 x 0, 5 mL</td><td>Braun</td><td>1050052</td> 수술용 접착제 <td></td></tr><tr><td>HyD 하이브리드 검출기의 주사 용액 Leica Microsystems 4tunes</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>GNU 프로젝트</td><td></td><td>필요한 최소 버전</td></tr><tr><td>Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL</td><td>Boehring</td><td>03661103003199</td><td>눈 보호</td></tr><tr><td>25x 물 대물렌즈, 0.95</td><td>Leica Microsystems</td><td></td>의 개구수, <td>AlexaFluor-488 및 Qtracker-655</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Ocrygel 10g</td><td>Laboratoires T.V.M.</td>의 동시 여기가 장착된 Leica SP8 MP DIVE 현미경<td>03700454505621</td><td>실리콘 치과 페이스트 파란색 및 노란색</td></tr><tr><td>Picodent twinsin speed</td><td>Rotec</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 혈관 라벨</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>주사 가능한 용액</td></tr><tr><td>공진 스캐너, 8 또는 12kHz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun Xylazine 2% fl/25 mL</td><td>Bayer</td><td>04007221032311</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td></td><td></td><td>반지를 뼈에 붙이기 위해</td></tr><tr><td>Surflo IV 카테터 - 블루 22 G</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Saph 펄스 레이저(코히어런트)(펨토초)</td><td>코히어런트</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

혈소판은 골수에 위치한 특수 세포인 거대 카르요세포에 의해 생성됩니다. 10년 이상 전에 메가카요사이클을 실시간으로 이미지화할 수 있는 가능성과 그들의 토착 환경은 혈소판 형성 과정에 새로운 빛을 비추고 있습니다. 메가카요세포는 부비동성 혈관의 내피 안대기를 통해 프로플라틀레라고 불리는 길쭉한 돌출부를 확장합니다. 이 논문은 두개골 골수와 부비동성 용기에 형광으로 표기된 메가카요사이클을 실시간으로 이미지화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 염증 반응을 제한하기 위해 두개골을 그대로 유지하는 사소한 수술에 의존합니다. 마우스 헤드는 호흡의 움직임을 방지하기 위해 두개골에 붙어 링으로 고정됩니다.
2광자 현미경을 사용하여 거대 카르요세포는 최대 몇 시간 동안 시각화할 수 있으므로 부비동성 혈관 내부의 신장 과정에서 세포 돌출 및 프로플라츠를 관찰할 수 있습니다. 이를 통해 돌출의 형태(너비, 길이, 수축 영역의 존재)와 그들의 신장 동작(속도, 규칙성 또는 일시 정지 또는 후퇴 단계의 존재)과 관련된 여러 매개변수를 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 또한 혈소판 속도 및 혈류 방향을 결정하기 위해 부비동성 용기에서 순환 혈소판의 동시 기록을 허용합니다. 이 방법은 유전자 변형 마우스를 사용하여 혈소판 형성에 대한 관심있는 유전자의 역할을 연구하는 데 특히 유용하며 약리학적 테스트 (메커니즘을 연구하고 혈소판 생산 장애의 치료에 있는 약물을 평가). 그것은 매우 귀중 한 도구가 되었다, 그것은 지금 생체 내 및 체 외 프로 플라틀릿 형성 다른 메커니즘에 의존 알려져 있다 으로 체 외 연구를 보완 하기 위해. 예를 들어, 시험관 내 마이크로투부레는 연막 연도에 필요하다는 것이 나타났다. 그러나, 생체 내에서,그들은 오히려 비계 역할을, 신장은 주로 혈류력에 의해 추진되고.

이 프로토콜을 사용하여 형광 추적기 Qtracker-655는 두개골 골수및 화살표에 의해 묘사된 흐름 방향에서 해부학된 골수 부비동성 혈관을 심상으로 투여하였다(그림4A,왼쪽). mTmG 마우스를 사용하여, eGFP 형광 혈소판은 각 혈관 분지에서 20s 이상 기록되었고, 그들의 속도는 ImageJ 및 GNU 옥타브 소프트웨어(도 4A,오른쪽)를 사용하여 측정되었다. 흐름 속도와 방향의 이질성에 유의하십시오. 시누소이드 용기는 비디오 1에기록된 양상에 도시된 바와 같이, 기유량및 정지의 존재와 함께, 마취로 인한 복잡한 흐름을 존재한다. 동일한 분기는 그림 4B(왼쪽)에 표시되며 빨간색및 파란색 화살표가 반대 흐름이 강조 표시됩니다. 이 분기에서 혈소판 속도측정 및 그래프에서 보고되었다(도 4B,</st...

우리는 여기에서 2개의 광자 현미경 검사를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈의 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet를 화상 진찰하는 방법을 설명합니다.

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

이 방법은 거대 카르요사이클과 같은 두개골 마우스의 골수에서 일어나는 다양한 사건의 실시간으로 시각화를 허용하고, 부비동성 혈관 내부의 프로플라틀을 확장한다. 이 기술의 주요 장점은 염증 반응을 최소화하는 데 필요한 경미한 수술로 거의 공장 조건에서 이벤트의 생체 내 시각화를 허용합니다. 먼저 마우스를 이미징 룸으로 전송합니다.현미경 및 컴퓨터를 켜고 필요한 매개 변수를 설정합니다. 마우스가 완전히 마취되면 가열 된 접시에 마우스를 놓고 다음 조작을 위해 섭씨 37도까지 따뜻하게하고 마우스의 머리와 목을 면도하고 건조를 방지하기 위해 젤을 눈에 적용하십시오. 마우스를 등에 놓고 수술 용 테이프로 앞쪽 다리를 고정하여 목을 늘립니다.목을 소독 한 후, 가위를 사용하여 오른쪽 또는 왼쪽 경정맥에 0.7 ~ 1 센티미터 절개를하고 가슴 근육 의 상단에 외부 저글러 정맥을 노출하기 위해 인접한 결합 조직을 스트레칭. 카테터를 따뜻하고 멸균된 생리식염수로 채웁니다. 가슴 근육을 통해 카테터를 관통한 다음 카테터를 정맥에 삽입합니다.바늘을 부드럽게 제거하고 주사기를 형광 추적자와 연결하고 카테터의 죽은 부피를 주입합니다. 카테터를 안정시키기 위해 수술 접착제 한 방울을 놓습니다. 마우스를 조심스럽게 쉬운 위치로 되돌려 놓습니다.느슨한 머리를 제거하는 동안 종이 타월로 70 %의 에탄올로 두피를 소독하십시오. 멸균 미세 가위와 핀셋을 사용하여 두피의 귀 사이에 최대 1센티미터의 미드라인에서 T자형 절개를 하여 칼바륨을 노출시합니다. 핀셋으로 두개골을 노출한 다음 가위와 핀셋을 사용하여 골막을 조심스럽게 제거합니다.멸균 면봉에 담그고 생리식염수에 사용하여 모든 폐막염과 이미징을 바꿀 수 있는 파편이나 머리카락을 제거하십시오. 두개골을 식염수로 헹구고 혈액 흔적을 제거하고 면봉으로 뼈를 빠르게 건조시다. 접착제 젤을 반지에 바르고, 노출된 뼈에 링을 놓고 몇 초 동안 유지하여 반지가 두개골에 단단히 부착되도록 합니다.살린 웨드 코튼 면봉으로 두개골을 가볍게 촉촉하게 합니다. 일대일 비율로 파란색과 노란색 성분을 조심스럽게 혼합하여 실리콘 치과 페이스트를 준비합니다. 이미징 중 누출을 방지하기 위해 치과 페이스트를 적용하여 링을 밀봉하십시오.고리에 들어갔을 수 있는 치과 페이스트 나 접착제를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 새는 것을 확인하기 위해 식염수로 링을 채웁니다. 마우스를 지지에 놓고 동물의 머리 아래에 접힌 압축을 넣어 머리를 들어 올리고 홀더에 부착할 때 두개골에서 반지의 분리를 방지합니다.블록 홀더에 링을 나사로 표시합니다. 가열된 현미경 챔버에 지지체 및 마우스 어셈블리를 배치합니다. 선택한 4개의 포스에 적합한 레이저 파장을 설정하고 방출된 조명의 복구를 설정합니다.인터 저글러 카테터를 사용하여 형광 추적기의 0.2 마이크로몰라 용액 50 마이크로리터를 주입하여 혈관에 라벨을 부착합니다. 현미경의 목적하에 지지체와 마우스로 현미경 단계를 배치합니다. 링이 항상 식염수로 채워져 있는지 확인하고 필요한 경우 리필하고 목표와 식염수에 침지하십시오.골수 혈관을 찾아 부비동산 혈관을 따라 정렬 된 거대 카르요낭을 관찰하기 위해 epifluorescence를 사용합니다. 긴 획득을 위해 8킬로 헤르츠 공명 스캐너와 양방향 모드를 사용하여 384 x 384 픽셀 이미지로 3D 시공간 인수를 설정합니다. 좋은 해상도로 라인 평균을 사용한 다음 최적화된 Z 단계 크기를 선택하고 인수를 시작하기 전에 필요한 시간 간격을 설정합니다.짧고 빠른 인수를 위해 공간, 시간 획득 유형을 선택하고 이미지 크기를 최소화합니다. 필요한 경우 이미징 필드를 회전하여 이미지를 용기에 조정합니다. 사용 가능한 가장 높은 스캐닝 속도와 양방향 스캐닝을 사용합니다.이미지 정의와 수집의 급속성 사이의 최적의 타협을 찾기 위해 라인 평균을 최소화합니다. Z 플랜을 하나만 획득하고 획득 시시간을 최소화합니다. 혈소판 속도를 측정하기 위해 10~ 20초의 획득이 충분해야 한다.형광 추적자는 두개골 골수의 해부학 된 골수 부비동성 혈관을 이미지하기 위해 정맥 투여되었으며 화살표에 의해 묘사 된 유동 방향. 형광 혈소판 속도는 각 혈관 분기에 기록되었고, 변이가 관찰되었다. 부비동성 혈관은 마취로 인해 복잡한 흐름을 제시하며, 흐름 리플로우와 정지도 존재합니다.화살표는 분기에서 흐름의 반대 방향을 나타냈다. 혈소판 속도는 또한 가속, 정지 및 감속의 단계와 각 혈관 지점에서 시간이 지남에 따라 불규칙성을 표시 왼쪽 및 오른쪽 혈관 지점에 대해 측정되었다. 프로 플라츠탄의 다른 형태가 관찰되었다, 불규칙한 마진과 프로 플라판판을 포함, 다음 갈망 프로 플라틀렛과 두껍고 짧은 proplatelets.메가카요세포가 복잡한 흐름 영역에서 프로플라츠를 확장했을 때, 유동 방향에 따라 한 용기 지점에서 다른 혈관 분지로 배혈소판이 던졌다. 혈류를 멈추면 프로플라소판이 완화되고 마우스가 예기치 않게 심장 마비를 겪었으며, 연막 신장에서 유체 역학력의 중요성을 지적했습니다. 프로플라츠의 폭과 길이도 평균 폭 5.2 마이크로미터를 측정하고 평균 최대 길이약 185 마이크로미터가 관찰되었다.프로플라츠보 길이를 시간의 함수로 플로팅하면 신장, 정지 또는 후퇴 단계 동안 프로플라츠의 동작을 시각화할 수 있습니다. 분당 약 10 마이크로미터의 평균 신장 속도가 관찰되었다. 카테터의 설치, 프로 플라틀렛 형성 또는 실시간으로 관심의 다른 이벤트에 미치는 영향을 연구 하는 약물의 주입을 허용.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 노출된 두개골 뼈에 두개골 고리 어셈블리를 이식하고 장시간 고해상도 뇌 이미징을 위해 마우스의 머리를 고정하는 수술 절차에 대해 설명합니다.

마우스 모델의 두개골 고리 어셈블리 설치: 고해상도 두개골 골수 이미징을 위해 쥐 두개골에 시각화 창 어셈블리를 이식하는 수술 절차

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

이 프로토콜은 생체 내에서 대퇴골수에서 세포의 움직임을 추적하는 데 사용할 수 있는 새로운 쥐 대퇴골 창 챔버 모델을 설명합니다. 생체 내 다광자 형광 현미경은 시간이 지남에 따라 대퇴골수의 세 가지 구성 요소(혈관 구조, 콜라겐 매트릭스 및 호중구)를 이미지화하는 데 사용됩니다.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

여기서, 우리는 투과 전자 현미경 검사법(TEM)을 사용하여 시투에서 거대 카르요세포의 초구조를 분석하는 프로토콜을 제시한다. 뮤린 뼈 졸은 수집, 고정, 에폭시 수지에 내장및 초박형 섹션에서 절단됩니다. 대조 염색 후, 골수는 120 kV에서 TEM 현미경으로 관찰된다.

시투에서 전염 전자 현미경 검사를 사용하여 뮤린 메가 카요포이스의 탐사

여기서, 우리는 골수 각질 방법을 자세히, 샘플 준비에서 현미경 슬라이드 분석에, 프로 플라츠판을 형성하는 그들의 생리 환경에서 분화 한 메가 카요 세포의 능력을 평가하기 위해.

마우스 신선한 골수 이별의 프로플라츠 형성 역학

생체 내 현미경 검사를 통해 조직 재생 및 종양 발달과 같은 동적 생물학적 과정을 연구할 수 있습니다. 매우 역동적인 조직인 calvarial bone marrow는 조혈과 혈관 기능에 대한 통찰력을 제공합니다. 생체 적합성 3D 프린팅 머리 고정 임플란트를 사용하면 반복적인 종방향 이미징이 가능하여 조직 역학 및 종양 미세환경에 대한 이해가 향상됩니다.

Intravital Longitudinal Imaging of Vascular Dynamics in the Calvarial Bone Marrow(갈바리골수에서 혈관 역학의 생체 내 종단 영상)

학습하세요 마우스 두개골 골수에서 메가카르요세포와 프로플라틀 형성을 실시간 이미징하는 방법을. 이 기법은 혈소판 생성 메커니즘을 생리학적 조건에서 연구하는 데 활용됩니다.

인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

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