Name: 유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 학습하세요 디지털 물방울 PCR(ddPCR)을 활용한 유전자 변형 Anopheline 모기 인구의 인델 돌연변이 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 NHEJ 이벤트를 신뢰성 있게 측정하여 유전 공학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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기금은 캘리포니아 어바인 말라리아 이니셔티브의 대학에 의해 제공되었다. AAJ는 캘리포니아 대학교 어바인의 도널드 브렌 교수입니다.

1. DNA 추출
<ol><li>EDTA/핵 리시스 버퍼(EDTA/NLS)를 NLS 500 μL 및 시료당 120 μL의 비율로 준비하십시오. 여러 샘플에 대한 확장. 얼음에 혼합물을 진정. 참고: 볼륨에 따라 냉각시 용액이 2~5분 만에 흐려집니다.</li>
	<li>1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브에서 10-15s의 기계적 균질화를 사용하여 모기 샘플을 균질화하여 냉장 EDTA/NLS의 600μL로 채워진; 완전히 섞으세요.</li>
	<li>17.5 μL의 20 mg/mL의 Proteinase K를 튜브에 넣고 완전히 섞습니다.</li>
	<li>55 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 또는, 55°C에서 3h의 시료를 흔들어 서 배양하고 1h마다 샘플을 소용돌이시다.</li>
	<li>20μL의 단백질 침전액을 실온 샘플에 넣고 20초 동안 적극적으로 소용돌이를 가합니다.</li>
	<li>얼음에 5 분 동안 샘플을 냉각.</li>
	<li>4 분 동안 15,890 RCF에서 펠릿 단백질에 대한 샘플을 원심 분리합니다.</li>
	<li>DNA를 포함하는 상체를 조심스럽게 흡인하고 600 μL의 이소프로판올을 포함하는 깨끗한 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다.</li>
	<li>튜브를 5-10번 반전시켜 용액을 부드럽게 섞는다. 원심분리기 는 15,890 RCF에서 1 분 동안. DNA 펠릿을 보존하면서 상체를 신중하게 감소시다.</li>
	<li>실온 70% 에탄올 600 μL을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 반전시켜 펠릿 DNA를 씻으십시오.</li>
	<li>원심분리기 는 15,890 RCF에서 1 분 동안. 유리 파이펫 팁을 사용하여 포부로 상체를 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>튜브를 깨끗한 흡수성 용지에 반전시키고 펠릿을 10-15분 동안 공기 건조시하십시오.</li>
	<li>PCR 급 물로 DNA를 다시 중단합니다. 개별 모기 샘플 당 20 μL 또는 10개의 풀이 있는 모기에 100 μL을 사용하십시오. 참고: 시판되는 키트(재료 표참조)를 사용하여 모기 샘플을 위한 DNA 추출 방법은 조직 배양 세포 및 동물 조직 프로토콜에서 제조업체의 게놈 DNA를 분리하여 조정합니다.</li>
</ol>2. ddPCR 반응 및 액적 생성 준비
<ol><li>불소계를 사용하여 DNA를 정량화합니다. 참고: 드롭오프 분석의 경우, 반응당 3,000-30,000 haploid 게놈 사본을 사용하는 것이 좋습니다. NHEJ 변종의 존재를 나타냅니다.</li>
	<li>추출물에서 HAploid 게놈 중량 및 DNA 의 농도를 사용하여 복사 번호를 계산합니다. 이는 총 DNA 질량을 획득하는 데 사용되는 부피에 의해 추출된 DNA의 농도를 곱한 다음, 이를 합유 형 게놈 무게로 나누어 서 수행됩니다. 추가된 부피가 1-10 μL 사이인지 확인하십시오. 참고: 1개의 Anopheles 감비아hae haploid 게놈은 성인 모기10당0.27 pg로 추정됩니다.</li>
	<li>디자인 프라이머와 프로브. 150-400 bp의 앰플리콘을 생산하는 gRNA 표적 부위의 5--ends 측면55-60°C 범위의 프라이머 용융 온도(Tm)로 전진 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계한다.<ol>
<li>NHEJ 검출을 위한 HEX(헥사클로로 플루오레세인)-표지 프로브: 대상 부위에 +15-20bp의 올리고뉴클레오티드를 설계하고 HEX-프로브를 5엔드 및 BHQ1(BLack Hole Quencher 1)에 3'엔드에 추가합니다. 가수 분해 프로브의 Tm은 프라이머의 Tm보다 3-10 °C 높아야한다.</li>
		<li>참조 WT를 위한 FAM(6-카박스플루오레세인)-표지 프로브: 대상 부위로부터 먼 게놈 부위(약 25bp)에 대한 보완적인 길이의 올리고뉴클레오티드~15-20bp를 설계하고 FAM 프로브를 5엔드 및 BHQ1에 3엔드에 추가한다. 가수 분해 프로브의 Tm은 프라이머의 Tm보다 3-10 °C 높아야한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR 반응 준비
<ol><li>ddPCR 샘플 믹스의 25 μL을 다음과 같은 구성 요소와 함께 준비하십시오: 프로브용 ddPCR 슈퍼믹스(UTP 없음): 12.5 μL, 전방 및 역 프라이머 (10 μM): 각각 1 μL, HEX / FAM 프로브 (10 μM): 각각 0.625 μL, DNA : 1-5 μL (3,750-37,500 haploid 게놈 사본) 및 물 : 최대 25 μL.</li>
	<li>소용돌이 또는 역류 피펫팅(위아래) (20x)에 의해 반응을 철저히 혼합합니다. 참고: 반응이 96웰 플레이트에 있는 경우 거품 형성을 피하기 위해 소용돌이가 아닌 전체 부피를 20배 위아래로 피펫합니다.</li>
	<li>간략하게 원심 분리하여 튜브의 바닥에 혼합물을 정착시키거나 잘 합니다. 참고: 액적 생성을 위해 상온에 반응하는지 확인합니다. 각 카트리지에 추가/사용하지 않은 우물을 위해 ddPCR 믹스 1x를 준비합니다(각 카트리지에는 8개의 우물이 있습니다).</li>
</ol>4. 물방울 생성
<ol><li>50 μL 멀티채널 파이펫을 사용하여 ddPCR 샘플의 20 μL을 카트리지의 중간 행에 혼합합니다(도1A,상단).</li>
	<li>오일의 70 μL을 아래쪽 행에 로드합니다. 사용되지 않는 우물에 1x ddPCR 슈퍼믹스의 20 μL을 로드합니다. 참고: 거품을 소개하지 마십시오.</li>
	<li>개스킷을 가장자리만 만져서 중앙 컨캐빙영역(도 1B)을피하십시오.</li>
	<li>플레이트를 방울 발생기에 단단히 놓고 덮개를 닫아 실행을 시작합니다.</li>
	<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 카트리지의 위쪽행(도 1A,아래)에서 에머젼 믹스의 40 μL을 96웰 플레이트로 옮킨다.<ol>
<li>45-30° 각도에서 3-5s용 액체 샘플을 그립니다. 혼합물을 45° 각도로 천천히 추출하여 옆으로 떨어뜨립니다. 파이펫의 두 번째 정류장(완전한 추방)으로 이동하여 모든 액체를 추방하는 것은 괜찮습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>호일 열 씰을 사용하여 180 °C에서 5 s의 플레이트를 밀봉하십시오.</li>
</ol>5. PCR
<ol><li>밀봉된 플레이트를 열순환기(도1C)에넣고 NHEJ 드롭오프 가이드라인을 다음과 같이 따르는 경우 권장 PCR 조건을 설정합니다.<ol>
<li>초기 내분은 95°C에서 10분 동안.</li>
		<li>30초동안 94°C의 40사이클을 시전하여 30초, 55°C내지 1분 내지 1분, 60°C를 2분 동안 연장한다.</li>
		<li>98 °C에서 10 분 동안 유지하십시오.</li>
		<li>4 °C에서 유지하십시오. 참고: 특정 프라이머 및 프로브 세트에 대한 어닐링 온도는 열 그라데이션을 사용하여 최적화될 수 있습니다. 모든 단계에 대해 2°C/s의 경사로 속도를 사용합니다. PCR 조건은 각 실험 설계 및 설정에 따라 조정되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 물방울 읽기
<ol><li>플레이트를 왼쪽 상단에 잘 A-1로 배치합니다(스무딩 코너, 다른 3개는 모서리)(도1D).</li>
	<li>프로그램에서 플레이트 설정: FAM을 알려진 참조 채널및 HEX를 알 수 없는 채널로지정(그림 2A).</li>
	<li>직접 정량화로 방울 읽기 실험을 실행합니다. 실행이 끝나면해석(그림 2A)에대해 실험 유형을 드롭오프(DOF)로 변경합니다. </li>
</ol>7. 분석
<ol><li>올바른 실험 매개변수(그림 2A): 샘플 정보, 슈퍼믹스, 대상 이름(WT 또는 NHEJ), 대상 유형(Ref 또는 알 수 없음), 신호 Ch1(HEX 또는 FAM), 신호 Ch2(HEX 또는 FAM), 물방울 수에 대한 임계값을 수동으로 설정하고(신뢰할 수 있는 결과를 위해 10,000개 이상 권장). 소프트웨어는 지정된 매개 변수와 분석의 대부분을 수행합니다.</li>
	<li>물방울 탭에서 물방울 수를 확인합니다. 모든 것이 10,000(그림 2B)을초과하는지 확인합니다.</li>
	<li>1 D 진폭을 확인하여 네거티브로부터의 효율적인 신호 분리를 확인하십시오.</li>
	<li>플레이트 편집기에서전체 플레이트를 강조 표시하고 실험 유형을 드롭오프하도록 설정합니다.</li>
	<li>WT 대상을 참조로설정하고 FAM용 채널 1을 지정하고 HEX용 채널 2를 지정합니다.</li>
	<li>NHEJ 대상을 알 수 없는 것으로 설정하여 FAM용 채널 1과 채널 2를 없음으로 지정합니다.</li>
	<li>2D 진폭 탭에서 각 샘플에 대한 그래프 도구로 클러스터 임계값을 설정합니다. WT 클러스터와 연관된 꼬리를 고려합니다. 이것은 NHEJ 애사(그림 3A)에대 한 정상입니다. 참고: 비율 탭 아래에서 그래프 오른쪽 상단에서 기어 아이콘을 클릭합니다. 분수 풍부를 선택합니다. 이제 그래프는 NHEJ 이벤트비율(그림 3B)에해당하는 점을 플롯합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).</li>
<li>Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agricultural+pest+control+with+CRISPR-based+gene+drive%3A+time+for+public+debate%3A+Should+we+use+gene+drive+for+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control.</a> EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).</li>
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<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+droplet+digital+PCR+and+direct+Sanger+sequencing+for+the+detection+of+the+BRAFV600E+mutation+in+papillary+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Laboratory+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902(2019).</li>
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<li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298 (5591), 129-149 (2002).</li>
</ol>

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디지털 물방울 PCR은 Cas/gRNA 기반 유전자 구동 시스템에서 NHEJ 이벤트로 인한 인델 알레일의 존재를 결정하고 개인 또는 인구에서 이러한 알레일의 주파수를 정량화할 수 있는 효율적인 방법입니다. 프로토콜의 몇 가지 단계는 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 특별한주의를 기울여야합니다. 첫째, 게놈 DNA 추출은 고품질과 충분한 양을 보장하기 위해 신중하게 수행되어야 합니다. 좋은 추출은 반응 당 haploid 게놈 사본의 정확한 결정을 허용할 것입니다. 우리의 경험에 따르면, 상용 키트 (재료의 표참조) 지속적으로 고품질의 DNA 추출을 제공. 그러나 DNA 펠릿이 시각화하기 어려워지고 주의하지 않으면 상체로 쉽게 빨려 들어올릴 수 있기 때문에 개별 모기의 추출은 특히 어려울 수 있습니다. 둘째, 프라이머와 프로브는 신중하게 설계되어야 합니다. ddPCR 실험을 완료하기 전에 설계된 프라이머가 먼저 기존 PCR을 수행하고 젤 전기포진을 통해 단일 제품을 시각화하여 단일 PCR 제품이 생성되도록 하십시오. 또한 참조 FAM 프로브는 매우 보존된 시퀀스에 보완되도록 설계되어야 합니다. 이를 통해 다양한 인구에 걸쳐 WT 알레를 정확하게 감지할 수 있습니다. 각 고유한 실험에 대한 프라이머/프로브 조합은 서로 다른 열사이클러 조건을 가지며 열 그라데이션을 사용하여 이러한 조건을 최적화하는 것이 좋습니다.
Sanger 시퀀싱 또는 NGS와 같은 인델을 식별하는 다른 방법이 존재합니다. Sanger 시퀀싱은 검출 의 하한과 새로운 변종을 식별하기 위해 낮은 발견 전력을 가지고 있기 때문에 제한됩니다. Sanger 시퀀싱도 노동 집약적이며 높은 처리량이 아닙니다. Sanger 시퀀싱과 비교하여 NGS는 낮은 감도, 검색 전력 및 처리량의 동일한 제한이 없습니다. NGS의 또 다른 이점은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)에서 재배열에 이르기까지 다양한 돌연변이를 검출하는 능력입니다. 그러나 NGS는 관심 영역이 하나뿐이기 때문에 Cas9/gRNA 관련 인델을 결정하는 적용시 더 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 방법이며, 더 큰 게놈 전체 분석에 가장 적합합니다. 앞서 언급한 방법에 비해 ddPCR은 처리량이 높으며 빠른 턴어라운드 시간을 갖는다. ddPCR 재료 및 계측기가 사내에서 사용할 수 있는 경우, 96개의 샘플을 1-2일 이내에 처리할 수 있어 Cas9/gRNA-변형 생물의 대규모 실험에 대한 빠른 분석에 적합합니다.
ddPCR에 대한 많은 이점이 존재하지만 제한사항도 있습니다. 첫째, ddPCR 장비는 독립적인 실험실 환경에서는 자주 사용할 수 없습니다. ddPCR 장비는 대규모 연구 기관에서 공동으로 사용할 수 있지만 기관 외부에서 데이터 생성 및 분석이 용이하지는 않습니다. 둘째, 대안과 달리, ddPCR은 확인된 인델 돌연변이의 개별 고유 서열을 제공하지 않는다. 디지털 물방울 PCR은 인구 내에서 인델 돌연변이의 주파수를 제공하지만, 서열없이, 존재하는 인델이 관심있는 유전자의 기능을 보존하거나 억제 할 가능성이 있는지 여부를 결정할 수 없습니다. ddPCR 방법은 아마도 Cas9/gRNA 기반 드라이브 유기체의 현장 방출 시험 후 야생 인구를 분석하는 것이 가장 적합하기 때문에 원모로 의 전환유전자도입 빈도와 인구 내의 인델 생성을 실시간으로 효율적으로 결정할 수 있기 때문이다. ddPCR빠른 턴어라운드 시간으로 인해 재료가 로컬로 제공되는 경우 매주 현장 시험 지역에서 샘플링을 수행하고 인구를 분석하는 것이 가능할 것입니다. ddPCR 장비를 구입, 수입 및 설정하는 시동 비용은 원격 실험실에서 높지만 드라이브 시스템에서 수정을 받고 있으므로 야생 인구를 엄격하게 평가할 수 있다는 이점은 비용을 정당화할 수 있습니다.

유전자 드라이브는 의료 및 농업관련성1,2,3,4,5의곤충 인구를 제어 할 수있는 엄청난 잠재력을 갖는다. 예를 들어, CRISPR Cas 뉴클레아제 및 가이드 RNA(gRNA)를 기반으로 한 유전자 구동 시스템은 말라리아 기생충에 내화성을 부여하는 특성을 도입하여 벡터 모기 집단을 수정하는 데 사용될 수 있으며, 이는 감소된 투과및 적은질환으로이어지는1,4,5. 유전자 구동 시스템은 전 메이오성 세균 세포에서 한 동종 염색체에서 다른 것으로 분리된 특성을 복사하며, 이것은 자손의 대다수가 드라이브를 상속하고 현장에서 오래 지속되고 지속 가능한 인구 수정의 잠재력을 창출할 수 있도록 합니다. 그러나, Cas/gRNA 기반 방법의 한 가지 단점은 비동상화 최종 결합(NHEJ) DNA 수리를 통해 삽입 및 삭제(indel) 돌연변이를 생성할 수 있다는 점이며, 그 결과 인구에서 충분히 높은 주파수로 축적될 때,구동시스템이1,2,3,4, 4의 확산으로부터 구동 시스템을 멈출 수 있다는것입니다. . 이 프로토콜은 Cas/gRNA 기반 유전자 드라이브 동안 인구 및 개별 수준에서 인델 돌연변이의 보급및 상대적 양을 결정할 수 있는 높은 처리량 및 신뢰할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다.
차세대 시퀀싱(NGS) 메서드는 비교할 수 없는 시퀀싱 해상도를 제공합니다. 그러나 NGS와 관련된 비용 및 기술적 요구 사항은 일상적인 테스트를 금지하고 인델6,7,8을평가하는 고처리량 방법으로 사용을 제한합니다. 전통적인 PCR 정량화 방법은 오랫동안 게놈 인델에 대한 표준 평가 절차로 사용되어 왔습니다. 그러나 이러한 방법은 노동 집약적이며 데이터를 조달하는 데 시간이 오래 걸리며 변동성이 높습니다. 디지털-물방울 PCR(ddPCR)은 일부 응용 분야에서 Sanger 시퀀싱보다 돌연변이 검출시 더 민감하다는 것이 입증되었으며, 그 외6,7,8,9에서NGS보다 검출 한계가 낮다. 더욱이, 결과를 얻기 위한 샘플 세트 및 턴어라운드 시간을 평가하는 비용은 Sanger 시퀀싱 또는 NGS9보다ddPCR에 대해 각각 비용이 적게 들고 빠릅니다. 드롭오프 분석은 이중 프로브 시스템을 사용하여 gRNA 지향 대상 Cas9 절단 부위에 야생 유형(WT) 서열이 없는 것을 기반으로 NHEJ 대립유전자를 식별합니다. 이 분석에서, Cas/gRNA 계열 시스템의 예측컷 부위를 포함하는 짧은 앰플리시온이 특정 프라이머 쌍으로 증폭된다. 하나의 형광 프로브는 앰플리콘의 보존 된 영역에 결합하도록 설계되고 다른 형광 프로브는 절단 부위의 WT 서열을 인식합니다. NHEJ 본선이 있을 때 후자는 앰플리턴에 결합하지 않습니다.
ddPCR의 사용은 모기 인구 분석9에서NHEJ 프로파일링을 허용하는 삭제, 단일 염자 쌍 차이 및 삽입을 대상으로 프라이머를 설계할 수 있는 기능을 제공한다. 이러한 매력적인 특징을 감안할 때, 우리는 모기에 있는 Cas/gRNA 기지를 둔 유전자 드라이브 시스템에서 생성된 indels의 높은 처리량 검출을 위한 ddPCR를 위한 프로토콜을 만들었습니다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>DNA 추출 시약(예: Wizard Genomic DNA Purification kit)</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올(ACS 인증)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A416-500</td><td></td></tr><tr><td>핵 용해 용액(NLS) (마법사 게놈 DNA 정제 키트)</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>PCR 등급 물</td><td></td><td></td><td>인증된 PCR 등급 물을 사용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td>단백질 침전 용액(마법사 게놈 DNA 정제 키트)</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>ProteinAse K 20 mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-웰 플레이트</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>액적 발생기 DG8 카트리지 및 개스킷</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>액적 생성 프로브용 오일</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>형광등 프로브(예: FAM/HEX 프로브)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N/A</td><td>프로브는 실험에 특화되어 있으며 인증 판매자로부터 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>순방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N/A</td><td>프라이머는 실험에 특화되어 있으며 인증 판매자로부터 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td>Gradient 기능과 deep well이 있는 다른 Thermo cycler를 사용할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

유전자 변형 된 anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 pcr

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

최근 모기 유전체학 및 유전 공학 기술의 발전은 표적 DNA 서열 변이를 대규모로 검출하기 위한 빠르고 효율적인 방법의 필요성을 조성했습니다. 구체적으로, CRISPR 가이드 RNA(gRNA)/Cas9 매개 비균성 최종 결합(NHEJ)에 의해 생성된 유전자 편집 부위에서 삽입 및 삭제(indels)를 검출하는 것은 돌연변이 발생의 충실도 및 의도하지 않은 변화의 빈도를 평가하는 데 중요하다. 우리는 여기에 높은 처리량 NHEJ 분석에 적합한 디지털 물방울 PCR (ddPCR)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 메서드는 개별 서열 변동을 식별하는 데이터를 생성하지 는 않지만 모집단 내의 시퀀스 변동에 대한 정량적 추정을 제공합니다. 또한 적절한 리소스를 통해 이 프로토콜은 차세대 또는 Sanger 시퀀싱보다 더 쉽게 현장 실험실 설정에서 구현할 수 있습니다. ddPCR은 또한 유전 으로 조작 된 유기체의 현장 시험 동안 야생 인구의 유전 적 변이에 대한 보다 빠르고 완전한 분석을 허용하는 그 방법 중 하나보다 결과에 대한 빠른 회전 시간을 가지고 있습니다.

이 절차의 적용은 카르발라 르자라수 외9에나타납니다. ddPCR 드롭오프 분석서는 WT 및 인델 서열을 분별하기 위해 2개의 형광 프로브를 활용합니다: FAM 프로브는 앰플리콘 내의 보존된 서열에 결합하는 반면, HEX 프로브는 표적 부위의 WT 서열(그림4A)을대상으로 합니다. 인델이 있으면 HEX 프로브가 바인딩되지 않습니다. 대표적인 결과는 도 2,표 1, 및 카발라-레자라수 외 9의 표 2에서 찾을 수있다. 이 프로토콜을 사용하여 ddPCR은 다양한 CRISPR-Cas9 유도 NHEJ 이벤트를 감지하고 개별 또는 풀로 풀로 된 샘플에서 NHEJ 주파수를 정량화하는 것으로 입증되었습니다. 10마리의 모기의 15가지 풀이 있는 샘플에는 각각 다양한 NHEJ 대립구도가 포함되어 있습니다(카발라-레자라수 외9의표 2). 이들은 여기에 제시된 프로토콜 및 매개변수를 사용하여 ddPCR로 분석되었다. 표 19의 결과는 모든 15개의 견본이 드롭오프 분석서에 의해 확인된 100% 인델 대립을 운반했다는 것을 보여줍니다(그림 4B). 또 다른 실험에서는, WT 모기와 NHEJ 모기의 11개의 풀화된 견본은 다른 NHEJ 백분율 (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100%)로 이 ddPCR 프로토콜로 검토되었다, 및결과(그림 2; 카르발라-레자라수 외9)확인된 백분율은 앰플리콘 분석에 의한 인델 검출의 비교 기술에 가깝다는 것을보여주었다(도 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig01.jpg"> 그림 1: 실험 설정 및 절차. (A)물방울 생성을 위한 카트리지 준비. (상단) 샘플은 카트리지의 중간 줄에 채워지며 오일은 아래 줄로 채워져 있습니다. (아래쪽) 물방울 생성 후 유화 된 물방울로 채워진 상단 행. (B)샘플로 채워진 카트리지가 있는 물방울 발생기와 개스킷으로 덮여 있습니다. (C)열 사이클러에서 호일 씰로 덮인 96웰 플레이트. (D)96-잘 플레이트가 있는 드롭렛 리더는 금속 덮개를 접시 위에 고정하여 고정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig02.jpg"> 그림 2: 물방울 읽기. (A)액적 판독을 위한 소프트웨어 인터페이스. 주황색 상자는 샘플이 있는 우물을 보여줍니다. 회색 상자는 비어 있습니다. 실험 매개 변수는 도구 편집 패널(오른쪽)에 설정됩니다. 각 샘플은 각 샘플 상자를 클릭하여 편집할 수 있습니다. 실험 유형에 대한 드롭 오프(DOF)를 선택합니다. 샘플 정보에서 샘플의 이름 및 유형과슈퍼믹스에 대한 적절한 정보를 입력합니다. 분석 정보에 대한 기본 드롭오프를 선택합니다. WT 샘플의 경우 대상 이름에대한 WT, 대상 유형에대한 참조, 신호 Ch1 및 Ch2에대해 FAM및 HEX를 각각 선택합니다. NHEJ 샘플의 경우 대상 이름에적합한 이름을 입력하고 대상 유형에대해 알 수 없음을 선택하고 신호 Ch1에대한 FAM을 선택합니다. 신호 Ch2를 없음으로 남겨주세요. (B)여러 샘플에 대한 물방울 카운트 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig03.jpg"> 그림 3: 드롭 오프 분석. (A)WT 및 NHEJ 본선의 액적 수에 대한 클러스터 2D 플롯. 2D 진폭 탭에서는 모든 방울이 기본적으로 분류되지 않습니다. 이 그림에서는 구별을 위해 색상이 수동으로 할당됩니다. 주황색 점 클러스터는 참조 서열 및 대상 사이트 시퀀스에서 FAM 및 HEX 프로브의 결합에 의해 얻어진 WT 알레일 수입니다. 파란색 점은 참조 시퀀스에 FAM 바인딩이 있지만 대상 사이트 시퀀스에서 HEX 바인딩이 없는 물방울의 점수를 나타냅니다(따라서 HEX의 드롭오프). 회색 점은 FAM 또는 HEX 바인딩이 없는 빈 물방울입니다. (B)NHEJ 이벤트의 비율/풍부 그래프. 비율 탭에서 NHEJ 이벤트의 특파원 백분율이 있는 그래프의 분수 풍부를 선택합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig04.jpg"> 그림 4: 형질형 Anopheles stephensi 라인, AsMCRkh1에서 비 동균 최종 결합 식별 및 정량화를 위한 ddPCR을 가진 드롭 오프 분석의 응용. (A)이중 프로브 시스템을 가진 표적 DNA 부위에서 돌연변이를 검출하기 위해 ddPCR 드롭 오프 분석의 회로도 프리젠 테이션. 150-400 bp의 앰프온은 전방 및 역 프라이머로 증폭됩니다. FAM 레이블 프로브는 앰플리콘의 보존 된 서열에 바인딩하도록 설계되었으며 HEX 레이블프로브는 WT gRNA 표적 부위에 바인딩하도록 설계되었습니다. (B)ddPCR을 가진 다양한 유형의 인델검출. 삽입, 삭제 및 대체를 포함한 다양한 유형의 인델을 포함하는 10개의 AsMCRkh1 모기의 15개의 풀은 ddPCR 드롭오프 분석으로 분석되었다. 돌연변이 및 서열의 세부 사항은 카르발라 등의표 2 및 표 S3에서 찾을 수 있습니다. 9.(C)다양한 비율로 AsMCRkh1 및 WT 모기의 혼합 샘플에서 NHEJ의 정량화 (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, 0:10) ddPCR및9.10을 사용하여 검출 기술의 비교 . 카르발라 르자라수 외 에서적응 된 이미지 . 68 (4):172-179 (2020)9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>프라이머/프로브</td>
			<td>시퀀스 (5' » 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR 포워드 프라이머</td>
			<td>ATGATCAAATGTCGACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR 역 프라이머</td>
			<td>아크그박트가카</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR HEX 프로브 (BHQ1)</td>
			<td>[헥스]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR FAM 프로브 (BHQ1)</td>
			<td>[6FAM]-CCACGTGGATCGAAGG-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HEX: 헥사클로로 플루오레세인, FAM: 6-카복시플루오레스세인, BHQ: 블랙홀 퀘이서</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 프라이머 및 프로브 의 시퀀스.

이 프로토콜은 gRNA 유도 Cas9 분열 및 DNA 수리 에 따른 표적 부위에서 비균성 최종 결합(NHEJ) 이벤트의 식별 및 정량화를 위한 분석을 포함하여 디지털 물방울 PCR(ddPCR)에 대한 실험용 설정에 DNA 추출에서 단계를 제공합니다. 이 방법의 그밖 용도는 다형성 검출 및 유전자 편집 이체 확인과 같은 응용을 포함합니다.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

이 프로토콜은 유전자 편집 모기 집단에서 Indel 돌연변이의 보급 그리고 상대적인 양을 결정할 수 있는 NHEJ 분석을 위한 높은 처리량 및 믿을 수 있는 메이크업을 제공합니다. 차세대 또는 Sanger 시퀀싱에 비해 ddPCR은 유전자 변형 생물을 위한 유전자 변이의 신속하고 완전한 분석을 허용하는 결과에 대한 빠른 처리 시간을 가지고 있습니다. 이 방법은 일반적으로 모든 실험 시스템에 적용해야 합니다.절차를 시연하는 것은 양 연구실의 직원 연구 동료인 타이 팜(Thai Pham)이 될 것입니다. 우선, ddPCR 슈퍼 믹스, 전방 및 역 프라이머, HEX 또는 FAM 프로브, DNA 및 물을 텍스트에 기재된 비율로 추가하여 디지털 액적 PCR 또는 ddPCR 샘플 믹스의 25 마이크로리터를 준비한다. 그런 다음 소용돌이에 의해 반응을 철저히 혼합합니다.50 마이크로리터 멀티채널 파이펫을 사용하여 ddPCR 샘플 믹스의 20마이크로리터를 카트리지의 중간 행에 로드합니다. 그런 다음 200 마이크로리터 멀티채널 파이펫을 사용하여 파이펫 전체에 버블을 생성하지 않고 70마이크로리터의 오일을 하단 행에 로드합니다. 개스킷을 놓고 가장자리만 만지고 중앙, 컨캐빙 된 영역을 피한 다음 플레이트를 물방울 발생기에 단단히 놓고 덮개를 닫아 실행을 시작합니다.카트리지의 상단 행에서 96웰 플레이트로 침수 믹스를 전송하려면 멀티채널 파이펫을 사용하고 40 마이크로리터의 액체 샘플을 30~45도 각도로 3~5초 간 떨어뜨립니다. 그런 다음 45도 각도로 3초 이상 천천히 우물안으로 혼합물을 배출하여 측면에서 떨어뜨린 다음 파이펫의 두 번째 정류장으로 이동하여 액체를 완전히 추방합니다. 호일 열 씰을 사용하여 180°C에서 5초 동안 플레이트를 밀봉합니다.밀봉된 플레이트를 열순환기에 넣고 초기 소동을 섭씨 95도에서 10분 동안 설정하여 NHEJ 드롭 오프 가이드라인에 대한 PCR 조건을 설정합니다. 그런 다음 40°C의 섭씨 94도를 30초 간 설정하고, 1분에서 음막까지 섭씨 55도, 섭씨 60도를 2분간 연장합니다. 40사이클 후, 섭씨 98도에서 10분간, 마지막 홀드는 섭씨 4도에서 유지됩니다.모든 단계에 대해 초당 섭씨 2도의 경사로 를 사용합니다. 어닐링 온도는 사용되는 프로브 또는 프라이머에 따라 달라집니다. 왼쪽 상단에 잘 표시된 A1이 있는 드롭렛 판독기에 플레이트를 단단히 배치합니다.프로그램을 열고 FAM을 알려진 참조 채널로 지정하고 HEX를 각 웰에 대해 알 수 없는 채널로 지정하여 플레이트를 설정합니다. 그런 다음 각 샘플의 이름을 변경합니다. 템플릿을 저장하는 동안 액적 읽기 실험을 직접 정량화로 실행합니다.소프트웨어 분석, 즉 샘플 정보, 슈퍼 믹스, 대상 이름, 대상 유형, 신호 채널 1 및 채널 2에 대한 올바른 실험 매개 변수를 지정합니다. 그런 다음 신뢰할 수 있는 결과를 위해 물방울 수에 대한 임계값을 10, 000 이상으로 설정합니다. 다음으로, 물방울 탭의 각 우물에 대한 물방울 수를 확인하여 모든 것이 10, 000 이상이되도록 합니다.마지막으로 1D 진폭을 확인하여 네거티브로부터의 효율적인 신호 분리를 확인하십시오. 플레이트 편집기에서 전체 플레이트를 강조 표시하고 실험 유형을 드롭오프하도록 설정합니다. WT 대상을 참조로 설정하고 FAM용 채널 1을 지정하고 HEX용 채널 2를 지정합니다.NHEJ 대상을 알 수 없는 것으로 설정하여 FAM용 채널 1과 채널 2를 없음으로 지정합니다. 2D 진폭 탭에서 각 샘플에 대한 그래프 도구로 클러스터 임계값을 설정합니다. 꼬리는 일반적으로 NHEJ 에세이에 대한 WT 클러스터와 연관됩니다.비율 탭에서 그래프 오른쪽 상단의 기어 아이콘을 클릭하고 분수 풍부를 선택하여 NHEJ 이벤트의 백분율에 해당하는 점을 플롯합니다. 15개의 모기의 15개의 상이한 뽑아낸 견본은 각각 각종 NHEJ 대립구도를 포함하고, 분석되고 드롭오프 분석해서 확인되고, 결과는 15개의 견본이 모두 100% Indel 대립을 운반했다는 것을 보여주었습니다. 또 다른 실험에서는, 11다른 NHEJ 백분율을 가진 야생 모형 모기와 NHEJ 모기의 11개의 뽑아낸 견본이 ddPCR 프로토콜로 검토되었습니다.그 결과 확인된 백분율이 앰플리카 분석 기술에 의한 인델 검출에 비교적 가깝다는 것을 보여주었다. 피펫은 천천히 거품을 피하고 유화 된 모든 물방울이 우물의 벽을 떨어 뜨릴 수 있도록합니다.

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