Name: 원팟 퓨어 셀 프리 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 원팟 퓨어 셀 프리 시스템을 이용한 재조합 무세포 단백질 발현 방법을 통해 신속한 단백질 정제 기술을 익히세요. 이 비용 효율적인 프로토콜은 합성 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 2020 연구 혁신 프로그램 그랜트 723106, 스위스 국립 과학 재단 보조금 (182019) 및 EPFL에서 유럽 연구 위원회에 의해 지원되었다.

<ol><li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213(2020).</li>
<li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+systems%3A+a+proving+ground+for+rational+biodesign%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788(2020).</li>
<li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalizing+cell-free+systems%3A+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li>
<li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188(2021).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232(2014).</li>
<li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+%28PURE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Translation%22%5BJournal%5D)">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), Austin, Tex. 1327006(2017).</li>
<li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthethic+Biology%22%5BJournal%5D)">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li>
<li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li>
<li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li>
<li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+by+pure+translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), San Diego, Calif. 299-304 (2005).</li>
<li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li>
<li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113(2015).</li>
<li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PURE+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, Clifton, N.J. 11-21 (2010).</li>
<li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li>
<li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li>
<li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li>
<li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li>
<li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple%2C+robust%2C+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li>
<li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15(2009).</li>
<li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li>
<li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297(2009).</li>
<li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904(2020).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li>
<li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+partially+self-regenerating+synthetic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340(2020).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 표준조성물(15)에기초하여 다재다능한 PURE 발현시스템(20)을 준비하는 간단하고 시간 적이며 비용 효율적인 방법을 설명한다. 제공된 일일일정(표 1)과함께 프로토콜을 활용하여 모든 구성 요소를 1주에 제조할 수 있으며 최대 500μL PURE 반응에 충분한 양을 산출할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 단백질은 높은 복사 플라스미드로부터 과발현되고 대장균에대한 독성이 낮기 때문에 필요한 모든단백질(도 1)에대해 양호한 발현 수준이 관찰된다. 이것은 균주의 쉬운 조정을 허용하고, 따라서 또한 교양에서 단백질 조성을 허용, 단순히 접종 균주의 비율을 수정하여(20). 리보소피 단백질 외에도 EF-Tu의 농도는 발현 수율6에대한 근본적인 중요성을 보였다. 대조적으로, 다른 단백질 성분의 농도의 변화는 PURE 시스템7,24의견고성에 상대적으로 낮은 영향을 미쳤다. 따라서, EF-Tu의 접종 비율을 다른 모든 구성 요소에 대하여 조정함으로써, 표준 PURE 조성물에 유사한 조성물을 달성할 수 있고, 유사한수율(20)을 가진 PURE 시스템을 달성할 수 있다. 단백질 용액을 준비할 때, 모든 균주가 잘 자라도록 보장하고 유도 후 인코딩된 단백질을 과도하게 표현하는 것이중요합니다(도 1).
리보솜 기능은 PURE시스템(24)의전반적인 성능의 핵심이다. 이 프로토콜에서는 리보솜 솔루션을 준비하기 위한 두 가지 방법이 시연됩니다( 예: 태그없는 및 그의 태그가 지정된 리보솜 정화). 태그없는 리보솜 정제는 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 기반으로 하며, 그 다음에는 자당 쿠션을 가진 원심분리작용을 기반으로 하며, 이는 FPLC 정화 시스템과초원심분리기(15)에대한 접근이 필요하다. 대조적으로, 그의태그리보솜(18)과 중력흐름친화정제를 활용한 방법은 특수장비를 필요로 하지 않으며 대부분의 실험실에서 수행될 수 있다. 따라서 후자의 방법은 단순성 및 접근성과 같은 이점을 제공합니다. 그러나, 원팟 퓨어에서 그의 태그가 붙은 리보솜을 사용할 때 합성 수율이 현저히 낮은 것을 관찰하였다(도3). 응용 프로그램의 유형에 따라, 이 낮은 수율은 허용 될 수있다.
에너지 솔루션은 체외 TX-TL 반응에 연료를 공급하는 데 필요한 저분자 성분과 tRNA를 제공합니다. 이 프로토콜은 사용자의 요구에 따라 쉽게 조정할 수 있는 일반적인 에너지 솔루션에 대한 레시피를 제공합니다. tRNA, NTP 및 크레아틴 인산염과 함께, Mg2+ 이온의 풍부하고 농도는 전사 및 번역에 중요한 보조 인자이기 때문에 PURE 시스템8의전반적인 성능에 매우 중요합니다. 어떤 경우에는 이온의 적정이 전체 PURE 성능을 크게 향상시킬 수 있습니다. DNA 무결성은 PURE 성능에 매우 중요합니다. 따라서, 발기인 영역, 리보솜 결합 부위 및 표적 유전자를 확인하고 적절한 DNA 농도(<2 nM)가 PURE 반응을 설정하는 동안 발생할 수 있는 문제를 해결하는 데 도움이 될 것이다.
PURE 시스템은 최소한의 TX-TL 시스템이며, 따라서 특정 응용 프로그램은 추가 조정이 필요할 수 있습니다25. 이들 로는 상이한 RNA 중합체9,26,샤페론(13) 및 EF-P 또는 ArfA 8과 같은 단백질 인자를 포함할 수있다. 이러한 단백질에 대한 발현 균주는 공동 배양에 포함될 수 있지만, 준비된 시스템에 별도로 추가하는 것은 필요한 단백질 수준을 더 잘 제어할 수 있다. 더욱이, 소포의 포함은 막 단백질10,11의생산에 필수적이다. 환경과 이황화물 결합 이소머라제는 환경과 이황화물 결합을 감소시키기 보다는 산화는 예를 들어, 분비단백질(12)에필요한 적절한 이황화 결합 형성을 용이하게 한다.
추가 구성 요소가 반응을 방해하지 않도록 하는 것이 필수적입니다. 반응을 설정하거나 다른 구성 요소를 추가할 때 주의를 기울여야 할 가장 중요한 요소는 다음과 같습니다. 호환되지 않는 버퍼가 사용되지 않고 이온 농도가 방해되지 않도록 합니다. 글리세롤, 고농도 칼륨, 마그네슘, 칼슘 이온, 삼투석, 파이로포스페이트, 항생제 또는 EDTA를 가능한 한 함유한 용액을 피하십시오. 예를 들어, EDTA가 이 완충제에서 일반적인 첨가제이기 때문에 DNA 정제 시 용출 완충제를 물로 대체하는 것이 유익할 수 있다. NTP 또는 dNTP와 같은 추가 음전하 분자와 함께 솔루션을 공급하려면 음전하 분자가 킬라팅 제로 작용하고 양전하 분자를 결합하기 때문에 마그네슘 농도8을조정해야 합니다. 중립 pH는 반응에 이상적입니다. 따라서 모든 구성 요소는 해당 pH에 버퍼링되어야 합니다. 이것은 NTPs와 같은 고산성 또는 기본 분자를 위해 특히 중요합니다. 좋은 수율을 달성하기 위해, 34 °C 이하의 온도가 크게 수율27을감소시킬 수 있기 때문에, 37 ° C 주위의 온도를 구현해야합니다.
OnePot PURE를 준비하기 전에 대상 응용 프로그램 및 부피, 순도, 수정 용이성 및 구성 요소의 포함 또는 누락과 같은 관련 요구 사항을 고려해야 합니다. 많은 응용 프로그램의 경우 시스템은 훌륭한 선택이 될 것이지만 다른 응용 프로그램은 원팟 시스템이 제공할 수 없는 수율, 조정 가능성 및 기타 요인이 필요할 수 있습니다. 이와 관계없이, 도입된 프로토콜은 이러한 준비를 위한 모든 중요한 단계가 여기에 요약되기 때문에 모든 홈메이드 시스템의 준비에 도움이 될 것입니다.
OnePot 시스템의 주요 장점 중 하나는 시판되는 PURExpress 시스템과의 호환성으로 각 PURExpress 구성 요소를 OnePot에 상응하는 구성 요소를 순차적으로 교체하여 모든 구성 요소의 기능과 무결성을 별도로 테스트할 수 있다는 점입니다. 튜닝성과 쉽고 빠르며 비용 효율적인 준비와 같은 OnePot PURE 시스템의 장점은 전 세계적으로 더 많은 실험실에 세포가 없는 TX-TL에 접근할 수 있게 하고 세포 없는 합성 생물학에서 이 강력한 플랫폼의 구현을 확장하는 데 기여할 것입니다.

세포 없는 전사 번역(TX-TL) 시스템은 생물학적 시스템을 조사하고 엔지니어링하기 위한 유망한 플랫폼입니다. 그들은 더 이상 성장, 항상성 또는 규제 메커니즘1을포함한 생명 유지 프로세스에 의존하지 않기 때문에 단순화되고 조정 가능한 반응 조건을 제공합니다. 따라서, 세포없는 시스템은 생체 분자 시스템의 조사에 기여하고, 합리적 바이오 설계 전략2를테스트하는 프레임 워크를 제공하고, 미래의 합성 세포3,4에대한 섀시를 제공 할 것으로 예상된다. 완전 재조합 PURE 시스템은 정의되고 최소한의 구성뿐만 아니라 조정 가능성과 튜닝성5로인해 특히 매력적인 섀시(chassis)를 제공합니다.
2001년5년제1차 기능성 완전재조합 PURE 시스템이 설립된 이래, 시스템 한계를 확대하고 시스템 수율을6,7,8,전사조절9,멤브레인10,11, 분비 단백질 합성12,단백질 접이식13,14를 용이하게 하기 위한 시스템 한계를 확대하고 시스템의 구성을 최적화하기 위한 노력이 이루어지고 있다. . 현재 는 PUREfrex (제네프론티어), PURExpress (NEB), 매직 퓨어 (크리에이티브 바이오 랩)의 세 가지 상용 시스템이 있습니다. 그러나 이러한 시스템은 비용이 많이 들고 정확한 구성은 독점적이므로 알 수 없으며 적응성이 제한됩니다.
사내에서 제조된 PURE 시스템은 가장 비용 효율적이고 튜닝 가능한옵션(15,16)으로입증되었습니다. 그러나, 단백질 과 리보솜 분획에 필요한 37개의 정화 단계는 시간이 많이 걸리고 지루하다. PURE시스템준비(17,18,19)의효율성을 개선하기 위한 여러 시도가 있었다. 우리는 최근에 PURE 시스템에 존재하는 모든 필수 비 리보소말 단백질을 공동 배양하고 공동 정화할 수 있음을 입증했습니다. 이 OnePot 방법은 비용 효율적이고 시간 효율적이며 준비 시간을 몇 주에서 3 영업일로 줄입니다. 이 접근법은 상용 PURExpress시스템(20)에필적하는 단백질 생산 능력을 갖춘 PURE 시스템을 생성한다. PURE 제제를 단순화하기 위한 이전의 접근법과는 달리17,18,19,OnePot 접근법에서 모든 단백질은 여전히 별도의 균주로 표현된다. 이를 통해 사용자는 특정 균주를 생략하거나 추가하거나 접종 량을 조정하여 OnePot PURE 시스템의 구성을 조정할 수 있으므로 드롭아웃 PURE 시스템을 생성하거나 최종 단백질 비율을 각각 변경할 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은이전에설명된 대로 OnePot PURE 시스템을 만들기 위한 상세한 방법을 제공하지만, β-메르카토에탄올은 트리스(2-carboxyethyl)인포스핀(TCEP)으로 대체되었다. 더욱이, 리보솜 정화를 위한 두 가지 방법이 설명되어 있다: 소수성 상호작용과 자당 쿠션을 이용한 전통적인 태그없는 리보솜 정제, 시미즈 외15,왕외18및 에데르스 외21에 기초한 Ni-NTA 리보솜 정제등이 크게 수정되었다. 후자의 방법은 PURE 시스템의 준비를 더욱 용이하게하고 표준 실험실 장비만 요구되기 때문에 더 많은 실험실에 접근할 수 있게 합니다.
실험 프로토콜은 1주일 이내에 표준 실험실 장비를 사용하여 제조할 수 있는 간단하고 튜닝가능한 비용 효율적인 세포 없는 플랫폼을 제공하기 위해 다목적 PURE 셀 프리 TX-TL 시스템의 준비를 요약합니다. 표준 PURE 컴포지션을 도입하는 것 외에도 시스템의 기능을 보장하기 위해 프로토콜의 중요한 단계에 중점을 두고 조정할 수 있는 방법과 위치를 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>VWR International</td><td>525-0309</td><td></td></tr><tr><td>384웰 블랙 어세이 플레이트</td><td>Corning</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM 프리캐스트 단백질 겔</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>VWR International</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 폴리프로필렌 딥웰 플레이트</td><td>Nunc</td><td>260252</td><td></td></tr><tr><td>아세트산, 99.8 %</td><td>Acros</td><td>222140010</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta purifier</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>정제 태그 프리 리보솜</td></tr><tr><td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>아미노산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td></td></tr><tr><td>염화 암모늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09718-250G</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 황산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Condalab</td><td>6801</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark 형광 단백질 표준</td><td>ThermoFisher</td><td>LC5928</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy&nbsp; 씰링 멤브레인</td><td>다양 화 Biotech</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기 튜브 폴리 카보네이</td>트 <td>Beckman</td><td>355631</td><td>태그 프리 리보솜 정제</td></tr><tr><td>냉각 아웃 액체 왁스</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>CHO1411</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴 인산</td>염 <td>Sigma-Aldrich</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & Concentrator-25 (Capped)</td><td>Zymo</td><td>ZYM-D4034-200TS</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>SantaCruz Biotech</td><td>sc-29089B</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 크로마토그래피 컬럼</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03609-250G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes</td><td>VWR International / Eppendorf</td><td>525-0133</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 스냅 캡 포함</td><td>Falcon</td><td>352051</td><td></td></tr><tr><td>플라스크, 당황된 1000 mL 4 배플, 붕규산 유리</td><td>Scilabware</td><td>9141173</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTect Green Lys 체외 번역 라벨링 시스템</td><td>Promega</td><td>L5001</td><td>옵션</td></tr><tr><td>Folinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1541</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7757-1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap 부틸 HP 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>28411005</td><td>태그 프리 리보솜 IMAC</td></tr><tr><td>세파로스 6 정제</td><td>빠른 흐름 GE 헬스케어</td><td>17-0921-07</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>인스턴트블루</td><td>엑스페디온</td><td>ISB1L-1L</td><td></td></tr><tr><td>IPTG(이소프로필-베타-D-티오갈락토시드)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21149.03</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 버퍼(2x), 샘플 버퍼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3401-1VL</td><td></td></tr><tr><td>용원 육수(LB) 매체</td><td>AppliChem</td><td>A0954</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 아세테이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0631</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Honeywell Fluka</td><td>63020-1L</td><td></td></tr><tr><td>니켈 황산염</td><td>Alfa Aesar</td><td>15414469</td><td></td></tr><tr><td>NTP</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA 중합효소 (2 U/&micro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 클로라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-1KG</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 글루타메이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49601</td><td></td></tr><tr><td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td><td>NEB</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>PURExpress&nbsp; &델타; &nbsp; 리보솜 키트</td><td>NEB</td><td>E3313S</td><td></td></tr><tr><td>퀵 스타트 브래드포드 1x 염료 시약</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>빠른 흐름 멸균 일회용 진공 필터 유닛</td><td>ThermoFisher</td><td>564-0020</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA 솔루션</td><td>Promega</td><td>A7973</td><td></td></tr><tr><td>SealPlate&nbsp; 필름</td><td>엑셀 사이언티픽</td><td>Z369659-100EA</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>6203</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마-알드리치</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀-하이드로클로라이드)</td><td>시그마-알드리치</td><td>646547-10X1mL</td><td></td></tr><tr><td>후벽 폴리카보네이트 튜브</td><td>Beckman</td><td>355631</td><td></td></tr><tr><td>트리클로로아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>ThermoFisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Optima L-80</td><td>Beckman</td><td></td><td>태그 프리 리보솜 정제</td></tr><tr><td>Whatman GD/X 주사기 필터</td><td>GE Whatman</td><td>WHA68722504</td><td></td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6250-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

원팟 퓨어 셀 프리 시스템

OnePot PURE Cell-Free System

정의된 PURE(재조합 원소를 이용한 단백질 합성) 전사 번역 시스템은 세포없는 합성 생물학을 위한 매력적인 섀시를 제공합니다. 안타깝게도 시판되는 시스템은 비용이 많이 들며 튜닝성이 제한됩니다. 이에 비해 사용자 요구에 따라 홈메이드 접근 방식을 사용자 지정할 수 있습니다. 그러나, 집에서 만든 시스템의 준비는 리보솜뿐만 아니라 36 중간 규모의 단백질 정제의 필요성으로 인해 시간이 많이 걸리고 힘들다. 응모 및 공동 정제로 단백질 정제를 간소화하면 시간과 노동 요구 사항을 최소화할 수 있습니다. 여기서는 표준 실험실 장비를 사용하여 1주일 이내에 모든 PURE 시스템 구성 요소를 생산하는 쉽고 조정 가능하며 시간 및 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 또한 OnePot PURE의 성능은 시판되는 시스템과 비교할 수 있습니다. OnePot PURE 준비 방법은 단순성과 비용 효율성으로 인해 PURE 시스템의 접근성을 더 많은 실험실로 확장합니다.

위의 프로토콜은 모든 실험실에서 PURE 세포 없는 TX-TL 시스템을 쉽게 확립하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜에는 PURE 시스템의 세 가지 뚜렷한 부분의 준비에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다: OnePot 단백질, 리보솜 및 에너지 솔루션. 워크플로를 최적화하는 자세한 일일 일정은 표 1에표시됩니다. 워크플로우는 그의 태그된 리보솜의 정화에 최적화되어 있으며, 태그없는 리보솜 정제가 수행되면 시간 프레임이 약간 다를 수 있습니다. 한 번의 준비는 최소 500μL 반응에 대해 충분한 양의 PURE를 제공합니다. 더욱이, 준비된 용액은 -80°C에서 1년 이상 안정되어 있으며 여러 동결 해동 주기를 견딜 수 있다.
모든 균주에 대한 적절한 과발현 수준은 최종 단백질 용액의 기능에 매우 중요합니다. 도 1은 OnePot 단백질 제제에 대해 이후에 사용되는 모든 36개의 개별 균주에서 성공적인 과발현을 나타낸다. 과발현 단백질의 대역 강도의 변화는 SDS-PAGE 젤에 부피를 적재하는 편향으로 인해 가장 많이 발생했을 것이다. 예상 단백질 크기는 표 2로요약됩니다. GlyRS 및 PheRS는 다양한 분자량의 2개의 하위 단위로 구성됩니다; 나머지 34단백질은 단일 서브유닛으로 구성된다. 이 프로토콜의 단순성과 시간 효율성의 핵심은 응모 및 공동 정화단계(그림2)입니다. OnePot 단백질 용액은 다른 모든 발현 균주에 대하여 EF-Tu 균주의 비율을 증가시킴으로써 제조되었다. 최종 단백질의 전체 조성물은 SDS-PAGE(도3A)에의해 분석되었다. 겔(lanes 2, 3)에서 EF-Tu(43.3 kDa)가 예상대로 다른 단백질에 비해 더 높은 농도로 존재하는 것이 눈에 띈다. 젤은 단백질 발현 비의 좋은 첫번째 표시를 제공하지만, 각 개별 단백질이 표현된 수준 및 어느 수준을 결정하기 어렵다. 따라서, 상기와 같이, 응식하기 전에 각 변형의 과발현을 확인하는 것이 좋습니다.
대장균은 50개 이상의 개별 단백질 하위유닛(23)으로구성된 복합 분자 기체이다. 태그없는 리보솜 정화를 위한 260 nm의 대표적인 흡수 스펙트럼이 도 4에도시되어 있다. 세 번째 피크는 성공적인 리보솜 용출의 특징입니다. 두 리보솜 정제 방법에 대해, SDS-PAGE젤(도 3A)18에서 예상되는 실행 패턴을 관찰하였다. 소량(&lt;10%)이었기는 하지만 두 정제모두에 대한 오염을 관찰했습니다. 특히, 타구가 없는(차선 5, 6) 및 그의 태그가 지정된(차선 11, 12) 리보솜에 상이한 오염물질이 존재했다. 사용자 참조를 위해 결합된 시스템에 대한 SDS-PAGE 젤도 포함됩니다(차선 8, 9 및 14, 15).
마지막으로, 상이한 리보솜 변종을 이용한 준비된시스템(도 3)의성능이 비교된다. 시험관 내 eGFP 발현의 시간 과정은 PURE 시스템이 모두 기능적이고 형광 eGFP를 생성한다는 것을 보여줍니다. 그러나, 원포트 단백질 용액은 적정에 의해 최적화된 리보솜 농도를 이용하여, 태그가 없는 리보솜버전(그림 3B)의발현 레벨의 3분의 1만 산출하였다. 유사한 결과는 다른 크기의 3개의 단백질이 체외 라벨링 시스템(그림3C)에서녹색 Lys tRNA를 사용하여 발현및 표지되었을 때 관찰되었다. 형광 젤에서 볼 수 있듯이, 전체 길이 제품은 성공적으로 두 시스템에서 발현되었다; 그러나, 표현 수준의 절반 정도만이 그의 태그 리보솜 시스템으로 달성되었다. 형광 라벨링 외에도, 3가지 단백질 모두에 대한 예상 밴드는 쿠마시 스테인드젤(도 3D)에서구별할 수 있다. 결과는 표준 장비가 있는 실험실에서 1주일 이내에 제조될 수 있는 도입된 발현 시스템이 선형 템플릿으로부터 T7 프로모터의 하류로 인코딩된 단백질의 체외 발현에 사용될 수 있음을 보여준다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg"> 그림 1: PURE 시스템의 모든 식균에 대한 초과식 테스트의 대표적인 결과. PURE 단백질 수와 크기는 표 2로요약됩니다. 단백질 번호 21, 24 및 27은 더 나은 시각화를 위한 별으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg"> 그림 2: 원포트 단백질 정제. OnePot 단백질 용액 의 생산에 관련된 모든 단계의 회로도 묘사 및 해당 사진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg"> 도 3: 상이한 리보솜 변종을 이용한 제조된 시스템의 성능. (A)코마시 블루 스테인드 SDS-PAGE 젤의 OnePot 단백질 용액(차선 2, 3), 단백질 용액이 없는 태그없는 리보솜(차선 5, 6) 및 단백질 용액(차선 8, 9), 단백질 용액이 없는 리보솜(차선 11, 12차선) 및 12차선(차선 11, 124)이 없는 리보솜(lanes 11, 124). 샘플당 두 개의 서로 다른 농도가 로드되었습니다. (B)그의 태그리보솜과 태그없는 리보좀의 eGFP 표현의 비교. 시험관 내 eGFP 발현의 형광 강도는 태그없는 리보솜(1.8 μM, 파란색) 및 태그가 지정된 리보솜(0.62 μM, 빨간색)을 사용하여 퓨어 반응을 위해 시간이 지남에 따라 모니터링됩니다. 선형 템플릿과 OnePot 단백질 용액의 농도는 각각 4nM 및 2 mg/mL이었다. 패널(C)및(D)는원포트에서 합성된 단백질의 SDS-PAGE 젤을 태그없는(1.8 μM, 블루, 레인 3, 4, 5)와 그의 태그 리보솜(0.62 μM, 적색, 차선 6, 7, 8)으로 표시하여 각각 의체외 라벨 키트(C) 및 디매스(C) 염색키트(C) 및 디매스(C)와 함께 그린리(C) 및 디매스(D)를 표시한다. 검은 화살은 합성 단백질의 예상 밴드를 나타냅니다: eGFP (26.9 kDa), ArgRS (64.7 kDa), T7 RNAP (98.9 kDa). 선형 템플릿 및 OnePot 단백질 용액 농도는 각각 4nM 및 1.6 mg/mL이었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg"> 그림 4: 흡광스펙트럼 스펙트럼 260 nm. 태그없는 리보좀의 소수성 상호 작용 정화 시 260 nm에서 흡광스펙트럼 스펙트럼의 대표적인 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 모든 OnePot PURE 솔루션의 준비를 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank"></a> 위한 일일 시간 최적화 된 일정. 
표 2: PURE 단백질 목록은 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">여기를 클릭하여 이 표를 다운로드하십시오.</a>
보충 표 1: 시약. 표에는 이 연구 중에 사용되는 시약 및 구성 요소의 농도, 볼륨 및 기타 특정 세부 정보가 나열되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: 버퍼. 스프레드시트에는 단백질, 태그 없는 리보솜 및 그의 태그 리보솜 정제뿐만 아니라 준비에 사용되는 스톡 솔루션의 농도에 대한 정확한 완충성분이 나열되어 있습니다. 또한 버퍼 볼륨을 기반으로 필요한 양의 구성 요소를 계산합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 3: 아미노산 계산. 스프레드시트에는 에너지 용액에 필요한 아미노산과 권장 재고 용액 농도가 나열되어 있습니다. 실제 계량 질량에 기초하여 각 아미노산에 첨가되는 물의 양을 계산하고, 또한 최종 아미노산의 혼합물에 첨가할 아미노산 용액의 부피를 계산한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 4: 에너지 솔루션을 위한 스톡 솔루션. 이 표는 에너지 솔루션에 필요한 재고 솔루션의 농도와 볼륨을 나열하고 저장 조건을 포함한 자세한 내용을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 표 5: 에너지 솔루션. 표에는 에너지 솔루션 구성 요소와 권장 농도가 나열되어 있습니다. 또한, 스톡 솔루션 농도 및 에너지 솔루션의 부피에 따라 최종 솔루션에 추가해야 하는 필요한 볼륨을 계산합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 6: PCR. 표는 확장 PCR에 사용되는 프라이머의 서열 및 농도를 나열하고 고충실도 DNA 폴리머라제에 최적화 된 용융 온도 및 열 사이클러 단계를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 7: 순수한 반응. 스프레드시트는 PURE 반응의 예제 설정을 보여 주습니다. 태그없는 리보솜 또는 His-tag 리보솜을 사용하여 PURE 반응을 위해 구성 요소의 사용 농도 및 볼륨을 나열합니다. 또한, 단백질과 리보솜 적정에 대한 부피 비율을 계산합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

표준 실험실 장비를 사용하여 재조합 PURE 세포 없는 TX-TL 시스템을 생산하는 빠르고 비용 효율적인 방법을 제시합니다.

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

일반적으로 PURE 시스템으로 알려진 재조합 세포 없는 단백질 발현 시스템을 위한 이 프로토콜은 세포 배양 및 세포 정화를 활용하여 필요한 단백질 정제를 간소화합니다. 이를 통해 시간과 노동 요구 사항을 크게 최소화할 수 있습니다. OnePot 방법은 비용 효율적일 뿐만 아니라 시간 효율적일 뿐만 아니라 시간 효율적입니다.준비 시간을 몇 주에서 3영업일로 줄입니다. 이것은 전 세계적으로 더 많은 실험실에 접근 하고 합성 세포 없는 생물학을 위한 이 정말 강력한 플랫폼을 구현하는 것을 돕습니다 PURE 세포 없는 플랫폼을 만듭니다. 시작하기 전에, 위에 있는 모든 긴장이 그들의 각각의 단백질을 잘 표현하도록 하십시오.먼저, 세파로즈 수지의 2밀리리터를 사용하여 텍스트 원고에 설명된 대로 OnePot 단백질 정제에 대한 컬럼을 준비하고 니켈 황산염으로 컬럼을 충전한다. LB 미디어의 20 밀리리터와 20개의 암피실린 마이크로리터를 결합하여 스타터 배양을 준비하십시오. 300 마이크로리터의 마이크로리터를 멸균 96개의 딥 웰 플레이트의 35개 웰에 넣습니다.신장 인자 열 불안정, 또는 EFTU를 제외하고 각각의 변형률을 접종하고 통기성 멤브레인으로 플레이트를 밀봉합니다. EFTU 배양을 위해 스냅 캡이 있는 14 밀리리터 배양 튜브에 LB 배지를 함유한 암피실린 3밀리리터를 접종합니다. EFTU 배양의 약 3밀리리터는 OnePot 식 문화 1개에 충분합니다.하룻밤 사이에 분당 260 회전에서 흔들면서 섭씨 37도에서 배양하십시오. 다음 날, LB 미디어의 500 밀리리터와 500 개의 암피실린 마이크로 리터를 멸균 당황 플라스크로 옮기습니다. EFTU 배양의 1, 675 마이크로리터와 깊은 우물 판에서 각 배양의 55 마이크로리터로 OnePot PURE 배양을 접종하십시오.분당 260회전으로 37도에서 2시간 동안 배양하거나 배양의 광학 밀도가 0.2~0.3에 도달할 때까지 배양한다. 0.1 밀리머 IPTG의 500 마이크로리터로 배양을 유도하고 추가 3 시간 동안 성장한다. 세포를 섭씨 4도, 3, 220회 G에서 10분간 수확하고, 세포 펠릿을 영하 80도에서 추가 사용까지 보관한다.셋째 날에는 정제에 필요한 버퍼양을 측정하고 텍스트에 표시된 대로 모든 버퍼에 TCEP를 추가합니다. 향후 정화를 위해 TCEP 없이 나머지 버퍼를 섭씨 4도에 저장합니다. 완충 A의 30 밀리리터로 충전된 열을 평형화합니다.버퍼 A의 25 밀리리터가 통과한 후 아래쪽에서 열을 닫습니다.세포를 해동하고 130와트 프로브를 사용하여 세포에 완충A.Lyse의 7.5 밀리리터에서 세포 펠릿을 재보페하기 위해 서학적 파이펫을 사용합니다. 초음파 처리가 성공하면 솔루션이 어두워집니다. 세포를 얼음 위에 유지하고 튜브를 건드리지 않고 프로브를 충분히 깊게 배치하십시오.세포 잔해를 21, 섭씨 4도에서 20분 동안 130회 G로 제거하고 얼음에 용해를 유지합니다. 상체를 평형 열에 추가합니다. 상단에서 열을 닫고 누출이 없는지 확인합니다.튜브 회전기사용으로 회전 시 섭씨 4도에서 3시간 동안 컬럼을 배양합니다. 기둥에서 풀이 없는 성분을 25밀리리터의 버퍼 A.Wash로 세척하여 25밀리머 이미다졸 버퍼25밀리리터로 컬럼을 세척합니다. 450 밀리머 이미다졸 완충제의 5 밀리리터로 단백질을 엘테우고 항상 얼음에 용출 된 단백질을 유지합니다.HT 버퍼 25밀리리터로 용액을 희석시키고 혼합물을 얼음 위에 보관합니다. 15 밀리리터 원심 필터에 15 밀리리터를 추가하고 1.5 밀리리터의 부피에 농축합니다. 농축 된 용액을 사용하여 나머지 15 밀리리터를 필터에 추가하고 다시 한 번 1.5 밀리리터에 농축하십시오.집중된 샘플에 HT 버퍼 10 밀리리터를 추가하고 1 밀리리터에 농축합니다. 농축 된 샘플을 복구하고 동일한 양의 스톡 버퍼 B를 추가하고 추가 사용까지 영하 80도에서 저장하십시오. 버퍼 교환 중에 텍스트에 지정된 대로 열을 복원합니다.4일째에, 브래드포드 분석서를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 3킬로달톤 컷오프 원심 필터의 0.5 밀리리터를 밀리리터당 20밀리그램으로 농축합니다. SDS 페이지를 사용하여 OnePot PURE 단백질 조성물을 확인합니다.2개의 X Laemmli 완충제의 10 마이크로리터와 혼합된 물의 7.5 마이크로리터로 샘플의 2.5 마이크로리터를 희석한 다음 젤에 5개의 마이크로리터와 2.5 마이크로리터를 적재합니다. 텍스트에 지정된 대로 SDS 페이지를 실행합니다. 반응에 대한 DNA의 2~10나노몰러를 사용하여 스프레드시트내의 해당 황세포에서 DNA의 농도 와 길이를 채웁니다.마이크로리터에서 원하는 총 반응 량을 채웁니다. 냉동고에서 필요한 시약을 제거하고 얼음에 해동하십시오. 이어서, 계산된 양의 물, DNA 및 에너지 용액을 PCR 튜브의 한쪽 또는 384 웰 플레이트상에 우물의 한 쪽 구석에 파이펫을 한다.피펫은 PCR 튜브의 반대편에 단백질과 리보솜 용액의 계산된 양을 피펫 384 웰 플레이트의 반대 쪽 모서리. 약 30초 동안 회전하여 반응 구성 요소를 병합합니다. 플레이트 판독기 실험 중 증발을 방지하려면 35마이크로리터의 액체 왁스를 추가하고 투명 실란트로 플레이트를 밀봉합니다.섭씨 37도에서 최소 3시간 동안 배양하세요. 플레이트 판독기의 판독을 위해 2분마다 필요한 파장에서 플로레시엔스 강도를 측정합니다. OnePot 단백질 제제에 대해 이후에 사용되는 모든 개별 균주에서 발현에 성공하여 여기에 나타난다.최종 OnePot PURE 단백질 용액의 전체 조성물은 SDS 페이지에 의해 분석되었다. EFTU가 예상대로 다른 단백질에 비해 더 높은 농도로 존재하는 것이 두드러지 다. OnePot 단백질 용액의 합성 수율은 시간이 지남에 따라 eGFP 형광을 모니터링하여 그의 태그또는 태그가 없는 리보솜과 결합된 것으로 분석되었다.체외 라벨링 시스템 또는 쿠마티 염색시스템에서 녹색 목록 tRNA를 사용하여 표지된 3가지 다른 단백질의 발현 수준을 SDS 페이지 젤상에서 분석되었다. 기능적인 PURE 시스템의 경우 모든 균주가 각자의 단백질을 잘 표현하는 것이 절대적으로 중요합니다. 이 기술은 새로운 유전 네트워크, 분자 진단, 치료 및 교육 키트의 개발을 가능하게, 생물학적 시스템 엔지니어링에 PURE 시스템의 구현을 용이하게한다.

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

밀봉 가능한 펨토리터 부피 반응 챔버가 있는 미세 가공 장치에 대해 설명합니다. 이 보고서에는 유전자 발현에서 군집 및 감금의 역할을 이해하기 위해 이러한 챔버 내에서 cell-free protein synthesis 반응물을 밀봉하는 프로토콜이 포함되어 있습니다.

무 세포 생물학 밀봉 Femtoliter 상공 회의소 배열

이 프로토콜의 목표는 폐쇄형 사이토카인 포획 시스템을 통합하고 전담 직원이나 GMP 시설의 사용이 필요하지 않은 벤치탑의 자동화된 2세대 세포 농축 장치를 사용하여 병원체 특이적 임상 등급 T 세포를 제조하는 것입니다. 생성된 거대세포바이러스 pp65 특이적 T 세포는 환자에게 직접 투여할 수 있습니다.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

원발성 다발성 골수종 세포에 대한 고처리량 약물 감수성 분석을 설명합니다. 이는 멀티웰 플레이트에서 골수 미세환경(세포외 기질 및 기질 포함)을 재구성하는 것과 세포 생존율의 종적 정량화를 위한 비침습적 방법으로 구성됩니다.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

이 프로토콜은 소량의 성인 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포(BOEC)를 안정적으로 생성하고 특성화할 수 있도록 합니다. BOEC는 혈관 질환 환자의 내피 세포의 대리 및 유도 만능 줄기 세포 생성을 위한 기질로 사용할 수 있습니다.

사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

임상 미세유체 칩은 임상 환자 혈액 샘플 전처리를 단순화하고 순환 종양 세포(CTC)를 칩에 면역 형광으로 염색하여 단일 CTC를 신속하게 검출하고 식별할 수 있는 중요한 생물 의학 분석 기술입니다.

다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼

여기에서는 희귀 세포 유형의 대사 산물을 정확하고 안정적으로 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세포 분류를 위한 변형된 sheath 유체 및 관련 blank 샘플 생성을 포함한 기술 개선을 통해 샘플당 5000개의 세포만 입력하여 대사 산물을 포괄적으로 정량화할 수 있습니다.

희귀 일차 세포에 대한 표적 대사체학

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

이 프로토콜은 MISS 세포(Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System)를 사용하여 미생물 단클론 분리, 배양 및 피킹을 수행하는 방법을 설명합니다. MISS cell은 액적 미세유체 기술을 기반으로 하는 통합 워크플로우를 달성하며, 이는 우수한 액적 단분산성, 높은 병렬 배양 및 고처리량 바이오매스 검출을 제공합니다.

Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System을 사용한 자동화된 High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking

세포외 소포(EV)의 치료적 적용은 암 치료 및 약물 전달에 혁명을 일으킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리된 키메라 항원 수용체(CAR) 세포 유래 EV(CAR-EV)는 화물 용량이 증가하여 기능적 효능을 크게 향상시킵니다. 이 연구는 생물학적 활성과 치료 가능성을 밝히기 위해 CAR-EV를 추가로 특성화합니다.

키메라 항원 수용체-세포외 소포(CAR-EV) 기술 강화: 암 치료의 미래

우리는 배치 간 변동을 최소화하기 위해 세포 성장을 제어하는 데 중점을 두고 무세포 단백질 합성을 위한 OnePot '재조합 요소를 사용한 단백질 합성'(PURE) 시스템 및 조 리보솜의 생산을 위한 업데이트된 프로토콜을 제시합니다.

재현 가능한 무세포 단백질 합성을 위한 OnePot PURE 및 조류 리보솜 생산 개선

여기서는 전혈과 폐암 세포가 급증한 인공 샘플에서 희귀 암세포를 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 반자동화된 라벨 없는 셀 분리 플랫폼을 사용합니다. 비축된 세포는 이후 드롭렛 디지털 PCR을 사용하여 표피 성장인자 수용체 돌연변이가 있는지 분석합니다.

세포 분리 시스템과 드롭렛 디지털 PCR을 이용한 순환 희귀 세포에서 표피 성장인자 수용체 DNA 돌연변이 프로파일링

배우세요 원팟 퓨어 셀 프리 시스템을 이용한 재조합 무세포 단백질 발현 방법을 통해 신속한 단백질 정제 기술을 익히세요. 이 비용 효율적인 프로토콜은 합성 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

원팟 퓨어 셀 프리 시스템

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