포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리

이 프로토콜은 내세포 인신 매매를 통해 단백질 인신 매매의 조사를 용이하게하기 위해 트랜스 감염 된 포유류 세포에서 분수를 포함하는 재활용 내세포를 격리하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 처리가 용이하고 조직 과 세포 샘플 모두에 적용 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 박사 라오스 연구소의 박사 과정 학생인 Zhai Yu Qi 미스가 될 것입니다.

시작하려면, 100밀리미터 배양 접시에 6 세포에 2 회 10 배. 다음 날, 제조 업체의 지침에 따라 리포펙 타민으로 세포를 변형. 세포를 수확하려면 배양 배지를 48시간 후 배설하고 얼음 차가운 PBS로 세포를 두 번 세척한다.

그런 다음 0.5X 프로테아제 억제제 칵테일로 보충된 얼음 차가운 PBS 1밀리리터를 각 요리에 0.5X 포스파타제 억제제 칵테일을 넣습니다. 다음으로, 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수집하고 세포 현탁액을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기는다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 원심분리에 의한 세포.

상체를 버리고 균질화 버퍼의 5 밀리리터에서 셀 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. 원심분리에 의해 세포를 다시 수집하고 균질화 완충제의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 분리한다. 15~20개의 스트로크를 사용하여 두스균질화로 세포를 균질화한다.

그런 다음 호모고네이트를 2밀리리터 원심분리 튜브로 옮긴다. 동종화 버퍼 700마이크로리터를 균질화 버퍼에 추가합니다. 그런 다음 희석 된 균형 고네이트를 회전하고 상체의 1.5 밀리리터를 수집합니다.

수집된 상체를 다시 돌린 다음, 1.4 밀리리터의 상체를 수집하고 핵 후 초월제로 분류합니다. 밀도 그라데이션 컬럼을 준비하려면 핵 후 상주체의 1.2 밀리리터를 초원심분리기 튜브로 이송합니다. 그런 다음 62% 자당 용액1밀리리터를 샘플에 넣고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞습니다.

다음으로, 35%의 자당 용액을 3.3밀리리터를 샘플 위에 넣고, 35% 자당 용액 위에 25%의 자당 용액을 2.2밀리리터를 추가합니다. 마지막으로, 균질화 버퍼로 상단에 초원심분리기 튜브를 채웁니다. 밀도 그라데이션 컬럼을 원심분리하고 그라데이션 상단에서 시작하여 각각 1밀리리터의 12분수를 신중하게 수집합니다.

다음으로 희석 버퍼 1밀리리터로 모든 분획을 희석하고 희석된 시료원심분리기를 희석합니다. 원심 분리 후, 상류체를 흡인하고 1X 샘플 버퍼의 50 마이크로리터를 추가하여 분수를 수확합니다. 재활용 내성 마커 Rab11은 분수 7에서 검출되었다.

베타 COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 및 Lamp1을 포함한 다른 세포 전형 마커도 조사되었다. 포지티브 EEA1 신호도 분수 7에서 검출되었다. GAPDH, 콕스 IV, Rab11의 측정 된 밴드 강도는 분수 7 과 핵 후 슈퍼 네티엄 모두 여기에 표시됩니다.

ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L 또는 ELMO1 ARF6Q67L FE65로 HEC293 세포를 과다 한 후 ARF6Q67L 및 FE65 과발현을 통해 ELMO1 분포에서 변화가 발견되지 않았습니다. 분수 7의 ELMO1 수준은 다른 형질전환 과 비교되었고 ARF6Q67L의 회합 후 상승된 것으로 나타났습니다. ARF6Q67L과 FE65가 모두 공동 발현되었을 때 추가 적인 증가가 관찰되었습니다.

반대로, FE65를 쓰러뜨리면 ARF6가 분수 7에서 Elmo1 농축을 중재했습니다. 얻은 분수는 후속 분석에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 분획의 단백질 수준 변화를 시각화하기 위해 서양 블로팅.