Name: 포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 밀도 그라데이션 초원심 분리를 이용하여 내구 재활용 소포를 분리하는 방법을. 이 기술은 단백질 운반 메커니즘 연구에 필수적인 세포생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 연구 보조금 위원회 홍콩, CUHK 직접 보조금 제도, 유나이티드 대학 인다우먼트 기금 및 TUYF 자선 신탁의 기금으로 지원되었습니다. 이 작품의 수치는 2020년 10월 FASEB 저널에 발표된 "ARF6-Rac1 시그널링 매개 중계 중성염 아웃성장이 2020년 10월 FASEB 저널에 발표된 ARF6 6 및 ELMO1을 통해 뉴런 어댑터 FE65에 의해 전능적이다"라는 이전 간행물에서 채택되었습니다.

1. 포유류 세포 배양 및 형질
<ol><li>100mm 배양 접시에 2 x 106 셀을 접시. 각 트랜스페션에 4가지 요리를 사용하십시오. 참고: 필요한 세포 수는 셀주에 따라 다를 수 있습니다. 격리 단계로 진행하기 전에 최적화가 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>다음 날, 제조 업체의 지침에 따라 리포펙 타민으로 세포를 변형.</li>
</ol>2. 세포 수확
<ol><li>배양 배지 48h 후 형질 전환을 폐기하십시오.</li>
	<li>얼음처럼 차가운 PBS(10mM 나트륨 인산염, 염화 2.68m, 염화 나트륨 140m)로 세포를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>각 접시에 1mL의 얼음 차가운 PBS+ (0.5 배 프로테아제 억제제 칵테일과 0.5 배 인산 억제제 칵테일로 보충된 PBS)를 추가하십시오.</li>
	<li>세포 스크레이퍼로 세포를 수집하고 세포 현탁액을 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.</li>
	<li>5 분 동안 400 x g에서 스윙 버킷 로터를 사용하여 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.</li>
	<li>상체를 버리고 5mL의 균질화 완충제(HB; 250m 자당, pH 7.4에서 3mM 이미다졸, 1mM EDTA0.03m 사이클로헥시미드, 1x 프로테아제 억제제 칵테일, 1x 포세파테스 억제제)로 부드럽게 세포 펠릿을 회수한다.</li>
	<li>10 분 동안 1,300 x g에서 원심 분리로 세포를 수집합니다.</li>
	<li>HB의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>15-20 스트로크용 두스 균질화로 세포를 균질화합니다. 참고: 다른 균질화 방법, 예를 들어, 주사기를 통해 샘플을 전달, 사용될 수있다. 균질화 효율은 위상 대비 현미경하에서 균주전을 관찰함으로써 드러나게 될 수 있다.</li>
	<li>2mL 원심분리 튜브로 균동화를 전달합니다. 참고: 5배 샘플 버퍼의 12.5 μL을 사용하여 50 μL의 동종을 수확하고 총 lysate로 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>동종모네이트에 0.7mL의 HB를 추가합니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 희석된 균질을 2,000 x g에서 10분 동안 회전합니다. 참고: 펠릿에는 핵과 깨지지 않은 세포가 포함되어 있습니다.</li>
	<li>상체 1.5mL을 수집하고 한 번 2.12 단계를 반복하십시오.</li>
	<li>상체 1.4mL을 수집하고 핵 후 수퍼나티(PNS)로 레이블을 지정합니다.</li>
</ol>3. 밀도 그라데이션 열 준비
<ol><li>PNS1.2mL을 초원심분리기 튜브로 옮기다.</li>
	<li>62% 자당 용액(2.351M 자당, pH 7.4m imidazole 3m)의 1mL을 샘플에 넣고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞는다. 참고: 결과 솔루션은 40.6% 자당 솔루션입니다.</li>
	<li>3.3mL의 자당 용액(1.177M 자당, pH 7.4m imidazole 3m)을 시료 위에 조심스럽게 넣습니다.</li>
	<li>2.2mL의 25% 자당 용액(0.806M 자당, pH 7.4m imidazole 3m)을 35% 자당 용액 위에 조심스럽게 넣습니다. 참고: 실온에서 62%, 40.6%, 35%, 25%의 굴절률은 각각 1.44, 1.40, 1.39, 1.37입니다. 자당 솔루션의 굴절 인덱스는 실험의 정밀도와 일관성을 보장하기 위해 회부계로 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>HB로 초원심분리튜브를 채웁니다. 참고: 준비된 밀도 그라데이션 컬럼을 4°C에 임시로 저장합니다.</li>
</ol>4. 재활용 내분 함유 분획의 분획 및 회수
<ol><li>4°C에서 3h에 대해 210,000 x g의 컬럼을 원심분리합니다.</li>
	<li>그라데이션 의 상단에서 시작하여 12분획(각 1mL)을 신중하게 수집합니다. 참고: 재활용 내분은 35%에서 25% 자당 솔루션 사이의 인터페이스에서 찾아야 합니다. 수집된 분획은 액체 질소에서 스냅 동결및 -80°C에 저장될 수 있다.</li>
	<li>희석 버퍼 1mL(pH 7.4, 1mM EDTA에서 3mM imidazole)로 모든 분획을 희석하십시오.</li>
	<li>4°C에서 1h에 대해 100,000 x g의 희석된 시료원심분리기.</li>
	<li>수퍼네티를 흡인하고 1x 샘플 버퍼의 50 μL을 추가하여 분수를 수확합니다.</li>
	<li>서양 블로팅에 의해 분획의 단백질 함량을 분석합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+pathways+and+endosomal+trafficking%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiener+Medizinische+Wochenschrift%22%5BJournal%5D)">Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer.</a> Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).</li>
<li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+unplugged%3A+multiple+ways+to+enter+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).</li>
<li>Naslavsky, N., Caplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+endosome+-+sorting+the+ins+and+outs+of+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking.</a> Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).</li>
<li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+degrade+or+not+to+degrade%3A+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).</li>
<li>Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognising+the+signals+for+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognising the signals for endosomal trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).</li>
<li>Khan, I., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%3A+a+pivotal+pathway+for+regulating+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis.</a> British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).</li>
<li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li>
<li>Maxfield, F. R., McGraw, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).</li>
<li>McDonald, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosion+in+the+complexity+of+membrane+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Explosion in the complexity of membrane protein recycling.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).</li>
<li>O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Recycling+pathway-at+the+crossroads+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074(2020).</li>
<li>D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+ARF6+in+receptor-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis.</a> Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).</li>
<li>Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endocytic+recycling+impacts+cell+movement%2C+cell+division+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).</li>
<li>Finicle, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+inhibit+endosomal+recycling+of+nutrient+transporters+by+inactivating+ARF6%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6.</a> Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APE1+upregulates+MMP-14+via+redox-sensitive+ARF6-mediated+recycling+to+promote+cell+invasion+of+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).</li>
<li>Qi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf6-driven+endocytic+recycling+of+CD147+determines+HCC+malignant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471(2019).</li>
<li>Crupi, M. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GGA3-mediated+recycling+of+the+RET+receptor+tyrosine+kinase+contributes+to+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion.</a> Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).</li>
<li>Gamara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Arf6+deletion+in+PLB-985+differentiated+in+neutrophil-like+cells+and+in+mouse+neutrophils%3A+impact+on+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 2713074(2020).</li>
<li>Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DOCK180%2FElmo+complex+couples+ARNO-mediated+Arf6+activation+to+the+downstream+activation+of+Rac1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1.</a> Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).</li>
<li>Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWibo%2C+M+%22Eukaryotic+Cell+Function+and+Growth%3A+Regulation+by+Intracellular+Cyclic+Nucleotides%22">Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides</a>. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).</li>
<li>Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Rab11 proteins in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-Rac1+signaling-mediated+neurite+outgrowth+is+potentiated+by+the+neuronal+adaptor+FE65+through+orchestrating+ARF6+and+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).</li>
<li>Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+proteomics%3A+implications+for+subcellular+fractionation+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics.</a> Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).</li>
<li>Fleischer, S., Kervina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+of+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation of rat liver.</a> Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).</li>
<li>Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+and+lysosome+purification+by+free-flow+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis.</a> Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).</li>
<li>Stasyk, T., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zooming+in%3A+fractionation+strategies+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Zooming in: fractionation strategies in proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).</li>
<li>Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+collection+of+nanoscopic+vesicles+from+an+organotypic+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model.</a> RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).</li>
<li>Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+endosome+membrane+dynamics+characterized+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry.</a> Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).</li>
<li>Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+specialized%2C+antigen-loaded+early+endosomal+subpopulation+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).</li>
<li>Thapa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+signaling+is+spatially+organized+at+endosomal+compartments+by+microtubule-associated+protein+4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).</li>
<li>Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuimaraes+de+Araujo%2C+ME+%22Endocytic+Organelles%3A+Methods+For+Preparation+And+Analysis.+In+eLS%22">Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).</li>
<li>Rickwood, D., Graham, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRickwood%2C+D+%22Centrifugation+Techniques%22">Centrifugation Techniques</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+early+and+late+endosomes+by+latex+bead+internalization+and+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).</li>
<li>Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+APPL+endosomes%3A+the+role+of+annexin+A2+in+APPL+membrane+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment.</a> Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).</li>
</ol>

저자는 이 문서의 내용과 이해상충이 없다고 선언합니다.

위의 프로토콜은 초원심분리에 의한 배양된 세포로부터의 재활용 내모를 분리하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 방법의 신뢰성은 최신간행물(22)에의해 입증되었으며, 재활용 내성들이 골기 장치 및 미토콘드리아와 같은 다른 세포기관으로부터 성공적으로 분리되었음을 입증하였다(그림1). 좋은 분리 결과를 얻기 위해 몇 가지 중요한 단계는주의를 기울여야합니다. 자당 솔루션을 준비하는 동안, 리프라도미터를 사용하여 솔루션의 굴절률을 검증하는 것이 좋습니다. 실온에서 62%, 35%, 자당 25%의 굴절률은 각각 1.44, 1.39, 1.37입니다. 또한, 기포는 그라데이션에서 피해야한다. 열에 거품이 있으면 그라데이션의 연속성을 방해할 수 있습니다. 그들은 세포기관의 막을 손상하기 때문에 세제는 균질화 과정에서 피해야한다. 이것은 막 단단 세포기관에서 단백질의 방출로 이끌어 내고 가혹한 오염귀착될 수 있었습니다. 또한, 모든 균질화 도구는 균질화...

내피 인신 매매는 다양한 생물학적 사건1,예를 들어 신호 수용체, 이온 채널 및 접착 분자의 운송을 연루시키는 필수적인 생리학적 과정입니다. 플라즈마 멤브레인에서 국소화된 단백질은 내분비2에 의해 내면화된다. 내부화된 단백질은 초기 내분3에의해 정렬됩니다. 단백질 중 일부는 분해4용리소좀을 대상으로 한다. 그러나, 단백질의 상당수는 빠른 재활용 및 느린 재활용 프로세스에 의해 세포 표면으로 다시 재활용됩니다. 빠른 재활용에서 단백질은 초기 내분모를 떠나 플라즈마 막으로 직접 돌아갑니다. 반대로, 느린 재활용에서 단백질은 먼저 내막 재활용 구획으로 분류된 다음 다시 플라즈마 멤브레인으로 운반됩니다. 다양한 화물 단백질은 예를 들어, 클래트린, 레트로머 복합체, 리트리버 복합체 및 Wiskott-Aldrich 증후군 단백질 및 SCAR 호모글로그(WASH) 복합체, 이러한 멤브레인 재활용공정4,5,6,7,8,9에참여한다. 내분비및 재활용 이벤트의 균형은 세포 생존에 매우 중요하며, 예를 들어 세포 접착, 세포 이동, 세포 극성 및 신호 변환과 같은 다양한 세포이벤트(10)에기여합니다.
ARF6, 작은 GTPase, 내피 인신 매매의 보고 된 레귤레이터7,11,12. 관심있는, 다양한 연구 그룹은 내용 재활용13,14,15,16,17에서ARF6의중요성을설명했다. 이 연구는 ARF6 매개 중성염 아웃성장과 내세포 재활용 사이의 관계를 조사하는 것을 목표로합니다. 이전 보고서는 ARF6의 활성화가 사이토카네시스 1 (DOCK180) 복합18의ELMO1-헌납기에 작용하여 Rac1 활동에 상류되는 것을 시사한다. 그러나 ARF6가 ELMO1-DOCK180 중재 된 Rac1 신호를 어떻게 유발하는지는 불분명합니다. 밀도 그라데이션 초원심분리는 이러한 과정에서 ARF6 매개 내막 재활용의 역할을 조사하기 위해 사용되었다. 이를 이용하여, 재활용 내성 함유 분획은세포용액(19)으로부터수득하였다. 분획은 단백질 함량 분석을 위한 서양 블로팅을 실시하였다. 면역블롯 결과는 FE65, 뇌가 풍부한 어댑터 단백질의 존재 하에서 활성 ARF6가 실질적으로 내모성 함유 분획을 재활용하는 ELMO1의 수준을 증가시켰다는 것을 밝혔습니다. 다음 프로토콜은 포유류 세포를 (1) 횡단하는 절차에 대한 절차를 포함한다; (2) 샘플 및 밀도 그라데이션 컬럼을 준비; 및 (3) 재활용 내분 함유 분획을 획득한다.

<table><tbody><tr><td>1mL, 개방형 후벽 폴리프로필렌 튜브, 11 x 34mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>100mm 조직 배양 접시</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13.2mL, 인증된 무료 개방형 Thinwall Ultra-Clear 튜브, 14 x 89mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x 시료 완충액</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) Rabbit mAb</td><td>세포 신호 기술</td><td>4850S</td><td>COX IV 검출을 위한 토끼 단클론 항체.</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 조직 분쇄기, 7 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr>저혈당 <td>HyClone</td><td>SH30021.01</td><td></td>ELMO1 항체 (B-7)를<td>가진 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM)</td></tr> Santa <tr><td></td><td>Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>ELMO1 검출을 위한 마우스 단클론 항체.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 항체 (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>FE65 검출용 염소 다클론 항체.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 연구 등급</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 단클론 항체 (6C5)</td><td>GAPDH</td> 검출을 위한 Ambion <td>AM4300</td><td>마우스 단클론 항체.</td></tr><tr><td>ImageLab 소프트웨어</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>밴드 강도 측정</td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&beta;-COP 항체</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>Mouse monoclonal antibody for detecting &beta;-COP.</td></tr><tr><td>Myc-tag (9B11) 마우스 mAb</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>2276S</td><td>myc 태그 단백질을 검출하기 위한 마우스 단클론 항체.</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA, 디소듐 솔트, 디하이드레이트</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 감소 혈청 미디어</td><td>Gibco 31985070</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>RAB11A 특이적 다클론 항체</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>Rab11 검출을 위한 토끼 다클론 항체.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti 스윙 버킷 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 고정각 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

내적 인신 매매는 광범위한 생물학적 사건을 규제하는 필수적인 세포 과정입니다. 단백질은 플라즈마 막에서 내면화된 다음 초기 내분으로 운반됩니다. 내부화된 단백질은 분해를 위해 리소솜으로 이동하거나 플라즈마 멤브레인으로 다시 재활용될 수 있습니다. 강력한 내세포 재활용 경로는 내분비증에서 멤브레인 물질의 제거의 균형을 위해 필요합니다. 다양한 단백질은 ADP-리보실화 인자 6(ARF6)을 포함하는 통로를 조절하는 것으로 보고된다. 밀도 그라데이션 초원심분리는 세포 분획을 위한 고전적인 방법입니다. 원심분리 후, 세포기관은 이소피닉 표면에 퇴적됩니다. 분수는 다른 다운스트림 응용 프로그램에 수집되고 사용됩니다. 여기에 기재된 프로토콜은 밀도 그라데이션 초원심분리를 사용하여 전감염된 포유류 세포로부터 내분 함유 분획을 재활용하는 프로토콜이다. 격리된 분획은 단백질 함량을 분석하기 위한 표준 서양 블로팅을 실시하였다. 이 방법을 채택함으로써, 우리는 ras 관련 C3 보툴리눔 독소 기판 1 (Rac1) 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자인 삼장 막표적이 ARF6 매개 내분비성 재활용을 통해 확인하였다.

밀도 그라데이션 극심분리에 의해 비감염된 HEK293 세포를 분수한 후, 그라데이션의 상단에서 시작하여 12개의 분획이 수집되었다. 수확된 분획은 희석 버퍼로 희석하여 1:1 비율로 희석하고 두 번째 원심분리를 실시하였다. 견본은 그 때 그들의 단백질 내용물 분석을 위한 서쪽 얼룩을 복종했습니다. 도 1에도시된 바와 같이, 재활용 내성 마커 Rab11은 분수 720에서검출된다. β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 및 Lamp1을 포함한 다른 세포 전세포 마커도 조사되었습니다. 양수 EEA1 신호도 분수 7에서도 검출됩니다. GAPDH, COX IV 및 Rab11의 밴드 강도는 분수 7과 PNS 모두에서 ImageLab 소프트웨어(Bio-Rad)로 측정되었습니다. 7에서 PNS로 마커의 강도 비율이 계산되고 SD± 바 차트로 표현되었다.
이전 연구는 ARF6및 E...

이 논문은 자당 밀도 그라데이션 초원심 분리를 사용하여 포유류 세포에서 종양을 재활용하는 것을 준비하기위한 프로토콜을 제시하는 것을 목표로합니다.

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

이 프로토콜은 내세포 인신 매매를 통해 단백질 인신 매매의 조사를 용이하게하기 위해 트랜스 감염 된 포유류 세포에서 분수를 포함하는 재활용 내세포를 격리하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 처리가 용이하고 조직 과 세포 샘플 모두에 적용 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 박사 라오스 연구소의 박사 과정 학생인 Zhai Yu Qi 미스가 될 것입니다.시작하려면, 100밀리미터 배양 접시에 6 세포에 2 회 10 배. 다음 날, 제조 업체의 지침에 따라 리포펙 타민으로 세포를 변형. 세포를 수확하려면 배양 배지를 48시간 후 배설하고 얼음 차가운 PBS로 세포를 두 번 세척한다.그런 다음 0.5X 프로테아제 억제제 칵테일로 보충된 얼음 차가운 PBS 1밀리리터를 각 요리에 0.5X 포스파타제 억제제 칵테일을 넣습니다. 다음으로, 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수집하고 세포 현탁액을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기는다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 원심분리에 의한 세포.상체를 버리고 균질화 버퍼의 5 밀리리터에서 셀 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. 원심분리에 의해 세포를 다시 수집하고 균질화 완충제의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 분리한다. 15~20개의 스트로크를 사용하여 두스균질화로 세포를 균질화한다.그런 다음 호모고네이트를 2밀리리터 원심분리 튜브로 옮긴다. 동종화 버퍼 700마이크로리터를 균질화 버퍼에 추가합니다. 그런 다음 희석 된 균형 고네이트를 회전하고 상체의 1.5 밀리리터를 수집합니다.수집된 상체를 다시 돌린 다음, 1.4 밀리리터의 상체를 수집하고 핵 후 초월제로 분류합니다. 밀도 그라데이션 컬럼을 준비하려면 핵 후 상주체의 1.2 밀리리터를 초원심분리기 튜브로 이송합니다. 그런 다음 62% 자당 용액1밀리리터를 샘플에 넣고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞습니다.다음으로, 35%의 자당 용액을 3.3밀리리터를 샘플 위에 넣고, 35% 자당 용액 위에 25%의 자당 용액을 2.2밀리리터를 추가합니다. 마지막으로, 균질화 버퍼로 상단에 초원심분리기 튜브를 채웁니다. 밀도 그라데이션 컬럼을 원심분리하고 그라데이션 상단에서 시작하여 각각 1밀리리터의 12분수를 신중하게 수집합니다.다음으로 희석 버퍼 1밀리리터로 모든 분획을 희석하고 희석된 시료원심분리기를 희석합니다. 원심 분리 후, 상류체를 흡인하고 1X 샘플 버퍼의 50 마이크로리터를 추가하여 분수를 수확합니다. 재활용 내성 마커 Rab11은 분수 7에서 검출되었다.베타 COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 및 Lamp1을 포함한 다른 세포 전형 마커도 조사되었다. 포지티브 EEA1 신호도 분수 7에서 검출되었다. GAPDH, 콕스 IV, Rab11의 측정 된 밴드 강도는 분수 7 과 핵 후 슈퍼 네티엄 모두 여기에 표시됩니다.ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L 또는 ELMO1 ARF6Q67L FE65로 HEC293 세포를 과다 한 후 ARF6Q67L 및 FE65 과발현을 통해 ELMO1 분포에서 변화가 발견되지 않았습니다. 분수 7의 ELMO1 수준은 다른 형질전환 과 비교되었고 ARF6Q67L의 회합 후 상승된 것으로 나타났습니다. ARF6Q67L과 FE65가 모두 공동 발현되었을 때 추가 적인 증가가 관찰되었습니다.반대로, FE65를 쓰러뜨리면 ARF6가 분수 7에서 Elmo1 농축을 중재했습니다. 얻은 분수는 후속 분석에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 분획의 단백질 수준 변화를 시각화하기 위해 서양 블로팅.

density-gradient-ultracentrifugation-for-investigating-endocytic

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 문서는 진핵 세포의 변이를 번역의 추출을위한 프로토콜을 설명합니다. 일단 추출된, 리보솜은 다른 ribosomal 인구가 분석 수 있도록 자당 기울기 분별 (분리)에 의해 monosomes 및 polyribosomes로 구분됩니다. 따라서이 방법은 번역의 규정을 조사를위한 황금 표준입니다.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

이 비디오에서는 그래디언트 원심분리를 사용하여 단일 핵을 분리하는 간단하고 효율적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 일단 분리되면 이러한 핵은 염기서열분석 및 게놈 분석에 사용할 수 있습니다.

Gradient Centrifugation Based Purification of Nuclei: A technique to obtain extrapure fraction of intact nuclei using Density gradient centriugation(구배 원심분리 기반 핵 정제: 밀도 구배 원심분리를 사용하여 온전한 핵의 초순수 분획을 얻는 기술)

이 동영상은 특성화 연구에 적합한 세포외 소포체의 하위 집단을 분리하기 위한 밀도 구배 초원심분리 기반 정제 방법을 보여줍니다.

Purification of subpopulations of extracellular vesicles: A technique to purify subpopulations of extracellular vesicles using Density Gradient Ultracentrifugation(밀도 구배 초원심분리를 사용하여 세포외 소포의 하위 집단을 정제하는 기술)

여기, 선물이 원형질 막, 세포질 및 고속 원심 분리의 사용 없이 U937 세포의 미토 콘 드리 아를 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 정화 subcellular 분수 immunoblotting 통해 단백질 지역화의 후속 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

이 분획 프로토콜을 통해 연구자들은 포유류 세포에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 단백질을 분리 할 수 있습니다. 후자의 2 개의 세포 내 분획은 isopycnic 밀도 구배를 통해 추가로 정제됩니다.

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

이 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis(Msm)의 액센 배양에서 천연 마이코박테리아 세포외 소포체(mEV)의 농축과 mCherry(적색 형광 리포터) 함유 재조합 MsmEV를 설계하고 농축할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 EsxA 단백질을 함유한 MsmEV의 농축을 통해 새로운 접근법을 검증합니다.

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

미토콘드리아 접촉 부위는 미토콘드리아 내막 및 외막 단백질과 상호 작용하는 단백질 복합체입니다. 이 부위는 미토콘드리아 막과 세포질과 미토콘드리아 기질 사이의 통신에 필수적입니다. 여기에서는 이 특정 종류의 단백질에 적합한 후보를 식별하는 방법을 설명합니다.

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

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배우세요 포유류 세포에서 밀도 그라데이션 초원심 분리를 이용하여 내구 재활용 소포를 분리하는 방법을. 이 기술은 단백질 운반 메커니즘 연구에 필수적인 세포생물학 연구에 활용됩니다.

포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리

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