Name: Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 배우세요 H5 조류 인플루엔자 수도바이러스 제조 및 항체 중화 활성 측정 방법을 HEK293 FT 세포와 칼슘 인산염 전염을 이용하여. 이 프로토콜은 백신 효능 연구에 필수적인 면역 반응 분석을 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 장쑤성 혁신 역량 강화 프로젝트(BM2020019), 선전 과학 기술 프로젝트(No. JSGG20200225150702770), 중국과학원(XDB29030103)의 전략적 우선 연구 프로그램, 광동 과학 기술 프로젝트(No. 2020B1111340076) 및 Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program(No. SZBL202002271003).

모든 슈도바이러스 관련 실험 작업은 상하이 중국과학원 파스퇴르 연구소(IPS, CAS)에서 ABSL2 조건 하에서 수행되었습니다. 동물 실험은 IPS, CAS의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 동물 프로토콜을 기반으로 수행되었습니다.
1. Calcium-phosphate transfection을 사용한 유사바이러스 패키징
<ol><li>완전한 DMEM 배지에서 HEK293FT 세포(mL당 9 x 105)의 단일 세포 현탁액을 만듭니다(표 1). 단세포 현탁액 10 mL를 T75 플라스크에 넣고, 형질감염 전에 20 시간 동안 37°C, 5% 이산화탄소 (CO2) 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션한다. 알림: HEK293FT 낮은 통로(<20통로)를 권장합니다. 셀 단층이 80-90% 합류하는지 확인하십시오.</li>
	<li>형질감염 2시간 전에 배지를 클로로퀸(100μM)을 함유하는 완전한 신선한 배지 10mL로 교체합니다.</li>
	<li>표 2 및 도 1에 나타낸 바와 같이 시약 및 플라스미드 DNA를 혼합한다: ddH2O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8.9, 2.5 MCaCl2, 및 2x HEPES 완충액. 부드럽게 위아래로 5회 피펫팅하고, 혼합물을 실온(RT)에서 20분 동안 배양한다.</li>
	<li>혼합물을 세포 위의 배지로 옮기고 플라스크를 부드럽게 흔듭니다. 세포 배양기에서 세포를 15시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>배지를 15mL의 새로운 완전 DMEM 배지로 교체합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 65시간 동안 인큐베이션한다. 참고: 배지의 색상은 밝은 주황색 또는 약간 노란색이며 세포의 최소 80%가 도립 광학 현미경에서 세포 변성 효과(CPE)를 보여야 합니다.</li>
	<li>상청액을 수확하고, 4°C에서 20분 동안 2095 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 수집하고, 분취하고, -80 °C에서 저장한다.</li>
</ol>2. 인플루엔자 슈도바이러스의 HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현 검출
<ol><li>헤마글루티닌(HA) 분석법으로 HA 단백질 발현을 검출합니다.<ol><li>50μL의 PBS를 96웰 둥근 바닥 플레이트의 컬럼 2-12, 행 A, B 및 C에 추가합니다. 참고: 행 A, B 및 C는 3개의 독립적인 복제 테스트에 속하며 열 12는 음성 대조군으로 사용됩니다.</li>
		<li>100μL의 슈도바이러스를 컬럼 1의 웰에 추가합니다. 컬럼 1에서 컬럼 2로 50μL를 옮기고, 위아래로 5회 피펫팅하여 잘 혼합하고, 마지막 컬럼 11까지 2배 희석을 수행하고, 컬럼 11에서 추가로 50μL를 버립니다.</li>
		<li>0.5% 적혈구 50μL를 각 웰에 넣고 위아래로 부드럽게 두 번 피펫팅합니다. RT에서 30-60 분 동안 또는 음성 대조군의 적혈구가 우물 바닥에 규칙적인 반점을 형성 할 때까지 플레이트를 배양하십시오.</li>
		<li>슈도바이러스의 HA 역가를 관찰하고 기록합니다. 참고: 슈도바이러스의 HA 단위는 적혈구의 100% 혈구 응집을 유발할 수 있는 바이러스의 가장 높은 희석 인자입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>웨스턴 블롯 분석에 의한 HA 및 NA 단백질 발현 검출. 참고: 모든 웨스턴 블롯 단계는 분자 복제 매뉴얼(4판 )에 따라 수행됩니다.</li>
	<li>HIV-1 p24 ELISA 키트(Table of Materials)로 HIV-1 p24 단백질 발현을 검출한다.<ol><li>용해 완충액 50μL를 450μL의 유사바이러스 샘플에 추가합니다. 철저히 섞는다.</li>
		<li>세척 완충액 300 μL를 마이크로플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 거꾸로 쳐서 세척 버퍼를 완전히 제거합니다. 세탁을 5 번 반복하십시오.</li>
		<li>200 μL의 표준물질과 시료를 각 웰에 개별적으로 추가합니다. 37°C에서 하룻밤 또는 2시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>플레이트의 내용물을 흡인하고 2.3.2 단계에 설명 된대로 플레이트를 세척하십시오. 참고: 기판 블랭크로 사용하기 위해 분석 플레이트의 한 웰을 비워 둡니다.</li>
		<li>각 웰에 p24 검출기 항체 200μL를 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 2.3.2 단계에 설명 된대로 플레이트를 흡인하고 세척하십시오.</li>
		<li>스트렙타비딘-퍼옥시다제 작업 용액 100μL를 각 웰에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 2.3.2 단계에 설명 된대로 플레이트를 흡인하고 세척하십시오.</li>
		<li>기판 블랭크 웰을 포함한 각 웰에 100μL의 substate 작업 용액을 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 알림: 우물에서 파란색이 발생합니다.</li>
		<li>100 μL의 정지 완충액을 각 웰에 추가합니다. 알림: 파란색은 즉시 노란색으로 바뀝니다.</li>
		<li>450nm에서 15분 이내에 광학 밀도를 판독합니다. 슈도바이러스의 p24 역가를 기록합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 슈도바이러스 적정
<ol><li>완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 5 x 104 )을 만들고 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 및 40000 세포를 96웰 평평한 바닥 플레이트의 다른 웰에 추가합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>-80°C 냉장고에서 슈도바이러스를 꺼내 얼음 위에서 해동한 후 슈도바이러스를 소용돌이친다.</li>
	<li>96웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 6개의 HAU(6x HA 단위) 슈도바이러스를 추가하고 각 웰에 최대 120μL의 완전한 DMEM을 보충합니다.</li>
	<li>혼합물을 위아래로 5번 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 혼합물 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>혼합물 100 μL를 96-웰 플레이트의 세포로 옮긴다. 바이러스 감염 후 48시간, 60시간 및 72시간 동안 세포 배양 접시를 다시 배양기에 넣습니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 루시페라아제 분석(Table of Materials)을 수행합니다.</li>
	<li>플레이트의 웰에서 매체를 조심스럽게 제거하십시오. 200 μL의 PBS로 세포를 헹구고 가능한 한 PBS를 제거합니다. 알림: 접시를 뒤집고 흡수성 종이에 거꾸로 두드려 상등액을 버립니다. 테스트 세포주가 바닥에 단단히 부착되지 않으면 배지 흡인을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>용해 완충액 50μL를 각 웰에 넣고 배양 플레이트를 여러 번 흔듭니다. 플레이트를 -80°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 알림: 1x 용해 버퍼 5개와 물 4개를 혼합하여 1x 용해 버퍼를 만듭니다. 사용하기 전에 1x 용해 버퍼를 RT로 평형화하십시오. 세포가 용해 완충액으로 완전히 덮이도록 플레이트를 흔듭니다. 단일 동결-해동 공정은 세포가 완전히 용해되도록 도울 수 있습니다.</li>
	<li>플레이트를 꺼내 RT에서 2시간 동안 평형을 이룹니다. 알림: 셀은 완전히 용해되어야 합니다.</li>
	<li>플레이트를 여러 번 부드럽게 흔들고 모든 세포 용해물을 불투명한 96웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>기질 50μL를 각 웰에 넣고 플레이트를 부드럽게 여러 번 흔든 다음 기질과 용해 완충액을 완전히 혼합합니다.</li>
	<li>광도계를 사용하여 5분 이내에 생성된 빛을 측정합니다. 슈도바이러스의 루시페라아제 역가를 기록합니다. 참고: 적절한 기질이 첨가되면 루시페린이 루시페라아제 효소에 의해 옥시루시페린으로 전환되는 화학 반응을 통해 부산물로 빛이 방출됩니다. 생성되는 빛의 양은 루시페라아제 효소의 양에 비례합니다.</li>
</ol>4. 면역 혈청 준비
참고: 면역 혈청은 세포 관련 실험에 사용되며 실험 작업은 무균 조건에서 수행되어야 합니다.
<ol><li>8주령의 암컷 BALB/c 마우스 12마리를 준비합니다. 마우스를 두 그룹으로 균등하게 나눕니다. 참고: 한 그룹은 DDV 그룹이었고 다른 그룹은 음성 대조군이었습니다.</li>
	<li>DDV 그룹 면역화: 0주 및 3주에 A/Thailand/(KAN-1)/2004(TH) HA 단백질을 암호화하는 코돈 최적화 DNA 플라스미드 100μg으로 근육내 2회 프라이밍하고 6주차에 512 HAU TH 바이러스 유사 입자(VLP)로 복강내 1회 증폭합니다.</li>
	<li>대조군 면역화: 0주 및 3주에 100μg의 빈 벡터 플라스미드 DNA로 근육내 2회 프라이밍하고 6주에 HIV-1 gag VLP로 복강내 1회 부스팅합니다.</li>
	<li>마지막 예방 접종 후 2 주 후에 마우스 혈액을 수집합니다. 참고: 여기에서 마우스는 채혈 시 펜토바르비탈 나트륨(65mg/kg)으로 마취되었습니다. 턱밑 정맥으로부터 혈액을 채취한 후, 마우스를CO2로 즉시 안락사시켰다.</li>
	<li>혈액을 RT에서 2시간 동안 유지한 다음 밤새 4°C로 유지합니다. 4°C에서 10분 동안 900 x g 로 원심분리하고 상층액을 수집합니다. 혈청을 56°C에서 30분 동안 두어 비활성화합니다.</li>
	<li>면역 혈청을 -80°C 냉장고에 보관하여 사용하십시오. 참고: 마우스 예방 접종의 주요 절차를 설명하는 순서도는 보충 그림 1 을 참조하십시오.</li>
</ol>5. 슈도바이러스 중화(PN) 분석
<ol><li>완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 5 x 104 )을 만들고 96웰 평면 바닥 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100μL를 추가합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>-80°C 냉장고에서 슈도바이러스와 혈청을 꺼내 얼음 위에서 해동한 후 완전히 소용돌이칩니다.</li>
	<li>완전한 배지에서 혈청을 20배 희석하고, 컬럼 2-10에서 96웰 둥근 바닥 플레이트의 웰에 완전한 DMEM 배지 100μL를 추가합니다.</li>
	<li>희석된 혈청 200μL를 2열의 웰에 넣고 100μL를 2열에서 3열로 옮기고 혈청을 1:20, 1:40, 1:80 등으로 1:10240으로 연속적으로 2열에서 10열로 희석하고 100μL를 10열에서 버립니다.</li>
	<li>100μL의 DMEM 완전 배지를 음성 대조군으로 컬럼 11의 웰에 추가합니다.</li>
	<li>100 μL의 슈도바이러스를 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 5회 완전히 위아래로 피펫팅하고, 혼합물 플레이트를 37°C, 5%CO2 에서 1시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>혼합물 100μL를 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 96웰 세포 배양 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 플레이트를 다시 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 60시간 동안 넣었다.</li>
	<li>인큐베이터에서 접시를 꺼냅니다. 3.7-3.12단계에 설명된 대로 루시페라아제 분석을 수행합니다.</li>
</ol>6. 슈도바이러스 부착 분석
<ol><li>완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 4 x 104 개)을 만들고 96웰 평평한 바닥 플레이트의 각 웰에 100μL 세포 현탁액을 추가합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 에서 20시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>4°C에서 하룻밤 동안 1% BSA를 함유하는 DMEM에서 혈청과 함께 슈도바이러스를 인큐베이션한다. 참고: 혼합물의 부피는 100μL입니다.</li>
	<li>MDCK 세포를 1시간 동안 4°C에서 1% BSA를 함유하는 DMEM의 웰 당 100 μL로 차단하였다.</li>
	<li>유사 바이러스 및 혈청 혼합물(100μL)을 MDCK 단층에 접종하고 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포판을 1% BSA가 함유된 PBS로 4회 세척하여 결합되지 않은 바이러스를 제거합니다.</li>
	<li>RT에서 100μL의 루시페라아제 용해 완충액으로 30분 동안 세포를 용해합니다.</li>
	<li>상술한 바와 같이 HIV-1 p24 ELISA 키트로 세포에 결합된 바이러스의 양을 정량화한다(섹션 2.3).</li>
</ol>7. 바이러스 진입 평가
<ol><li>완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 5 x 104 )을 만들고 96웰 평면 바닥 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100μL를 추가합니다. 분석 전에 세포를 37°C, 5%CO2 에서 20시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>슈도바이러스(100μL)를 4°C에서 6시간 동안 96웰 플레이트의 MDCK 단층에 접종합니다.</li>
	<li>세포판을 1% BSA를 함유하는 PBS로 4회 세척하여 결합되지 않은 슈도바이러스를 제거한다.</li>
	<li>1% BSA를 함유하는 DMEM에서 가짜 백신 접종 마우스에서 연속적으로 희석된 면역 혈청 또는 혈청 100μL를 단층에 추가하고 4°C에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>세포 상층액을 제거하고, 세포 배양 접시를 1% BSA가 함유된 PBS로 4회 세척하였다.</li>
	<li>신선한 DMEM을 세포에 첨가하고 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 60시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>3.7-3.12 단계에 설명된 대로 세포의 상대적 루시페라아제 활성(RLA)을 측정합니다. 참고: RLA에 표시된 바이러스 항목은 혈청이 없을 때 얻은 판독값의 백분율로 표시되었으며 100%로 설정되었습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+prime+and+virus-like+particle+boost+from+a+single+H5N1+strain+elicits+broadly+neutralizing+antibody+responses+against+head+region+of+h5+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).</li>
<li>Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+the+immunization+with+the+sequence+close+to+the+consensus+sequence+and+two+DNA+prime+plus+one+VLP+boost+generate+H5+hemagglutinin+specific+broad+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies.</a> Plos One. 12 (5), 0176854(2017).</li>
<li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963(2018).</li>
<li>Duvergé, A., Negroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+lentiviral+vectors%3A+When+the+clothes+make+the+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus.</a> Viruses. 12 (11), 1311(2020).</li>
<li>Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype-based+neutralization+assays+for+influenza%3A+A+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis.</a> Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).</li>
<li>Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+serological+techniques+for+influenza+vaccine+evaluation%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future.</a> Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+influenza+vaccines%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).</li>
<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Influenza.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+broadly+neutralizing+H1N1+influenza+antibodies+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination.</a> Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).</li>
<li>Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures+vesicular+traffic+in+bacteria+and+control+over+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents.</a> Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).</li>
<li>Michael, R. G., Joseph, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMichael%2C+RG+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).</li>
<li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+calcium+phosphate-DNA+coprecipitates%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).</li>
<li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).</li>
<li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+DNA+into+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection of DNA into eukaryotic cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).</li>
<li>Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+plasmid+DNA+for+transfection+of+mammalian+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures.</a> Methods and Protocols. 3 (4), 69(2020).</li>
<li>Luciferase assay system. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system">https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system</a> (2021).</li>
<li>Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

HEK293FT 세포는 일반적으로 슈도바이러스를 생산하기 위한 포장 세포로 사용됩니다. 정기적인 마이코플라스마 검출은 세포 배양 중에 필수적입니다. 마이코플라스마 오염은 슈도바이러스 수율을 급격히 감소시킬 수 있으며 때로는 0에 가까울 수 있습니다. 다른 오염과 비교할 때, 마이코플라스마 오염은 세포 배양 배지의 pH 값 변화 또는 탁도를 유발하지 않습니다. 고농도의 마이코 플라스마조차도 육안이나 현미경으로 볼 수 없습니다. 마이코플라스마 검출의 세 가지 인기 있는 방법은 마이코플라스마 배양, 형광 DAPI 또는 Hoechst 33258을 사용한 DNA 염색, 중합효소 연쇄 반응(PCR)입니다. 배양 샘플에서 마이코플라스마 DNA를 증폭하는 PCR은 빠르고 쉽고 신뢰할 수 있는 마이코플라스마 검사에 널리 사용된다10.
칼슘 포스페이트 매개 형질감염은 고효율, 저비용 및 쉬운 조작으로 인해 수년 동안 인플루엔자 슈도바이러스 패키징에 사용되...

1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 지속적인 독감 발병을 일으켜 전 세계 가금류 산업에서 막대한 사회경제적 손실을 초래했습니다. 때로는 인간도 감염되어 높은 치사율 1,2에 직면합니다. 그러나 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실 밖에서 처리 할 수 없기 때문에 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 생물안전성 레벨 2 실험실에서 실습할 수 있을 만큼 안전합니다.
H5 HPAI 슈도바이러스는 대리 바이러스 코어, 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질이 있는 지질 외피 및 리포터 유전자로 구성된 키메라 바이러스에 속합니다. 슈도바이러스 코어는 일반적으로 렌티바이러스 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 및 수포성 구내염 바이러스(VSV)와 같은 레트로바이러스에서 파생됩니다.3. 특히, HIV-1 패키징 시스템은 인플루엔자 슈도바이러스를 생산하기 위해 널리 사용되며, 여기서 제공되는 주요 유전자는 gag 및 pol입니다. HIV gag 유전자는 핵심 단백질을 발현합니다. pol 유전자는 인테그라제 및 역전사효소를 발현하며, 둘 다 형질도입된 세포에서 리포터 유전자의 발현에 필요합니다. 대리 바이러스의 게놈을 모방한 리포터 유전자는 RNA 형태로 유사바이러스 코어에 흡수됩니다. 리포터 유전자는 숙주 세포에서 단백질을 발현합니다. 리포터 유전자의 유전자 발현 수준은 슈도바이러스 감염 효율을 측정하는데 사용될 수 있다 3,4. 1차 리포터는 형질도입된 세포에서 상대 발광 단위(RLU) 또는 상대 루시페라아제 활성(RLA)을 측정하기 위한 반딧불이 루시페라아제입니다. lacZ, Gaussia, Renilla luciferase 와 같은 다른 리포터들도 사용되지만 그 정도는 적습니다5.
슈도바이러스는 H5 HAPI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구입니다. 중화 항체 효능을 측정하기 위해, 슈도바이러스 중화(PN)분석법(6)이 사용된다. 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)는 인플루엔자 A 바이러스 7,8의 표면에 있는 당단백질입니다. HA는 수용체 결합을 위한 구형 헤드 도메인과 막 융합을 위한 줄기 도메인으로 구성됩니다. NA 단백질은 바이러스 방출을 촉진하는 시알리다아제 활성을 가지고 있습니다 7,8. PN 분석은 HA 단백질에 대한 중화 항체를 측정할 수 있습니다. HA의 머리 및 줄기 영역으로 향하는 중화 항체는 또한 바이러스 부착 및 진입 분석에 의해 검출될 수 있다. 야생형 바이러스에 비해 유사 바이러스 중화 실험은 검출 값이 더 민감하고 레벨 2 생물 안전 실험실에서 안전하게 처리 할 수 있으며 일반적으로 실제로 작동하기가 더 쉽습니다.
이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 PN 분석의 절차와 중요한 단계를 자세히 제시합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다. 본 연구에서는 H5N1 HPAI 바이러스의 A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) 균주를 예로 들어 설명하였다. 분석에 사용되는 면역 혈청을 얻기 위해, 이 프로토콜은 마우스를 면역화하기 위한 면역원으로서 TH 균주로부터 유래된 HA 단백질을 선택하였다.

<table><tbody><tr><td>1% Chiken 적혈구</td> 바이오 <td>채널</td><td>BC-RBC-C001</td><td>시약</td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트(평면 바닥)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>167008</td><td>소모품</td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트(둥근 바닥)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>163320</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Allegra X-15R</td><td>Beckman 쿨터</td><td>--</td><td>장비/원심분리기</td></tr><tr><td>BD 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>324910</td><td>소모품</td></tr><tr><td>염화칼슘 무수</td><td>AMRESCO</td><td>1B1110-500G</td><td>시약</td></tr><tr><td>클로로퀸 이인산염</td><td>Selleck</td><td>S4157</td><td>시약</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>시약</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>시약</td></tr><tr><td></td><td>HEK293FT Gibco</td><td>R700-07</td><td>세포주</td></tr><tr><td>HEPES 유리산</td><td>AMRESCO</td><td>0511-250G</td><td>시약</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 항원 ELISA</td><td>ZeptoMetrix</td><td>801111</td><td>시약 키트</td></tr><tr><td>Luciferase 분석 시스템 냉동고 팩</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>시약 키트</td></tr><tr><td>MDCK.1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td>세포주</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 1.5mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>509-GRD-Q</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Nunc 원추형 원심분리기 튜브 15mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>339650</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Nunc 원추형 원심분리기 튜브 50mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>339652</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 75 cm2</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>156499</td><td>소모품</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>시약</td></tr><tr><td>피펫 팁 (10 &mu; L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF102-10-Q</td><td>소모품</td></tr><tr><td>피펫 팁 (100 &mu; L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td>소모품</td></tr><tr><td>피펫 팁 (1000 &mu; L)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Serological pipets(5mL)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>170355N</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Serological pipets(10mL)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>170356N</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>시약</td></tr><tr><td>Varioskan Flash</td><td>Thermo fisher 과학</td><td>--</td><td>장비/마이크로플레이트 리더</td></tr><tr><td>워터 재킷 인큐베이터</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>3111</td><td>장비/세포 인큐베이터</td></tr><tr><td>펜토바르비탈 나트륨 염</td><td>시그마</td><td>57-33-0</td><td>시약</td></tr></tbody></table>

calcium phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed h5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정

Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통의 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 독감 발병을 일으키고 있습니다. 때때로 인간도 희생되어 사망률이 높습니다. 그럼에도 불구하고 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실에서 처리되어야 한다는 점을 고려할 때 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 H5 HPAI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구임이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 유사바이러스 중화 분석의 절차와 중요한 단계를 설명합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다.

HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현 인플루엔자 슈도바이러스 바이러스 패키징 효율을 확인하기 위해, 인플루엔자 슈도바이러스 스톡을 먼저 HA 분석에 의해 검출하였다(도 2A). 인플루엔자 슈도바이러스의 밀리리터당 HA 단위는 643입니다(표 3). 웨스턴 블롯 분석 및 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현을 테스트했습니다. 이어서, HA 단위의 비율 및 슈도바이러스에 대한 gag p24의 양을 계산하였다. 웨스턴 블롯 분석의 결과는 HA0, HA1, HA2 및 NA 단백질의 4가지 단백질 유형이 있음을 보여주었습니다(보충 그림 2). 이는 인플루엔자 슈도바이러스의 외피 단백질이 야생형 바이러스의 외피 단백질과 유사함을 나타냅니다. HA와 Gag p24의 비율은 보고된 바와 같이 정상 범위 내에 있었다(<strong...

여기에서는 유사 바이러스 패키징 및 항체 중화 활성 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

이 프로토콜은 H5 고병원체 조류 인플루엔자 유사 바이러스 제제 및 유사 바이러스 중화 분석의 절차와 중요한 단계를 설명합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결 제한 및 수정에 대해 설명합니다. 고병원성 병원체는 3급 생물안전 실험실에서 수행해야 하는 반면, 유사 바이러스는 2단계 생물안전 실험실에서 안전하게 처리할 수 있습니다.시작하려면 완전한 DMEM 배지에서 HEK293 FT 세포의 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 단세포 현탁액 10ml를 T75 플라스크에 첨가한 다음, 섭씨 37도에서 배양한다. 형질감염 2시간 전에 기존 배지를 클로로퀸이 포함된 10밀리리터의 신선한 완전 배지로 교체합니다.원고에 설명된 대로 시약과 플라스미드 DNA를 혼합한 다음 이 혼합물을 세포 위의 배지로 옮기고 부드럽게 흔들어줍니다. 인큐베이션 후, 배지를 15 밀리리터의 신선한 완전 DMEM 배지로 교체한다. 65시간 후, 원심분리에 의해 상청액을 수확한다.상청액을 수집하고 분취합니다. 헤마글루티닌 단백질 발현을 검출하기 위해, 50 마이크로리터의 PBS를 96 웰 둥근 바닥 플레이트의 컬럼 2 내지 12에 첨가한다. 100 마이크로 리터의 유사 바이러스를 1 열의 우물에 첨가하십시오.그런 다음 50 마이크로 리터의 유사 바이러스를 1 열에서 2 열의 우물로 옮깁니다. 컬럼 11까지 이 2배 희석을 수행한 후 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 컬럼 50에서 여분의 11마이크로리터를 버립니다.0.5% 적혈구 50마이크로리터를 각 웰에 넣고 부드럽게 혼합합니다. 실온에서 30 내지 60 분의 배양 후, 슈도 바이러스의 헤마글루티닌 역가를 관찰하고 기록한다. 슈도바이러스 적정을 위해, 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 밀리리터당 5배 내지 4번째 세포의 단일 세포 현탁액을 만든다.1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 및 40, 000 세포를 평평한 바닥 96웰 플레이트의 다른 웰에 추가합니다. 배양 후, 의사 바이러스를 해동하고 소용돌이. 96웰 원형 바닥판의 각 웰에 6개의 유사 바이러스 HAU를 추가하고 최대 120마이크로리터의 완전한 DMEM으로 각 웰을 보충합니다.100 마이크로리터의 혼합물을 96 웰 플레이트 내의 세포로 옮긴다. 바이러스 감염을 위해 배양 플레이트를 48, 60 및 72시간 동안 배양하고 루시페라아제 분석을 수행합니다. 루시페라아제 분석을 수행하려면 배지를 조심스럽게 제거하고 200마이크로리터의 PBS로 헹구어 세포를 세척합니다.가능한 한 많은 PBS를 제거한 다음 각 웰에 50 밀리리터의 용해 완충액을 추가합니다. 다음날, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 평형화시킨 다음, 배양 플레이트를 여러 번 흔들고 모든 세포 용해물을 불투명한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 각 플레이트에 50 마이크로 리터의 기판을 넣고 잘 섞는다.광도계를 사용하여 유사 바이러스의 루시페라아제 역가를 기록합니다. MDCK 세포의 단일 세포 현탁액 100 마이크로리터를 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 섭씨 37도에서 20시간 동안 인큐베이션한다. 배양 후, 해동하고 소용돌이 치는 의사 바이러스와 혈청은 섭씨 영하 80도에서 보관됩니다.완전한 배지에서 혈청을 20 배 희석하십시오. 100마이크로리터의 DMEM 배지를 컬럼 3-10에 추가합니다. 희석 된 혈청 200 마이크로 리터를 두 번째 컬럼의 웰에 넣고 연속 희석을 수행하십시오.그런 다음 100마이크로리터의 DMEM 배지를 음성 대조군으로 11번째 열에 추가합니다. 100 마이크로 리터의 유사 바이러스를 각 웰에 넣고 혼합하십시오. 혼합물 100 마이크로리터를 96 웰 둥근 바닥 플레이트로부터 96 웰 세포 배양 플레이트의 상응하는 웰로 옮긴다.섭씨 37도에서 60시간 배양한 후 루시페라아제 분석을 수행합니다. 헤마글루티닌 분석은 인플루엔자 유사 바이러스의 밀리리터당 643 HA 단위가 인플루엔자 유사 바이러스 스톡에 존재한다는 것을 보여주었다. HA와 Gag P24의 비율은 정상 범위 내에 있었다.웨스턴 블롯 분석은 HA0, HA1, HA2 및 NA 단백질을 포함한 4가지 단백질 유형의 존재를 보여주었으며, 이는 인플루엔자 유사 바이러스와 야생형 바이러스의 유사성을 나타냅니다. 유사 바이러스 적정 결과는 가장 높은 상대적 루시페라아제 활성에 적합한 조건이 96 웰 플레이트의 웰에 5, 000개의 세포를 공급하고 바이러스 감염 60시간 후 상대적 루시페라아제 활성 판독값을 검출하는 것을 포함한다는 것을 나타냅니다. DDV 그룹의 면역 혈청은 슈도 바이러스 A 타이캔 104 균주에 대해 높은 중화 역가를 보인 반면, 대조군의 혈청은 중화 활성을 나타내지 않았습니다.면역 혈청의 중화 활성은 대조군 혈청에 비해 강력했으며, 이는 많은 항체가 면역 혈청에서 HA 헤드로 향했음을 나타냅니다. 바이러스 진입 평가 동안 면역 혈청과 대조군 사이의 유의한 차이는 항체가 면역 혈청의 HA 줄기 영역으로 향한다는 것을 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때 형질주입 용액과 배양 배지의 pH를 안정적으로 유지하는 것을 잊지 마십시오.

preparation-pseudo-typed-h5-avian-influenza-viruses-with-calcium

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

이 비디오는 인간 혈청에서 α2,6 연결된 시알산을 과발현하는 Madin-Darby Canine Kidney cell을 사용하여 중화 항체를 측정하는 Microneutralization 분석을 보여줍니다. 이 분석법은 종종 인플루엔자 인간 혈청학에...

인간 혈청에서 중화 항체 역가를 측정하기 위한 미세중화 분석

이 비디오는 중화 인플루엔자 바이러스 단클론 항체의 탈출 변종을 생성하는 기술을 보여줍니다. 항체 중화 바이러스 현탁액을 배아 계란에 주입하여 탈출 변이체를 선택적으로 증식시킵니다. 그 결과 주로 탈출 변이체의 바이러스 집단이 발생하며, 이는 Hemagglutination 분석을 통해 확인되었습니다.

중화 항체에 대한 인플루엔자 바이러스 탈출 변이의 생성

이 연구는 설명   영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

인플루엔자 A 바이러스 (IAVs)는 중요 한 인간의 호흡기 병원 균. IAVs pathogenicity 이해 하 고 새로운 백신 접근의 전 임상 시험 수행 인간의 생리를 흉내 낸 동물 모델은 필요. 여기, 우리가 IAV pathogenesis, 체액 성 반응과 감염 마우스 모델을 사용 하 여 백신 효능을 평가 하는 기법을 설명 합니다.

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

우리는 우리가 대상으로 인플루엔자 A 바이러스의 바이러스 성 조류 인간 또는 murine 단일 클론 항 체의 바인딩을에 필요한 중요 한 잔류물을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 다른 바이러스 표면 glycoproteins 그리고 그들의 해당 중화 항 체에 적용할 수 있습니다.

인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

인플루엔자 중화 항 체는 인플루엔자 감염의 보호와 연관. Microneutralization 분석 실험 인간 혈 청의 중화 항 체를 측정 하 고 자주 독감 인간의 혈 청 학에 대 한 사용 됩니다. 인플루엔자 예방 접종 또는 감염 다음 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 측정 MDCK-SIAT1 세포를 사용 하 여 microneutralization 분석 결과 설명 합니다.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

이 프로토콜은 2개의 인플루엔자 A 긴장에서 봉투 당단백질을 가진 높은 역가 감염성 바이러스성 의사 입자 (pp)를 생성하는 실험 적인 프로세스및 그들의 감염성을 결정하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 봉투 당단백질을 가진 봉투바이러스의 그밖 모형의 pps를 개발하기 위하여 높게 적응합니다.

고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산

유사형 바이러스(PV)는 실제 바이러스를 취급하는 것보다 더 안전한 조건에서 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 복제 결함 바이러스입니다. 여기에 제시된 자세한 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV를 사용하여 COVID-19 백신 접종 후 환자 혈청의 중화 능력을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

이 프로토콜은 감염된 오리에서 기억 T 세포를 분리하여 시험 관 내에서 조류 T 세포를 배양하는 방법을 설명하며, 이를 통해 고도로 정제된 특정 오리 T 세포를 생성할 수 있습니다. 또한 오리 T 세포에서 IFN-γ 분비를 정확하게 측정하기 위해 세포 내 사이토카인 염색(ICS) 방법이 확립되었습니다.

체외(In Vitro ) H5N1 특이적 덕 T 세포 배양 및 세포 내 사이토카인 염색 방법을 사용한 면역 반응 검출

배우세요 H5 조류 인플루엔자 수도바이러스 제조 및 항체 중화 활성 측정 방법을 HEK293 FT 세포와 칼슘 인산염 전염을 이용하여. 이 프로토콜은 백신 효능 연구에 필수적인 면역 반응 분석을 가능하게 합니다.

Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정

더 많은 동영상 탐색