Name: 조직에서 단백질 및 RNA 발현의 공간 프로파일링: 가상 미세 해부를 미세 조정하는 접근 방식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 학습하세요 공간 오믹스 기술에서 관심 영역 선택을 자동화하여 조직과 특정 세포 집단의 특성화를 개선하는 방법을. 이 프로토콜은 단백질체학 및 전사체학 분석의 재현성과 정확도를 높여줍니다.

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저자는 NGS 파일을 처리 한 Thomas Wu를 인정합니다. 결과 토론과 원고 검토에 대해 James Ziai와 내부 원고 수정을 위해 Meredith Triplet과 Rachel Taylor에게 감사드립니다.

모든 인체 조직은 적절한 기관 검토 위원회의 승인과 정보에 입각한 동의를 얻었다는 보증에 따라 상업용 바이오뱅크 또는 공인 조직 은행에서 획득했습니다.
참고: 프로토콜은 디스커버리 울트라 및 GeoMx 디지털 공간 프로파일러를 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 시약, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 공간 단백질체학 분석을 위한 자동화된 시각화 프로토콜
<ol><li>형광 시각화 항체를 적용하기 위한 프로그램 자동염색기<ol><li>오토스테이너 소프트웨어에서 홈 버튼을 클릭하고 프로토콜을 선택합니다. 그런 다음 프로토콜 만들기/편집을 클릭하고 절차로 RUO 디스커버리 유니버설 을 선택합니다.</li>
		<li>Depar v2> 탈파라핀화를 > 첫 번째 시퀀스를 클릭합니다. 중간 온도의 경우 72°C를 선택한 다음 전처리를 클릭하고 셀 컨디셔닝 및 CC1 저장소를 선택합니다. 매우 높은 온도의 경우 100°C를 선택한 다음 CC1 8분을 클릭하고 CC1 64분이 선택될 때까지 계속 클릭합니다.</li>
		<li>억제제 > DISCOVERY 억제제를 클릭하고 배양 시간으로 8분을 선택합니다. 그런 다음 항체 > 고온 Ab 배양; 저온의 경우 37°C를 선택합니다. 항체의 경우 디스펜서 레이블에서 항체 번호를 선택합니다(이 예에서는 항체 6). 플러스 배양 시간에서 32분을 선택합니다. 참고: 이 프로토콜에는 세 가지 다른 항체 번호가 있습니다. 첫 번째 항체는 FAP, 두 번째 항체는 범 사이토 케라틴, 세 번째 항체는 항체 X입니다.</li>
		<li>다량체 HRP > 다량체 HRP 차단기를 클릭한 다음 항체 차단에서 Gt Ig 차단을 선택하고 배양 시간에 4분을 선택합니다. 다음으로 다량체 HRP 시약에서 OMap 항-Rb HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 Cy5를 클릭하고 긴 배양 시간에 대해 0시간 8분을 선택합니다.</li>
		<li>이중 서열을 클릭하고 항체 변성을 선택한 다음 항체 변성 CC2-1을 선택하고 매우 높은 온도의 경우 100°C를 선택합니다. 배양 시간이 8 분인지 확인하십시오. 그런 다음 DS 억제제를 클릭하고 중화를 선택합니다.</li>
		<li>DS 항체를 클릭하고 매우 낮은 온도의 경우 37°C를 선택합니다. 그런 다음 항체의 디스펜서 레이블(이 예에서는 항체 3)에서 항체 번호를 선택하고 플러스 배양 시간에 대해 32분을 선택합니다.</li>
		<li>DS 멀티머 HRP를 클릭하고 DS 멀티머 HRP 차단기를 선택합니다. 그런 다음 항체 차단에서 Gt Ig 차단을 선택하고 배양 시간으로 4분을 선택합니다. 다음으로, 다량체 HRP 시약에서 OMap 안티-MS HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 DS Rhodamine 6G를 클릭하고 긴 배양 시간에 대해 0 시간 8 분을 선택하십시오.</li>
		<li>삼중 염색을 클릭하고 TS 항체 변성을 선택한 다음 항체 변성 CC2-2를 선택하고 매우 높은 온도의 경우 100°C를 선택합니다. 배양 시간이 8 분인지 확인하십시오. 그런 다음 TS 억제제를 클릭하고 TS 중화를 선택합니다.</li>
		<li>TS 항체를 클릭하고 매우 낮은 온도의 경우 37°C를 선택합니다. 그런 다음 항체의 디스펜서 레이블(이 예에서는 항체 7)에서 항체 번호를 선택하고 플러스 배양 시간에 대해 32분을 선택합니다.</li>
		<li>TS 멀티머 HRP를 클릭하고 TS 멀티머 HRP 차단기를 선택합니다. 그런 다음 항체 차단에서 Gt Ig 차단을 선택하고 배양 시간으로 4분을 선택합니다. 다음으로 다량체 HRP 시약에서 OMap 항-Rb HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 TS FAM을 클릭하고 긴 배양 시간에 대해 0시간 8분을 선택합니다.</li>
		<li>프로토콜에 제목을 추가합니다. 프로토콜 번호를 선택하고 주석을 추가한 다음 활성 을 클릭한 다음 저장을 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>슬라이드 준비, 라벨 인쇄, 오토스테이너 실행 시작<ol><li>베이킹 공급업체는 70°C로 설정된 오븐에서 20-60분 동안 FFPE(포르말린 고정, 파라핀 매립) 인체 조직 절편을 조달했습니다. 슬라이드가 베이킹되는 동안 오토스테이너 소프트웨어에서 라벨 만들기를 클릭하여 라벨 을 인쇄합니다. 그런 다음 프로토콜을 클릭하고 프로토콜 번호를 선택한 다음 닫기/인쇄를 클릭합니다. 슬라이드 레이블에 관련 정보를 추가하고 인쇄를 클릭합니다.</li>
		<li>오븐에서 슬라이드를 꺼내 실온(RT)으로 식힙니다. 이전에 인쇄한 프로토콜 레이블을 해당 슬라이드에 적용합니다.</li>
		<li>리필 가능한 항체 디스펜서에 단계 1.1에 할당된 항체 라벨 번호에 따라 항체를 로드합니다. 이 프로토콜에서는 1 μg/mL에서 FAP에 항체 6을 사용하고, 0.1 μg/mL에서 범사이토케라틴에 항체 3을 사용하고, 2.5 μg/mL에서 항체 X에 항체 7을 사용합니다. 지정된 희석제에 각 항체를 희석하고 리필 가능한 항체 디스펜서를 프라이밍합니다.</li>
		<li>위에서 언급한 차단, 검출 및 증폭 미리 채워진 시약 디스펜서를 수집하여 시약 트레이에 놓습니다. 슬라이드 트레이에 슬라이드를 로드하고(실행당 최대 30개의 슬라이드) 실행을 클릭한 다음 예를 클릭합니다. DAPI는 핵 카운터 염색에 사용되지 않습니다.</li>
		<li>오토스테이너 소프트웨어에서 실행 시간을 확인하여 실행 시작을 확인합니다. 프로토콜은 완료하는 데 ~11시간이 걸리며 밤새 실행할 수 있습니다.</li>
		<li>다음 날, 슬라이드 트레이 슬롯에서 녹색으로 깜박이는 표시등을 관찰하여 실행 완료를 확인하십시오. 그런 다음 기기에서 슬라이드를 꺼내고 액체 커버슬립 용액이 완전히 제거될 때까지 1x 반응 버퍼에서 슬라이드를 세게 헹굽니다.</li>
	</ol></li>
	<li>단백질체학 분석을 위한 공간 프로파일링 플랫폼 프로토콜<ol><li>아래 메모에 표시된 공간 단백질체학 프로토콜을 따르십시오. 3-plex 자동 레이블 지정 절차를 활성화하기 위해 프로토콜에 다음 변경 사항을 포함합니다.</li>
		<li>공간 단백질체학 프로토콜을 시작하기 전날 1.2.1-1.2.6단계를 수행하고 1.2.6단계를 수행한 후 공간 단백질체학 프로토콜의 항원 검색 단계로 바로 이동합니다. 공간 프로파일링 단백질체학 프로토콜에 설명된 시각화 절차를 생략합니다.</li>
		<li>형광단 통합을 가능하게 하기 위해 5000nM에서 SYTO 13을 SYTO 64로 대체하십시오. SYTO 64를 1x TBS로 희석하고 습도 챔버에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>공간 프로파일링 플랫폼에서 스캔 매개변수를 설정할 때 시각화 패널에 사용된 형광단에 따라 필터와 초점 채널을 선택하여 3-plex 통합을 허용합니다. 디스커버리 FAM 에 FITC를 사용하고 노출을 200ms로 설정하고, 디스커버리 로 다민 6G 에 Cy3를 사용하고 노출을 200ms로 설정하고, SYTO 64 에 텍사스 레드를 사용하고 노출을 50ms로 설정하고(초점 채널로 지정), 마지막으로 디스커버리 Cy5에 Cy5를 사용하고 노출을 200ms로 설정하고, 변경 사항을 저장합니다. 참고: 공간 프로파일링 단백질체학 프로토콜에 대한 자세한 지침은 공식 웹사이트 지원 탭에서 문서 > 사용자 설명서를 선택하여 찾을 수 있습니다. 여기에서 본드 RX를 사용하여 nCounter에 대한 단백질 프로토콜을 찾으십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 공간 전사체학 분석을 위한 ROI 선택
<ol><li>FFPE 셀 펠릿 섹션을 70°C로 설정된 오븐에서 20-60분 동안 굽습니다. 아래 참고에 표시된 공간 프로파일링 플랫폼 NGS 프로토콜을 따르고 공간 프로파일링 플랫폼에서 슬라이드를 스캔하여 50μm 및 300μm 크기를 선택합니다. 공간 전사체학 분석에 대해 다음 권장 사항이 강조 표시됩니다.<ol><li>라이브러리를 준비할 때 다양한 크기의 ROI를 선택한 경우 비슷한 크기의 ROI를 함께 모아 크기당 하나의 라이브러리를 만듭니다. 이는 크기의 편향 없이 모든 ROI에 대해 충분한 시퀀싱 깊이가 달성되도록 하기 위한 것입니다. 참고: 공간 프로파일링 플랫폼에 대한 자세한 지침은 공식 웹사이트 지원 탭에서 문서 > 사용자 설명서를 선택하여 찾을 수 있습니다. 여기에서 Bond RX를 사용하는 NGS 애플리케이션을 위한 RNA 프로토콜을 찾으십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Nerurkar, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+spatial+profiling+of+cancer+tissues+in+the+era+of+immunotherapy%3A+The+potential+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise.</a> Cancers. 12 (9), 2572(2020).</li>
<li>Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+pathology%3A+a+user%27s+review+of+a+highly+multiplexed+method+for+in+situ+analysis+of+protein+and+RNA+expression+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue.</a> Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).</li>
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<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf</a> (2022).</li>
<li>McCart Reed, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+application+in+breast+cancer%3A+a+user%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%3A+An+International+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective.</a> Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).</li>
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<li>Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: 
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<li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+geomx+spatial+profiler%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456(2021).</li>
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</ol>

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan, Sandra Rost는 Roche Group의 일원 인 Genentech의 직원이자 주주입니다. Roche의 일부인 다른 회사는이 원고에 사용 된 시약과 도구를 생산합니다. Ciara Martin은 이 원고에 사용된 시약과 기기를 생산하는 NanoString Technologies Inc의 정규직 직원입니다.

현재까지, 수동 프로토콜에서 직접 접합된 형광 항체는 공간 단백질체학 또는 공간 전사체학 분석(9,10)을 위한 시각화 패널로서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 직접 접합된 형광 항체의 사용은 덜 풍부한 마커에 대해 도전적일 수 있으며, 적합한 항체의 선택을 제한할 수 있다. 이 프로토콜은 공간 단백질체학 분석을 지원하기 위해 TSA 기술을 사용하는 자동화된 염색 플랫폼에서 시각화 마커의 라벨링을 자동화할 수 있음을 보여줍니다. 이를 통해 시각화 패널의 사용자 정의에 더 많은 유연성을 허용하여 조직의 특정 영역에서 관련 생물학적 데이터를 보다 표적화된 ROI 선택 및 획득할 수 있습니다. TSA 기술은 또한 낮은 존재비 마커의 시각화를 허용하여 잠재적으로 적합한 항체의 수를 증가시킵니다. 또한 시각화 프로토콜의 자동화는 라벨링 절차의 재현성과 품질을 보장합니다.
3-ple...

멀티플렉싱 기술의 발전은 종양에 존재하는 표적에 대해 더 나은 특성화 도구를 계속 제공합니다. 종양 미세환경(TME)은 종양 세포, 침윤 면역 세포 및 기질의 복잡한 시스템으로, 공간정보는 관심 바이오마커 간의 상호 작용 메커니즘을 더 잘 이해하고 해석하는 데 중요합니다1. GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP) 및 10x Visium과 같은 새로운 기술을 통해 공간 컨텍스트 내에서 여러 대상을 동시에 감지하고 정량화할 수 있습니다. 조직 시각화를 용이하게 하는 면역형광 프로토콜을 사용하면 이러한 기술의 공간 프로파일링 기능을 더욱 향상시킬 수 있습니다.
이 방법 개발을 위해 집중한 Spatial Omics 기술은 UV 민감성 광절단 링커를 통해 올리고뉴클레오티드가 항체 또는 RNA 프로브에 부착되는 공간 단백질체학 및 전사체학 분석으로 구성됩니다. 조직학적 슬라이드는 이러한 올리고-접합된 항체 또는 프로브로 표지된 다음 공간 프로파일링 플랫폼에서 이미지화됩니다. 다음으로, 조명을 위해 다양한 크기와 모양의 ROI를 선택하고, 광절단된 올리고뉴클레오티드를 흡인하여 96웰 플레이트에 수집합니다. 광절단 올리고뉴클레오티드는 나노스트링 nCounter 시스템 또는 차세대 염기서열분석(NGS)2,3(그림 1)4,5로 정량할 수 있도록 준비됩니다.
세포 분포는 조직 내에서 다양하며, 선택된 마커와 다양한 ROI 크기를 사용하여 세포의 특정 위치를 특성화하는 능력은 조직 환경을 완전히 이해하고 특정 특징을 식별하는 데 매우 중요합니다. 여기에 언급된 Spatial Omics 기술에서 표준 시각화 프로토콜은 직접 접합 항체를 사용하며 수동 프로토콜입니다. 종양과 기질을 구별하는 표준 마커는 panCytokeratin (panCK) 및 CD45 6,7이지만 관심있는 특정 세포 집단을 표적으로 삼기 위해서는 추가 마커가 필요합니다. 또한, 직접 접합된 형광 항체의 사용은 증폭이 부족하여 항체 선택을 풍부한 마커로 제한합니다. 또한 수동 분석은 자동화된 워크플로우보다 더 가변성이 있습니다8. 따라서, ROI 선택을 위한 커스터마이징, 자동화 및 증폭된 시각화 프로토콜을 갖는 것이 바람직하다.
여기에서 이 연구는 공간 단백질체학 분석의 경우 TSA 기술을 자동화된 플랫폼의 시각화 프로토콜에 사용하여 보다 표적화되고 표준화된 분석을 수행할 수 있음을 보여줍니다. 또한 TSA 기반 분석을 통해 저발현 마커를 사용할 수 있으므로 시각화를 위해 선택할 수 있는 표적의 범위가 늘어납니다. panCK, FAP 및 항체 X에 대한 3-plex 분석은 panCK 및 FAP를 사용하여 각각 종양과 기질을 구별하는 자동화 플랫폼을 사용하여 개발되었습니다. 항체 X는 종양에서 자주 발생하는 기질 단백질이지만 생물학과 항 종양 면역에 미치는 영향은 완전히 이해되지 않았습니다. 항체 X가 풍부한 영역에서 면역 질감을 특성화하면 항 종양 면역 및 치료 반응에서의 역할과 약물 표적으로서의 잠재력을 설명 할 수 있습니다.
맞춤형 자동 TSA 시각화 패널이 공간 단백질체학 분석에 성공한 것으로 입증되었지만 공간 전사체학 분석에 대한 이러한 분석의 적용은 확인할 수 없었습니다. 이는 RNA 무결성을 손상시키는 것으로 보이는 자동화된 시각화 프로토콜에 사용되는 시약과 프로토콜 때문일 가능성이 큽니다. 시각화 마커에 대한 자동 라벨링 프로토콜은 공간 단백질체학 분석에는 사용할 수 있지만 공간 전사체학 분석에는 사용할 수 없다는 사실을 인식하면 공간 오믹스 기술 분석 설계에 대한 중요한 지침을 제공합니다.
또한이 연구는 공간 전사체학 분석을 사용하여 직경이 50μm만큼 작은 영역 또는 약 15 개의 세포에서 표적을 프로파일 링 할 수 있음을 보여줍니다. 작은 ROI에서 전사체를 검출하는 분석의 능력을 테스트하기 위해 두 가지 다른 크기의 ROI가 선택되었습니다. 각 관심 영역에 대해 1,800개의 mRNA 표적에 해당하는 올리고를 수집하여 공간 프로파일링 플랫폼 프로토콜에 따라 라이브러리로 만들었습니다. 라이브러리는 개별적으로 인덱싱되고, 이후에 풀링되고, 순서가 지정되었습니다. 이를 통해 풀링 효율성과 작은 ROI에서 특정 세포 집단을 식별하는 능력을 모두 평가할 수 있었습니다.
이 논문은 공간 단백질체학 분석의 경우 관심 있는 특정 마커에 대한 ROI 선택을 안내하는 자동화된 프로토콜을 사용하여 관련 조직 영역의 질문을 선택적으로 타겟팅하고 조직의 공간 환경을 특성화할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 특정 세포 집단을 검출하고 특성화하기 위한 공간 전사체 분석에 더 작은 ROI를 사용할 수 있음을 입증합니다.

<table><tbody><tr><td>10x Tris 완충 식염수(TBS)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>12498S</td>, <td>DEPC 처리수에서 1x TBS로 희석</td></tr><tr><td>항체 X(미공개)</td><td></td><td></td><td>항체 기밀성으로 인해 맹검</td></tr><tr><td>DEPC 처리수</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>다른 하나를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)</td><td>Ventana</td><td>950-500</td><td></td></tr><tr><td>DISCOVERY Cy5 Kit</td><td>Ventana</td><td>760-238</td> Refer as <td>Cy5</td></tr><tr><td>DISCOVERY FAM Kit</td><td>Ventana</td><td>760-243</td> Refer <td>as FAM</td></tr><tr><td>DISCOVERY Goat ig block</td><td>Ventana</td><td>760-6008</td><td>Refer as Gt ig block</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4310</td><td>Refer as OMap anti-Ms HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4311</td><td>OMap anti-Rb HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY Rhodamine 6G Kit</td><td>Ventana</td><td>760-244</td><td>Rhodamine 6G</td></tr><tr><td>DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System</td><td>Ventana</td><td>05 987 750 001 / N750-DISU-FS</td><td>원고에 autostainer로 표기</td></tr><tr><td>FAP [EPR20021] 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab207178</td><td></td></tr><tr><td>GeoMx Digital Spatial Profiler</td><td>NanoString</td><td>GMX-DSP-1Y</td><td>원고에서 공간 프로파일링 플랫폼이라고 하는</td></tr><tr><td>습도 챔버</td><td>Simport</td><td>M920-2</td> 다른 하나는 Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] 항체 Abcam Ab27988 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python</td><td></td><td>Statistical analysis</td></tr><tr><td>Reaction Buffer (10x)를</td> 사용할 수 있습니다.<td>Ventana</td><td>950-300</td><td></td></tr><tr><td>통계 분석 소프트웨어</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>통계 분석</td></tr><tr><td>SYTO 64</td><td>ThermoFisher</td><td>S11346</td><td></td></tr><tr><td>ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)</td><td>Ventana</td><td>950-223</td><td></td></tr><tr><td>Ventana 항체 희석제와 카제인</td><td>Ventana</td><td>760-219</td><td>원고</td></tr><tr><td>에 명시된 희석제로 표기Ventana 1차 항체 디스펜서</td><td>Ventana</td><td></td><td>카탈로그 번호는 디스펜서 번호에 따라 다릅니다</td></tr></tbody></table>.

조직에서 단백질 및 rna 발현의 공간 프로파일링: 가상 미세 해부를 미세 조정하는 접근 방식

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

멀티플렉싱을 사용하면 동일한 조직에서 여러 마커를 평가하는 동시에 공간적 맥락을 제공할 수 있습니다. Spatial Omics 기술은 각각 광절단 가능한 올리고 태그 항체와 프로브를 활용하여 단백질과 RNA 멀티플렉싱을 모두 가능하게 합니다. 올리고는 조직 전체의 특정 영역에서 절단되고 정량화되어 기본 생물학을 설명합니다. 여기에서 이 연구는 자동화된 맞춤형 항체 시각화 프로토콜을 활용하여 공간 단백질체학 분석과 함께 ROI 선택을 안내할 수 있음을 보여줍니다. 이 특정 방법은 공간 전사체학 분석에서 허용 가능한 성능을 나타내지 않았습니다. 이 프로토콜은 티라마이드 신호 증폭(TSA)을 사용하여 주어진 단백질 표적의 형광 신호를 증폭하고 선택할 수 있는 항체 풀을 늘리는 자동화된 플랫폼에서 마커 시각화를 위한 3-plex 면역형광(IF) 분석의 개발을 설명합니다. 시각화 프로토콜은 품질과 재현성을 보장하기 위해 철저히 검증된 3-plex 분석을 사용하여 자동화되었습니다. 또한 공간 프로파일링 플랫폼에서 TSA 기반 IF 분석의 이미징을 허용하도록 SYTO 염료에 대한 DAPI의 교환을 평가했습니다. 또한 공간 전사체학 분석을 사용하여 작은 ROI를 선택하여 매우 특정한 관심 영역(예: 주어진 세포 유형에 대해 풍부한 영역)을 조사할 수 있는 능력을 테스트했습니다. 50 μm 및 300 μm 직경의 ROI를 수집하였으며, 이는 각각 대략 15 개의 세포 및 100 개의 세포에 해당한다. 샘플을 라이브러리로 만들고 시퀀싱하여 조직의 작은 ROI 및 프로파일 특이적 영역에서 신호를 감지하는 기능을 조사했습니다. 우리는 공간 단백질체학 기술이 ROI 선택을 안내하는 자동화되고 표준화된 프로토콜의 이점을 크게 활용한다고 판단했습니다. 이 자동화된 시각화 프로토콜은 공간 전사체학 분석과 호환되지 않았지만 표준 수동 시각화 프로토콜을 사용하여 작은 ROI에서도 특정 세포 집단을 성공적으로 검출할 수 있는지 테스트하고 확인할 수 있었습니다.

ROI 선택을 안내하는 자동화된 시각화 프로토콜 이 백서에서는 자동화된 맞춤형 TSA 기반 IF 프로토콜을 사용하여 조직을 시각화하고 특정 ROI를 선택하는 방법을 소개합니다. 흑색종과 인간 정상 피부를 대조군 조직으로 사용하는 시각화 패널 개발은 에피토프 안정성 테스트, 마커 강도의 미세 조정 및 대조군을 배제한 출혈 평가로 구성되었습니다. 항체의 에피토프 안정성이 반복적인 용리 단계에 의해 영향을 받는지 시험하기 위해, FAP 및 항체 X 신호를 3-플렉스의 각 위치에서 표지한 후 정성적으로 평가하였다. 항체 X 신호는 모든 위치에서 일관되게 유지된 반면, FAP 신호 강도는 1회 용리 후 감소했습니다(그림 2). 이전의 내부 연구에 따르면 panCK 에피토프는 3-plex 분석 전반에 걸쳐 안정적입니다. 따라서, FAP는 3-플렉스에서 1번째 위치에, panCK는 2번째에, 항체 X는 3번째위치에 위치하도록...

여기에서는 종양 미세 환경을 더 잘 특성화하고 특정 세포 집단을 식별하기 위해 Spatial Omics 기술의 관심 영역(ROI)을 미세 조정하는 프로토콜을 설명합니다. 단백질체학 분석의 경우 자동화된 맞춤형 프로토콜이 ROI 선택을 안내할 수 있는 반면, 전사체학 분석은 50μm의 작은 ROI를 활용하여 미세 조정할 수 있습니다.

조직에서 단백질 및 RNA 발현의 공간 프로파일링: 가상 미세 해부를 미세 조정하는 접근 방식

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

이 프로토콜은 공간 오믹스 기술에 대한 관심 영역의 선택을 안내하는 데 도움이 되며, 이를 통해 조직 또는 세포 집단의 보다 표적화된 특성을 분석할 수 있습니다. 단백질체학 분석에서 ROI 선택을 위한 자동화된 프로토콜은 수동 프로토콜보다 더 강력하고 재현성이 있으며, 전사체학 분석에 50마이크로미터 ROI를 사용하면 특정 세포 집단의 프로파일링이 가능합니다. 형광 시각화 항체를 적용하기 위해 오토염색기를 프로그래밍하는 것으로 시작하십시오.오토스테이너 소프트웨어에서 홈 버튼을 클릭하고 프로토콜을 선택합니다. 그런 다음 프로토콜 만들기/편집을 클릭하고 절차로 RUO 검색 유니버설을 선택합니다. 첫 번째 시퀀스를 클릭한 다음 Deparaffinazation을 선택한 다음 Depar v2를 선택합니다.중간 온도의 경우 섭씨 72도를 선택한 다음 전처리를 클릭하고 셀 컨디셔닝 및 CC1 저장소를 선택합니다. 매우 높은 온도의 경우 섭씨 100도를 선택한 다음 CC1 8분을 클릭하고 CC1 64분이 선택될 때까지 계속 클릭합니다. 억제제를 클릭한 다음 DISCOVERY 억제제를 선택하고 배양 시간으로 8분을 선택합니다.그런 다음 항체를 클릭한 다음 고온 항체 배양을 클릭합니다. 저온의 경우 섭씨 37도를 선택합니다. 항체의 경우 디스펜서 라벨에서 항체 6을 선택합니다.플러스 배양 시간으로 32분을 선택합니다. 멀티머 HRP를 클릭한 다음 멀티머 HRP 차단기를 선택합니다. 그런 다음 항체 차단의 경우 Gt Ig 차단을 선택합니다.그리고 배양 시간에 대해 4분을 선택합니다. 다음으로, 다량체 HRP 시약에서 OMap Anti-Rb HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 Cy5를 클릭하고 긴 배양 시간에 대해 0 시간, 8 분을 선택하십시오.이중 서열을 클릭하고 항체 변성을 선택합니다. 그런 다음 항체 변성 CC2-1을 선택하고 매우 높은 온도의 경우 섭씨 100도를 선택합니다. 배양 시간이 8 분인지 확인하십시오.그런 다음 DS 억제제를 클릭하고 중화를 선택합니다. DS 항체를 클릭하고 매우 낮은 온도의 경우 섭씨 37도를 선택합니다. 그런 다음 항체의 디스펜서 레이블에서 항체 3을 선택합니다.플러스 배양 시간으로 32분을 선택합니다. DS 멀티머 HRP를 클릭하고 DS 멀티머 HRP 차단기를 선택합니다. 그런 다음 항체 차단에서 Gt Ig 차단을 선택하고 배양 시간으로 4분을 선택합니다.다음으로, 다량체 HRP 시약에서 OMap 안티-MS HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 DS Rhodamine 6G를 클릭하고 긴 배양 시간에 대해 0 시간, 8 분을 선택하십시오. 삼중 염색을 클릭하고 TS 항체 변성을 선택한 다음 항체 변성 CC2-2를 선택하고 극저온의 경우 섭씨 100도를 선택합니다.배양 시간이 8 분인지 확인하십시오. 그런 다음 TS 억제제를 클릭하고 TS 중화를 선택합니다. TS 항체를 클릭하고 매우 낮은 온도의 경우 섭씨 37도를 선택합니다.그런 다음 항체의 디스펜서 레이블에서 항체 7을 선택하고 플러스 배양 시간으로 32분을 선택합니다. TS 멀티머 HRP를 클릭하고 TS 멀티머 HRP 차단기를 선택합니다. 그런 다음 항체 차단에서 Gt Ig 차단을 선택하고 배양 시간으로 4분을 선택합니다.다음으로 다량체 HRP 시약에서 OMap Anti-Rb HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 TS FAM을 클릭하고 긴 잠복기에 대해 0시간, 8분을 선택합니다. 저장을 클릭하고 프로토콜에 제목을 추가합니다.프로토콜 번호를 선택하고 주석을 추가한 다음 Active(활성)를 클릭한 다음 Save(저장)를 클릭합니다. 공급업체에서 조달한 포르말린 고정 파라핀이 내장된 인체 조직 절편을 섭씨 70도로 설정된 오븐에서 20-60분 동안 굽습니다. 슬라이드가 베이킹되는 동안 오토스테이너 소프트웨어에서 라벨 만들기를 클릭하여 라벨을 인쇄합니다.그런 다음 프로토콜을 클릭하고 프로토콜 번호를 선택한 다음 닫기/인쇄를 클릭합니다. 슬라이드 레이블에 관련 정보를 추가하고 인쇄를 클릭합니다. 오븐에서 슬라이드를 제거하고 실온으로 식히십시오.이전에 인쇄한 프로토콜 레이블을 해당 슬라이드에 적용합니다. 리필 가능한 항체 디스펜서에 항체 라벨 번호에 따라 항체를 로드합니다. 지정된 희석제에 각 항체를 희석하고 리필 가능한 항체 디스펜서를 프라이밍합니다.차단, 검출 및 증폭 미리 채워진 시약 디스펜서를 수집하여 기기 시약 트레이에 놓습니다. 슬라이드 서랍에 슬라이드를 로드하고 실행 중을 클릭한 다음 예를 클릭합니다. 오토스테이너 소프트웨어에서 실행 시간을 확인하여 실행 시작을 확인합니다.다음 날, 슬라이드 서랍 슬롯에서 녹색으로 깜박이는 표시등을 관찰하여 실행 완료를 확인하십시오. 그런 다음 기기에서 슬라이드를 꺼내고 액체 커버 슬립 용액이 완전히 제거될 때까지 1x 반응 버퍼에서 슬라이드를 세게 헹굽니다. 형광단 통합을 가능하게하기 위해 5, 000 나노 몰에서 SYTO 13을 SYTO 64로 대체하십시오.SYTO 64를 1x TBS로 희석하고 습도 챔버에서 15분 동안 배양합니다. 디스커버리 팸에 FITC를 사용하고 노출을 200밀리초로 설정합니다. 디스커버리 로다민 6G에 Cy3를 사용하고 노출을 200밀리초로 설정합니다.SYTO 64에 텍사스 레드를 사용하고 노출을 50밀리초로 설정합니다. 초점 채널로 SYTO 64를 지정하고 마지막으로 검색 Cy5에 Cy5를 사용합니다. 노출을 200밀리초로 설정하고 변경 사항을 저장합니다.포르말린 고정 파라핀 포매 세포 펠릿 섹션을 섭씨 70도로 설정된 오븐에서 20-60분 동안 굽습니다. 공간 프로파일링 플랫폼에서 슬라이드를 스캔하고 50마이크로미터와 300마이크로미터 크기를 선택합니다. 자동화된 시각화 프로토콜은 인접 채널에서 블리드가 없는지 확인하기 위해 하나의 컨트롤을 남겨 두어 개발되었습니다.공간 단백질체학 분석에 포함된 모든 마커의 로그 2 히트 맵은 검정색의 수동 범사이토케라틴 CD 45 프로토콜과 회색의 자동화된 3-플렉스 프로토콜을 비교하여 0.88의 Spearman R 값을 보여줍니다. 분석에 사용된 31개의 항체 중 23개의 항체는 0.5 이상의 Spearman R 값을 가졌다. 공간 전사체학 분석에 포함된 선택된 표적의 로그 2 히트맵은 검은색의 수동 범사이토케라틴 CD 45 프로토콜과 회색의 3-plex 자동화 프로토콜을 비교한 결과, 이러한 값의 차이를 보여주었습니다.3-plex 자동 시각화 프로토콜에 대한 시퀀싱 데이터는 범 사이토 케라틴 CD 45 수동 시각화 프로토콜과 비교할 때 더 낮은 값을 나타 냈으며, 이는 0.15의 낮은 Spearman R 값에도 반영됩니다. 또한 3-plex 시각화 자동화 프로토콜을 사용할 때 동적 범위의 손실이 관찰되었습니다. 공간 전사체학 프로토콜에서 작은 ROI의 검출은 50 마이크로미터에서 관심의 원형 영역의 선택에 의해 수행되었고, 상이한 세포주에서 선택된 표적에 대한 300 마이크로미터 직경의 RNA 카운트는 정규화 후 두 관심 영역 크기 간에 비교되었다.자동화된 시각화 패널을 위한 이 프로토콜은 공간 단백질체학 질문에 답하기 위해 ROI를 정확하게 정의하는 패널을 개발하기 위해 마커를 교환하여 연구원이 조정할 수 있습니다.

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Research

연구

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Cancer Research

암 연구

레이저 microdissection은 현지화된 RNAi를 받게 Drosophila 날개 디스크의 특정 구획에있는 유전자 발현 프로 파일링을 분석에...

레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

우리는 사구체, 근위 관, 두꺼운 상승 사지, 수집 덕트 및 간질염을 포함하여 인간 신장의 하위 세그먼트의 레이저 미세 절제에 대한 프로토콜을 설명합니다. RNA는 얻어진 구획및 RNA 시퀀싱으로부터 분리되어 각 하위 세그먼트 내의 전사 서명의 변화를 결정한다.

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망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

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이 기사에서는 조직 구조를 보존하면서 다양한 전사체의 고해상도 매핑을 가능하게 하는 Stereo-seq를 사용하여 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편에서 숙주, 바이러스, 진균 및 마이크로바이옴 RNA의 포괄적인 공간 전사체 프로파일링을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

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이 프로토콜에는 석회화된 혈관 표본에 대한 단계별 워크플로우가 포함되어 있습니다: 조직 취급, 탈석화, RNA 검증, 석회화 수준 검출, 그리고 Nanostring GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP)에서의 관심 영역 선택 전략. 목표는 신뢰할 수 있는 공간 전사체 분석을 위해 혈관 조직 형태와 RNA를 보존하는 포괄적인 방법을 제시하는 것입니다.

디지털 공간 프로파일링을 위한 보존된 형태와 RNA를 이용한 석회화된 동맥 준비 및 처리

이 프로토콜은 레이저 캡처 미세해부를 사용하여 파라포름알데히드 고정 및 최적 절단 온도 화합물이 포함된 마우스 간 조직의 조직학적 영역에서 RNA를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 표적 하류 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

RNA 분석을 위한 파라포름알데히드 고정 마우스 간 조직의 레이저 캡처 미세 해부

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&amp;Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

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그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

현재, 고정된 셀에 immunofluorescent 얼룩 때 단백질 식 레벨의 결정에 대 한 선택의 방법 형태학 정보도 필요 하다. 여기에 소개이 프로토콜 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry의 다른 방법을 제공 합니다.

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