Name: 표적 및 태비네이션 하에서 절단을 사용하는 식물에서의 H3K4me3 수정 프로파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 학습하세요 CUT&Tag 방법을 사용하여 식물에서 H3K4me3 히스톤 수정 프로파일링을 수행하는 방법을. 면역침전 및 Tn5 트랜스포자제를 활용한 이 기법은 고효율 에피게놈 분석에 필수적입니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430)의 보조금과 중앙 대학, 하이난 야저우 베이 종자 연구소 (JBGS, B21HJ0403), 하이난 성 자연 과학 재단 (320LH002) 및 JCIC-MCP 프로젝트를위한 기초 연구 기금으로 부분적으로 재정적으로 지원되었습니다.

1. 트랜스포자제 및 스톡 용액 준비(1일차)
참고: 이 부분에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터는 활성 트랜스포자제를 만들기 위해 Tn5 트랜스포자제와 복합체화된다.
<ol><li>어닐링 완충액 (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 사용하여 프라이머 (프라이머 A, 프라이머 B 및 프라이머 C)를 100 μM 농도로 희석한다 (작업 용액에 대한 제조법에 대해서는 프라이머 및 표 2의 서열 정보는 표 1 참조). 사용 전까지 -20°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>PCR 튜브에 다음의 두 반응을 설정한다: 반응 1 (어댑터 AB), 100 μM의 프라이머 A, 10 μL의 100 μM 프라이머 B; 반응 2 (어댑터 AC), 10 μL의 100 μM 프라이머 A, 10 μL의 100 μM 프라이머 C.</li>
	<li>다음 프로그램을 사용하여 PCR 기계에서 어댑터를 어닐링한다: 히트 리드 (102°C), 15분 동안 75°C, 10분 동안 60°C, 10분 동안 50°C, 10분 동안 40°C, 30분 동안 25°C. 참고: 어댑터는 부분적으로 이중 가닥 DNA 분자입니다(농도 = 50 pmol/μL).</li>
	<li>1.5 mL 원심분리 튜브에서 다음 반응을 설정하십시오: 10 μL의 pA-Tn5 트랜스포자제 (500 ng/μL 또는 7.5 pmol/μL), 0.75 μL의 어댑터 AB (50 pmol/μL), 0.75 μL의 어댑터 AC (50 pmol/μL), 7 μL의 커플링 버퍼. 피펫 20x를 부드럽게 잘 섞어서 1시간 동안 수조에서 30°C에서 인큐베이션한다. 트랜스포자제의 최종 농도 = 4 pmol/μL. 사용 전까지 -20°C에서 보관한다. 참고: 어댑터 AB의 몰 비율: 어댑터 AC: 트랜스포자제 = 0.5:0.5:1.</li>
	<li>표 2에 제공된 제조법에 따라 스톡 용액을 준비하고, 스톡 용액을 오토클레이브 또는 여과하여 멸균한다.</li>
	<li>오토클레이브 및 가위, 여과지, 스테인리스 스틸 체, 모르타르, 유모차 등을 살균합니다.</li>
</ol>2. 핵 분리 (2 일째)
<ol><li>원심분리기를 4°C로 미리 냉각시킨다. 출발물질(면잎) 각 1 g에 대해, 25 mL의 핵 분리 완충액 A(10 mM 트리스 pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)를 준비하고, 20 mL의 핵 분리 완충액 B(10 mM 트리스 pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL의 핵 세척 완충액(10 mM 트리스 pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%), 항체 완충액 1 mL (50 mM 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 1 mg/mL BSA, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, 0.05% w/v 디지토닌). 튜브를 사용할 때까지 얼음 위에 놓으십시오.</li>
	<li>액체 질소에서 신선한 잎 (~ 1 g)을 미세 분말로 갈아서 25 mL의 냉각 핵 분리 버퍼 A가 들어있는 50 mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>완충 용액을 부드럽게 혼합하고 튜브를 얼음 위에서 5 분 동안 인큐베이션하여 부드럽게 흔들어 물질을 고르게 분산시킵니다.</li>
	<li>4°C에서 500 rcf에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성하였다.</li>
	<li>상청액을 데칸트하고, 0.5% 트리톤 X-100으로 보충된 냉각된 핵 분리 완충액 B의 20 mL로 펠렛을 재현탁시켰다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 펠렛을 완전히 재현탁시킵니다. 참고: 20mL 핵 분리 버퍼 B는 출발 물질 1g에 적용 가능하며, 이에 따라 부피를 조절할 수 있습니다.<ol>
<li>파일럿 분석을 수행하여 트리톤 X-100의 직렬 농도의 효과를 시험한다 (예를 들어, 분쇄된 조직 100 mg에 대해 각각 0.1%, 0.25%, 0.5%, 및 1% 트리톤 X-100을 갖는 2 mL 핵 분리 완충액 B). Triton X-100의 적절한 농도는 바닥에 흰색 / 회색 핵이 축적되고 저속으로 용해 및 원심 분리 후 짙은 녹색 상청액이 축적되어 표시됩니다 (4 분 동안 < 500 rcf).</li>
	</ol>
</li>
	<li>생성 된 세포 용해물을 두 개의 체로 필터링하십시오 : 상단의 500 메쉬 체는 더 큰 조직 파편을 제거하고 하단에는 1000 메쉬 체를 사용하여 핵을 수집합니다. 참고 : 식물의 핵 크기에 따라 체에 적합한 메쉬 크기를 선택하십시오.</li>
	<li>체 뒷면에 멸균 여과지를 사용하여 용해물의 작은 세포 파편을 흡수하십시오.</li>
	<li>용해물을 함유하는 나머지 핵을 1000 메쉬 체의 윗면에 네 개의 신선한 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리하여 핵을 수집하였다.</li>
	<li>피펫 팁을 사용하여 상층액을 가능한 한 많이 제거하고 핵 세척 완충액으로 펠렛을 세척하십시오.</li>
	<li>800 μL의 핵 세척 완충액을 첨가하고 튜브를 부드럽게 반전시켜 펠렛을 재현탁시킨다. 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 다시 회전시킨다.</li>
	<li>총 3 번의 세척을 수행하십시오.</li>
	<li>(선택 사항) DAPI 염색을 위해 현미경으로 핵을 이미지화한다.<ol>
<li>100 μL의 핵 현탁액을 단계 2.11로부터 핵 세척 완충액으로 옮긴다. 새로운 1.5 mL 튜브에. 900 μL의 핵 세척 완충액과 2 μL의 DAPI 원액 (1 mg / mL)을 첨가하여 DAPI에 대해 2 μg / mL의 최종 작업 농도를 만듭니다. 튜브를 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>염색 후, 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리하여 핵을 수집하였다.</li>
		<li>피펫 팁을 사용하여 상층액을 가능한 한 많이 제거하십시오. 800 μL의 핵 세척 완충액으로 3회 세척한다.</li>
		<li>상층액을 가능한 한 많이 제거하고 핵 세척 완충액 100μL로 핵을 재현탁시킨다.</li>
		<li>DAPI 채널을 사용하여 형광 현미경으로 핵을 이미지화한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두 개의 튜브 (각 1.5 mL 튜브에서 부피가 ~ 50 μL의 핵)에서 핵을 결합하십시오. 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 피펫 팁을 사용하여 나머지 버퍼를 최대한 제거하십시오.</li>
</ol>3. 항체 배양
<ol><li>각 50 μL의 핵을 1.5 mL 튜브에 1 mL의 항체 완충액과 함께 재현탁시킨다.</li>
	<li>각 튜브에 150 μL의 핵(~1 μg의 크로마틴)과 2 μL의 IgG(1 mg/mL)를 갖는 IgG 대조군의 2개의 생물학적 복제물, 각 튜브에 150 μL의 핵과 2 μL의 항-H3K4me3 항체(1 mg/mL)를 갖는 H3K4me3 분석 그룹의 두 개의 생물학적 복제물.</li>
	<li>용액을 부드럽게 혼합하고 튜브를 4°C 및 12 rpm에서 하룻밤 동안 혼성화를 위해 수평 진탕기 상에 방치한다.</li>
	<li>원심분리기를 4°C로 미리 냉각시킨다. 50 mL 원심분리 튜브에서 신선한 50 mL의 면역침전(IP) 세척 완충액(10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, ,0.05% w/v 디지토닌)을 준비한다. 튜브를 얼음 위에 앉히십시오.</li>
	<li>튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 각 튜브에서 항체 완충액을 분리한다.</li>
	<li>800 μL의 IP 세척 완충액을 각 튜브에 첨가하고 부드럽게 혼합하십시오. 튜브를 실온에서 5 분 동안 수평 쉐이커에 놓고 12 rpm으로 두십시오.</li>
	<li>세척 후, 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하십시오. 참고 : 핵 펠릿의 교란을 피하려면 ~ 50-80 μL의 완충액을 핵과 함께 두십시오.</li>
	<li>3.6.-3.7단계를 반복합니다. 두 번 더.</li>
	<li>세 번째 세척 후, 4°C에서 300 rcf에서 2분 동안 원심분리한다. 나머지 버퍼를 가능한 한 많이 제거하십시오.</li>
</ol>4. 트랜스포자제 인큐베이션
<ol><li>IP 세척 완충액 1 mL를 5 M NaCl 중 30 μL와 혼합하여 신선한 트랜스포사제 인큐베이션 완충액 (10 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, 0.05% w/v 디지토닌)을 만드십시오.</li>
	<li>인큐베이션을 위한 Tn5 트랜스포자제 믹스를 제조하기 위해, 트랜스포자제 인큐베이션 완충액의 각 150 μL에 트랜스포자제 1 μL를 첨가한다. 주: 반응 횟수에 따라 먼저 트랜스포자제 용액 믹스를 준비한 다음, 각 튜브에 150 μL의 분취량을 첨가한다.</li>
	<li>핵을 150 μL의 트랜스포사제 용액으로 재현탁시킨다.</li>
	<li>튜브를 실온에서 2-3 시간 동안 12 rpm의 수평 쉐이커에 놓고 10-15 분마다 혼합하십시오.</li>
	<li>트랜스포자제 인큐베이션 후, 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 트랜스포사제 인큐베이션 완충액을 각 튜브에서 제거한다.</li>
	<li>IP 세척 버퍼로 튜브를 세척하십시오. 이렇게 하려면 각 튜브에 800μL의 IP 세척 버퍼를 넣고 부드럽게 혼합한 다음 튜브를 실온에서 5분 동안 12rpm의 수평 진탕기에 둡니다.</li>
	<li>4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하십시오.</li>
	<li>4.6.-4.7단계를 반복합니다. 두 번 더.</li>
	<li>세 번째 세척 후, 4°C에서 300 rcf에서 2분 동안 원심분리한다. 나머지 버퍼를 가능한 한 많이 제거하십시오.</li>
</ol>5. 태그 지정
<ol><li>2 mL의 태멘테이션 완충액 (10 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, 10 mM MgCl2, 0.05% w/v 디지토닌)을 2 mL의 IP 세척 완충액과 60 μL의 5 M NaCl 및 20 μL의 1 M MgCl2와 혼합하여 갓 만든다.</li>
	<li>핵을 300μL의 태멘테이션 버퍼로 재현탁시킨다.</li>
	<li>용액을 혼합하고 태깅을 위해 1 h 동안 37°C 수조에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>10 μL의 0.5 M EDTA (최종 농도∼15 mM) 및 30 μL의 10% SDS (최종 농도 1%)로 태깅을 중단한다.</li>
</ol>6. DNA 추출 및 NGS 라이브러리 구축
<ol><li>7에 기재된 바와 같이 300 μL의 CTAB DNA 추출 완충액을 첨가한다. 튜브를 65°C 수조에서 30분 동안 인큐베이션한다. ~ 10 분마다 혼합하도록 반전하십시오.</li>
	<li>600 μL의 페놀:클로로포름: 이소아밀 알코올(25:24:1)을 각 튜브에 첨가한다. 철저히 섞으십시오.</li>
	<li>상잠금겔 튜브를 4°C에서 13,000 rcf에서 2분 동안 원심분리한다. 상기 용액을 위상 잠금 겔 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>4°C에서 13,000 rcf에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상청액(∼600 μL)을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>600 μL의 클로로포름을 각 튜브에 첨가하십시오. 철저히 섞으십시오.</li>
	<li>4°C에서 13,000 rcf에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상청액 (∼600 μL)을 새로운 1.5 ml 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>12 μL의 100% 에탄올과 2μL의 글리코블루 공침제를 첨가한다. 완전히 혼합하고 -20°C에서 1시간 동안 보관한다.</li>
	<li>4°C에서 13,000 rcf에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상층액을 데칸트하십시오. DNA 펠릿을 75% (v/v) 에탄올을 사용하여 세척하고 4°C에서 13,000 rcf에서 5분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상층액을 데칸트하십시오. DNA 펠릿을 공기-건조시키고 DNA를 25 μL의 ddH2O에 재현탁시켰다.</li>
	<li>PCR 반응을 다음과 같이 설정한다. 총 50 μL의 반응을 위해, 24 μL의 DNA, 11 μL의 ddH2O, 10 μL의 5x TAE 완충액, 2 μL의 P5 프라이머 (10 μM), 2 μL의 P7 프라이머 (10 μM) 및 1 μL의 TruePrep 증폭 효소를 첨가한다. PCR 프로그램: 3분 동안 72°C, 30초 동안 98°C; 그 후 30초 동안 98°C, 30초 동안 60°C, 30초 동안 72°C의 14 사이클을 거쳐 5분 동안 72°C로 사이클하였다. 참고: 연장을 위해 3분 동안 처음 72°C는 건너뛸 수 없습니다 . 라이브러리의 과다 증폭은 NGS에서 높은 수준의 PCR 중복을 초래할 것이다. 각 반응에서 ∼1 μg의 크로마틴을 사용할 때 H3K4me3에 대한 PCR 반응에서 12-14 PCR 사이클부터 시작한다.</li>
	<li>PCR 산물 2 μL를 전기영동을 위해 1.5% 아가로스 겔에 로딩한다.</li>
	<li>상용 DNA 정제 자석 비드를 사용하여 PCR 산물을 정제한다.</li>
	<li>라이브러리를 형광계 및 아가로스 겔 전기영동으로 정량화한다. 참고: 라이브러리의 유효 농도는 양호한 품질을 보장하기 위해 qPCR에 의해 >2 nM이어야 합니다.</li>
	<li>차세대 염기서열 분석(NGS) 및 데이터 분석을 수행합니다.</li>
</ol>

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<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag.</a> Plant Methods. 16, 120(2020).</li>
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</ol>

모든 저자는 위에서 언급 한 제품 중 하나를 거래하는 회사와 이해 상충이 없습니다.

여기에서는 염색질 면역침전(ChIP)에 비해 절차가 단순화된 적은 수의 세포를 사용하여 고분해능과 매우 낮은 배경으로 DNA 라이브러리를 생성하는 기술인 CUT&Tag에 대해 설명했습니다. 면화 잎에서 H3K4me3 프로파일 링을 성공적으로 수행 한 것은 동물 세포를 위해 처음 설계된 CUT & Tag가 식물 세포에도 사용될 수 있음을 시사합니다. ChIP assay8에 일반적으로 사용되는 트리스 버퍼 시스템과 동물 CUT&Tag에 사용되는 HEPES 버퍼 시스템은 식물 핵을 사용하는 CUT&Tag4,9에 대한 작업을 수행합니다. 손상되지 않은 식물 핵의 분리는 식물에 CUT&Tag를 성공적으로 적용하기 위한 중요한 단계입니다. 핵 분리4에 대한 이전에 보고된 방법론에서, 분쇄된 조직의 용액을 세포 용해 전에 미라클로스의 두 층을 통해 여과...

히스톤 변형 마크와 관련된 전사 인자 결합 DNA 부위 및 오픈 크로마틴은 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 기능적 역할을 하며 후성유전학 연구의 주요 초점입니다1. 종래에는 딥 시퀀싱(ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역침전 분석법(ChIP)이 특정 단백질을 이용한 특정 크로마틴 히스톤 변형 또는 DNA 표적의 게놈 전반의 동정을 위해 사용되어 왔으며, 후성유전학2 분야에서 널리 채택되고 있다. 표적 및 태멘테이션 (CUT&Tag) 기술 하에서의 절단은 원래 Henikoff Lab에 의해 게놈 전체에 걸쳐 단백질 제휴 DNA 단편을 포획하기 위해 개발되었습니다5. ChIP와 비교할 때, CUT&Tagcan은 단순화된 절차로 소수의 세포를 사용하여 고해상도와 매우 낮은 배경에서 DNA 라이브러리를 생성합니다3. 현재까지 CUT&Tag를 이용한 특이적 히스톤 변형을 갖는 크로마틴 영역을 분석하기 위한 방법이 동물 세포4,5에서 확립되었다. 특히, 단일 세포 CUT&Tag(scCUT&Tag)도 인간 조직 및 세포를 위해 성공적으로 개발되었습니다6. 그러나 세포벽과 이차 대사 산물의 복잡성으로 인해 CUT&TAG는 여전히 식물 조직에 기술적으로 도전적입니다.
이전에 우리는 동종 테트라 플로이드 면화 잎에서 분리 된 손상되지 않은 핵을 사용하는 CUT&Tag 프로토콜을보고했습니다4. 식물 조직을 이용한 핵 분리 및 DNA 포획의 효율성을 입증하기 위해, 프로파일링 절차가 여기에 제시된다. 주요 단계는 무손상 핵 단리, 크로마틴 변형을 위한 항체와의 계내 인큐베이션, 트랜스포자제 인큐베이션, 어댑터 통합, 및 DNA 라이브러리 준비를 포함한다. 문제 해결은 식물 핵 분리 및 품질 관리를 위한 CUT&Tag 라이브러리 준비에 중점을 둡니다. 
이 연구에서는 식물에 대한 세련된 CUT&Tag 전략을 제시합니다. 우리는 면화 잎에서 H3K4me3 프로파일 링을위한 단계별 프로토콜을 제공 할뿐만 아니라 적절한 세포 용해를위한 세제 농도를 선택하는 전략과 핵을 필터링하는 전략을 포함하여 식물 핵 분리를위한 최적화 된 방법론을 제공합니다. 중요한 의견이 있는 자세한 단계도 이 업데이트된 프로토콜에 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Normal rabbit IgG</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml BSA 원액을 만듭니다. -20°C에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>디지토닌(~50% (TLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>5% 디지토닌 원액(200mg 디지토닌[~50% 순도]에서 2mL DMSO)을 만듭니다. 참고 : 0.22미크론 필터를 사용하여 살균하십시오. -20°C에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드 (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>클로로포름</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)</td><td></td><td></td><td>0.5 M EDTA (pH = 8.5) 원액을 만듭니다. 참고: 100mL의 0.5-M EDTA(pH = 8.5)를 만들려면 pH</td>에탄올</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>을 조정하기 위해 약 2g의 수산화나트륨(NaOH) 펠릿이 필요합니다.<tr><td>GlycoBlue Coprecipitant(15mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)</td><td></td><td></td><td>1M MgCl2 원액</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Calbiochem 만들기</td><td>539133-1SET</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td></td><td></td><td>1M KCl 원액</td></tr><tr><td>만들기 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1,v:v:v)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td></td><td></td><td>5M NaCl 원액</td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td></td><td></td> 만들기 <td>2M 스페르미딘 원액 만들기, -20°C에서 보관.</td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td><td></td><td></td><td>10 % SDS 원액을 만듭니다. 참고: 오토클레이브하지 마십시오. 0.22 미크론 필터를 사용하여 살균</td></tr><tr><td>Tris base</td><td></td><td></td><td>1 M Tris (pH = 8.0) 원액</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>제조 20 % Triton X-100 원액</td></tr> <tr><td>Enzyme</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cut& 용 pA-Tn5 전이 효소 / 강 pA-Tn5 전이 효소 태그</td>: <td>Vazyme</td><td>S602/S603</td>: <td>Tn5와 융합된 단백질 A 또는 단백질 G의 항체 친화도를 확인합니다. 일반적으로 단백질 A와 G는 광범위한 항체 친화력을 가지고 있습니다. 그러나 단백질 A는 토끼 항체에 대해 상대적으로 더 높은 친화력을 가지며 단백질 G는 마우스 항체에 대해 상대적으로 더 높은 친화력을 갖습니다. 항체와 일치하는 적절한 transposase 산물을 선택하십시오.</td></tr><tr><td>TruePrep Amplify Enzyme</td><td>Vazyme</td><td>TD601</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI9700</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>MIULAB</td><td>HS-25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One&nbsp; 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-원-W</td><td></td></tr></tbody></table>

표적 및 태비네이션 하에서 절단을 사용하는 식물에서의 h3k4me3 수정 프로파일링

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

DNA 및 히스톤 변형, 전사 인자의 거동 및 모집된 단백질과의 비코딩 RNA를 포함하는 색채 수준에서의 에피게놈 조절은 유전자 발현의 시간적 및 공간적 조절을 유도한다. 표적 및 태멘테이션 하에서의 절단(CUT&Tag)은 특정 크로마틴 단백질이 먼저 특정 항체에 의해 인식되고, 그 다음에 항체가 단백질 A-트랜스포자제(pA-Tn5) 융합 단백질을 테더링하는 효소-테더링 방법으로, 마그네슘 이온의 활성화에 의해 표적 염색질을 현장에서 절단한다. 여기에서, 우리는 수정과 함께 allortetraploid 면화 잎에서 분리 된 손상되지 않은 핵을 사용하여 이전에 발표 된 CUT&Tag 프로토콜을 제공합니다. 이 단계별 프로토콜은 식물의 후성 게놈 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 식물 핵 분리에 대한 실질적인 변형은 비판적인 논평과 함께 제공된다.

그림 1은 CUT&amp;Tag 워크플로를 보여 줍니다. 도 2는 무손상 핵의 DAPI 염색을 나타낸다. "핵 분리" 단계의 목표는 후속 CUT&amp;Tag 반응을 위해 충분한 양으로 온전한 핵을 수득하는 것이었다. 도 3은 PCR 산물의 아가로스 겔 전기영동을 나타낸다. IgG 음성 대조군은 실험을 설정할 때 병렬로 요구된다. IgG 대조군과 비교하여, H3K4me3 항체 샘플로 뽑아낸 DNA 단편의 벌크는 ∼280 내지 500 염기쌍 범위였다. 도 4 는 IgG 음성 대조군과 비교하여 항-H3K4me3 항체에 대한 결과적인 차세대 시퀀싱을 보여준다.
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표적 및 태멘테이션 (CUT&Tag) 하에서의 절단은 효율적인 크로마틴 에피게놈 프로파일링 전략이다. 이 프로토콜은 식물에서 히스톤 수정의 프로파일 링을위한 세련된 CUT & Tag 전략을 제시합니다.

표적 및 태비네이션 하에서 절단을 사용하는 식물에서의 H3K4me3 수정 프로파일링

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

실험의 전반적인 목표는 크로마틴의 상태를 반영한 게놈 전체에서 단백질 관련 DNA 단편을 확인하는 것이 었습니다. 이 목표를 달성하기 위해 세 가지 특수 작업이 수행되었습니다. 우선, 식물 세포로부터 온전한 핵을 분리하였다.둘째로, 크로마틴에 대한 변형은 계내에서 특이적 항체에 의해 인식되었다. 셋째, 단백질 A-트랜스포사제 융합 단백질인 Tn5 트랜스포사제를 테더링하는 항체는, 마그네슘 이온의 활성화 하에 크로마틴을 계내에서 절단한다. 이어서, DNA 단편 및 크로마틴 변형 결합 부위를 어댑터와 통합하고 DNA 준비를 준비하였다.중합효소 연쇄 반응 농축 강화 생성 시퀀싱. DNA 및 히스톤 변형, 전사 인자의 거동 및 모집된 단백질과의 비코딩 RNA를 포함하는 색채 수준에 대한 에피게놈학 조절은 유전자 발현의 시간적 및 공간적 조절을 유도한다. Henikoff Lab에서 개발한 CUT&Tag 기술은 고효율로 크로마틴 에피게놈 프로파일링을 위한 효소 테더링 방법입니다.여기서 우리는 실험 재료로서 목화 잎을 채용하고, 일례로 히스톤 H3 리신-4 트리메틸화의 항체를 사용하여 크로마틴 프로파일링을 수행한다. 우리는 공장에서 CUT&Tag 성능을 위한 비디오와 함께 세련된 프로토콜을 제공합니다. CUT&Tag를 사용한 각 샘플 준비에 대해, 면잎 조직의 그램을 수집하였다.잎을 액체 질소로 미세분말로 분쇄하고, 냉각된 핵 분리 버퍼 A.The 완충액을 25 mL가 들어있는 50 mL 팔콘 튜브로 옮기고, 튜브를 부드럽게 진탕하여 5분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하여 물질을 고르게 분산시켰다. 이어서, 500 상대 원심력 또는 rcf에서, 섭씨 4도에서, 5분 동안 회전시켜, 세포 펠릿을 형성하였다. 상청액을 디캔팅하고, 펠렛을 0.5%트리톤으로 보충된 냉각된 핵 분리 완충액 B의 20 mL로 재현탁시켰다.튜브를 부드럽게 반전시켜 펠릿을 완전히 재현탁시켰다. 이어서, 생성된 세포 용해물을 두 개의 체들의 조합으로 여과하였고, 500-메쉬 체를 상부에 사용하여 더 큰 조직 파편을 제거하였다. 그리고 핵을 수집하기 위해 바닥에 1000 메쉬 체를 사용하였다.체의 적절한 메쉬 크기의 선택은 식물의 핵의 크기에 달려 있습니다. 멸균 여과지는 용해물의 일부와 작은 세포 파편을 흡수하기 위해 체의 뒷면에 사용되었다. 핵을 함유하는 용해물을 신선한 1.5 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고, 섭씨 4도에서 4분 동안 300 rcf에서 회전시켜 핵을 수집하였다.원심분리 후, 피펫 팁을 사용하여 상층액을 가능한 한 많이 제거하였다. 800 마이크로리터의 양으로, 핵 세척 완충액을 첨가하였다. 그리고 튜브를 부드럽게 반전시켜 핵을 재현탁시켰다.튜브를 섭씨 4도에서 4분 동안 300rcf로 다시 회전시켰다. 총 3번의 세척 후, 생성된 핵을 신선한 1.5 밀리리터 원심분리 튜브에서 합하고, 섭씨 4도에서 4분 동안 300 rcf에서 회전시켰다. 피펫 팁을 사용하여 나머지 버퍼를 가능한 한 많이 제거했습니다.다음 단계는 항체의 인큐베이션이었다. 50 마이크로리터의 핵의 분취량을 디지토닌 중의 EDTA, BSA, 프로테아제 억제제 칵테일로 보충된 1 밀리리터의 항체 완충액에 재현탁시켰다. 핵 현탁액의 150 마이크로리터의 분취량을 하나의 반응을 위해 신선한 1.5 밀리리터 튜브에 넣고, 두 마이크로리터의 항체를 각 튜브에 첨가하였다.이 분석에서, 항히스톤-H3-라이신-4-트리메틸화 항체 및 면역글로불린 G 음성 대조군에 대한 두 개의 생물학적 복제물을 항체가 첨가된 후에 설정하였다. 용액을 부드럽게 혼합하고, 튜브를 12 rpm에서 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 혼성화를 위해 수평 진탕기 상에 방치하였다. 다음날 아침, 튜브를 꺼내고 핵을 800 마이크로리터의 면역 침전 세척 완충액을 사용하여 세척하였다.튜브를 혼합을 위해 부드럽게 반전시키고, 실온에서 12 rpm으로 다섯 분 동안 수평 진탕기 상에 방치하였다. 세척 후, 튜브를 섭씨 네 도에서 네 분 동안 300 rcf에서 회전시켰다. 원심분리 후, 상층액을 피펫 팁을 사용하여 제거하였다.이것은 총 세 번의 세척 동안 반복되었다. 세 번째 세척 후, 튜브를 섭씨 네 도에서 두 분 동안 300 rcf로 회전시키고, 피펫 팁을 사용하여 나머지 버퍼를 가능한 한 많이 제거하였다. 인큐베이션을 위한 Tn5 트랜스포자제 믹스를 제조하였다.1 마이크로리터의 트랜스포자제를 트랜스포사제 인큐베이션 완충액의 각 150 마이크로리터에 첨가하였다. 우리는 반응의 수에 따라 먼저 트랜스포자제 용액 믹스를 준비하는 것이 좋습니다. 그런 다음 각 튜브에 150 마이크로리터의 분취량을 첨가한다.용액을 부드럽게 혼합하고, 2시간 동안 실온에서 12 rpm의 수평 진탕기 상에 방치하였다. 튜브를 10 내지 15분마다 부드럽게 혼합하였다. 인큐베이션 후, 핵을 실온에서 800 마이크로리터의 면역침전 세척 완충액을 사용하여 세 번 세척하여 결합되지 않은 Tn5 트랜스포자제를 제거하였다.세 번째 세척 후, 튜브를 섭씨 네 도에서 두 분 동안 300 rcf에서 회전시키고, 피펫 팁을 사용하여 나머지 완충액을 제거하였다. 태멘테이션 단계를 위해, 300 마이크로리터의 태멘테이션 버퍼를 반응 튜브에 첨가하였다. 용액을 잘 혼합하고 섭씨 37도에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다.10%SDS의 30 마이크로리터에서 리터당 0.5 몰의 EDTA를 10 마이크로리터로 인큐베이션한 후 반응을 확인하기 위해 첨가하였다. 다음으로 300 마이크로리터의 DNA 추출 완충액을 첨가하였다. 불규칙한 DNA 추출을 수행하였다.DNA 단편을 25 마이크로리터의 멸균수에 용해시켰다. 24 마이크로리터를 NGS 라이브러리 구축에서 PCR 증폭에 사용하였다. 이 그림은 현미경으로 이미지화 된 DAPI로 손상되지 않은 핵 염색을 보여 주며 적절한 양의 손상되지 않고 비교적 깨끗한 핵을 얻는 것이 CUT & Tag의 중요한 단계입니다.PCR 후, 두 마이크로리터를 옮기고 1.5% 아가로스 겔에서 DNA의 크기를 검사하였다. 이 그림은 면역글로불린 유전자가 음성 대조군과 비교된다는 것을 보여준다. 히스톤 H3 라이신 4 트리메틸화 샘플로부터의 DNA 단편의 대부분은 280 내지 500 염기쌍 범위이어야 한다.DNA 단편은 정제될 수 있고, 이어서 높은 처리량 시퀀싱에 의해 프로파일링될 수 있다. 이 도면은 면역글로불린 G 음성 대조군과 비교하여 항히스톤 H3 라이신4 트리메틸화 항체에 대한 시퀀싱 생성 결과를 나타낸 것이다. 이 기술은 ChIP-seq와 비교하여 단순화 된 절차로 소수의 세포를 사용하여 고해상도 및 예외적으로 낮은 배경으로 DNA 라이브러리를 생성합니다.CUT&Tag는 새로운 방법이며 아직 진행 중입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

특정 식물 유전자 히스톤 수정을 감지하는 신뢰할 수있는 유용한 접근 방법이 설명되어 있습니다. 접근 방식은 염색질 immunoprecipitation (칩)와 실시간으로 양적 PCR을 결합하여. 그것은 다양한 생리 과정에서 역할과 특정 유전자 히스톤 수정을 감지 수 있습니다.

식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

이 프로토콜은 엔지니어링 가뭄 내성 작물을 돕기 위해 잠재적 후성 유전학 마커역할을 할 수 있는 번역 후 변형 후 프로파일링을 위해 사탕수잎 재료로부터 손상되지 않은 히스톤을 효과적으로 추출하기 위해 개발되었습니다.

잠재적 인 후성 유전학 마커의 하향 식 질량 분광프로파일링을위한 수줌 잎 조직에서 히스톤의 격리

여기서, 우리는 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류의 병기에서 새로운 표적 유전자를 확인할 수 있는 히스톤 수정의 게놈 전체 분포를 분석하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

마그나포테 오리자에서 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 방법을 이용한 히스톤 수정 분포의 게놈 전체 분석

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

후성유전학 분야를 처음 접하는 연구자들은 CUT&amp;Tag가 ChIP 분석에 대한 훨씬 더 쉬운 대안임을 알게 될 것입니다. CUT&amp;Tag는 희귀 및 원발성 세포 집단에 대한 후성유전학 연구에 큰 도움을 주어 극소수의 세포에서 고품질 데이터를 생성했습니다. 이 프로토콜은 마우스 뒷다리 근육에서 분리된 마우스 근아세포에 대해 H3K4me1 CUT&amp;Tag 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&#38;Tagmentation) 분석 사용

이 프로토콜은 다양한 임상 샘플에서 효율적인 히스톤 추출을 가능하게 하여 LC-MS/MS를 통한 후속 번역 변형 분석에 활용합니다. 주요 히스톤 변형의 견고한 검출을 촉진함으로써, 대규모 임상 코호트에서 포괄적인 후생유전학적 프로파일링을 위한 귀중한 도구로 활용됩니다.

질량분석법을 이용한 후생유전학적 프로파일링을 위한 임상 표본에서 히스톤 추출

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&amp;Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

학습하세요 CUT&Tag 방법을 사용하여 식물에서 H3K4me3 히스톤 수정 프로파일링을 수행하는 방법을. 면역침전 및 Tn5 트랜스포자제를 활용한 이 기법은 고효율 에피게놈 분석에 필수적입니다.

표적 및 태비네이션 하에서 절단을 사용하는 식물에서의 H3K4me3 수정 프로파일링

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