Name: 2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 19 s
Description: 배우세요 신피질 발달에서 1차 섬모의 역할을 해부하는 2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델을 사용하는 방법을. 이 프로토콜은 신경 줄기세포 확장과 신경 세포 성숙 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 S.T.(ANR-17-CE16-0003-01) 및 N.B.B.(ANR-16-CE16-0011 및 ANR-19-CE16-0002-01)에 대한 국가 국립 기관 드 라 레체쉬(ANR)의 보조금에 의해 지원되었습니다. LB는 투자 d'avenir 프로그램 (ANR-10-IAHU-01)과 베텐코트 슈엘러 (MD-PhD 프로그램)에서 ANR에 의해 지원됩니다. 이매진 연구소는 투자 d'avenir 프로그램 (ANR-10-IAHU-01, CrossLab 프로젝트)에 따라 ANR의 국가 자금 지원및 두 번째 인베스트먼트 d'Avenir 프로그램 (ANR-17-RHUS-0002)의 일환으로 지원됩니다.

<ol><li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signalling+in+the+mouse+requires+intraflagellar+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins.</a> Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).</li>
<li>Goetz, S. C., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+cilium%3A+a+signalling+centre+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).</li>
<li>Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+radial+glia+in+the+outer+subventricular+zone+of+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex.</a> Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).</li>
<li>Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the human neocortex.</a> Cell. 146 (1), 18-36 (2011).</li>
<li>Nonaka-Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebral+cortex+size+and+folding+by+expansion+of+basal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors.</a> The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).</li>
<li>Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%3A+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li>
<li>Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cortex+expansion+and+folding%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned.</a> The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).</li>
<li>Spear, P. C., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+movement+during+interkinetic+nuclear+migration+is+a+two-step+process%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process.</a> Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).</li>
<li>Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).</li>
<li>Anderson, C. T., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centriole+age+underlies+asynchronous+primary+cilium+growth+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells.</a> Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).</li>
<li>Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+inheritance+of+centrosome-associated+primary+cilium+membrane+directs+ciliogenesis+after+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division.</a> Cell. 155 (2), 333-344 (2013).</li>
<li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPAP+promotes+timely+cilium+disassembly+to+maintain+neural+progenitor+pool%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool.</a> The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).</li>
<li>Higginbotham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arl13b-regulated+cilia+activities+are+essential+for+polarized+radial+glial+scaffold+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).</li>
<li>Baudoin, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangentially+migrating+neurons+assemble+a+primary+cilium+that+promotes+their+reorientation+to+the+cortical+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate.</a> Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).</li>
<li>Higginbotham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arl13b+in+primary+cilia+regulates+the+migration+and+placement+of+interneurons+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex.</a> Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).</li>
<li>Kumamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+primary+cilia+in+glutamatergic+synaptic+integration+of+adult-born+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).</li>
<li>Guadiana, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arborization+of+dendrites+by+developing+neocortical+neurons+is+dependent+on+primary+cilia+and+type+3+adenylyl+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).</li>
<li>Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+in+hereditary+cerebral+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cilia in hereditary cerebral anomalies.</a> Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).</li>
<li>Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+roles+of+primary+cilia+in+the+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161(2021).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li>
<li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 294(2013).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li>
<li>Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+standardized+and+reproducible+forebrain-type+cerebral+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li>
<li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+generating+and+using+hiPSC+derived+NPCs+for+the+study+of+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495(2015).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li>
<li>Hansen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+imaging+for+precise%2C+label-free+tracking+of+fast+biological+processes+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Pașca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+three-dimensional+human+brain+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The rise of three-dimensional human brain cultures.</a> Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).</li>
<li>Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%2C+ciliopathies+and+hedgehog-related+forebrain+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105236(2021).</li>
<li>Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+and+coordination+of+Receptor+Tyrosine+Kinase+%28RTK%29+and+Transforming+Growth+Factor+%CE%B2+%28TGF-%CE%B2%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).</li>
<li>Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling through the primary cilium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8(2018).</li>
<li>Sivitilli, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+production+of+uniform+human+cerebral+organoids+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells.</a> Life Science Alliance. 3 (5), (2020).</li>
<li>Quelennec, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+two+induced+pluripotent+stem+cell+lines+IMAGINi004-A+and+IMAGINi005-A+from+healthy+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors.</a> Stem Cell Research. 48, 101959(2020).</li>
<li>Belle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tridimensional+visualization+and+analysis+of+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tridimensional visualization and analysis of early human development.</a> Cell. 169 (1), 161-173 (2017).</li>
<li>Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience+in+the+third+dimension%3A+shedding+new+light+on+the+brain+with+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing.</a> Molecular Brain. 10 (1), 33(2017).</li>
<li>Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+clearing+and+acquisition+methods+for+3D+imaging+of+murine+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids.</a> Journal of Biological Methods. 7 (4), 141(2020).</li>
<li>Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+optical+clearing+protocol+using+2%2C2%27-thiodiethanol+for+microscopic+observation+of+fixed+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain.</a> PloS One. 10 (1), 0116280(2015).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

PC는 이제 NSPC 확장 및 약정을 포함하여 정상 뇌 피질 발달 18,19,31 동안 중요한 단계를 조절하는 주요 세포 기관으로 간주됩니다18,9,10,11,12뿐만 아니라 뉴런 마이그레이션13,14 및 시냅토발생16,17 . 동물 모델 이나 인간 태아 뇌 조직에서...

1차 섬모(PC)는 세포외 환경에서 과다한 화학 및 기계적 단서를 감지하고 트랜스포우하는 마이크로투벨계 세포기관입니다. 특히, PC는 척추동물에서 고슴도치 신호 경로의 침투를 위한 중앙 세포기관이다1,2. 대부분의 신경 세포는 오랫동안 PC를 품고 있는 것으로 나타났지만, 중추 신경계를 형성하는 이 세포기관의 기여는 오랫동안 저평가되어 왔습니다. 신구체 발달에 대한 연구는 여러 신경 줄기와 전구 세포 (NSPC)의 발견으로 이어졌으며, 모두 PC를 수용하고 있으며, 그 위치는 선조 운명 결정에 매우 중요하다고 제안되었습니다3,4,5,6,7. PC는 NSPC 확장 및 약정 8,9,10,11,12뿐만 아니라 신경 마이그레이션을 지원하는 방사형 신경교질 비계의 apicobasal 극성을 포함하여 정상적인 뇌 피질 개발에 필요한 세포 메커니즘에 중요한 것으로 나타났습니다13. 또한, PC는 피질 판14,15로의 접선 간 이동 중에 요구된다. 마지막으로, 대뇌 피질16,17에 있는 뉴런의 시냅스 연결의 확립에서 PC에 대한 역할이 제안되었습니다. 전부, 이 사실 인정은 대뇌 피질 발달의 중요한 단계에서 PC의 중요한 역할을 주장하고 뇌성 피질 발달의 근본적인 병리학 기계장치에 그들의 관여를 조사할 필요를 제기합니다.
최근 연구는 인간 모델과 동물 모델의 피질 발달 사이의 중요한 세포 및 분자 차이에 대한 이해를 크게 향상시켜 인간 모델 시스템을 개발할 필요성을 강조했습니다. 이 보기에서, 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hIPSCs)는 관련 유전 및 세포 맥락에서 질병 병발생을 연구하는 유망한 접근을 나타냅니다. 부착 된 2 차원 (2D) 세포 기반 모델 또는 신경 로제트는 개발 대뇌 피질에서 볼 수있는 것과 유사한 NSPC를 포함, 이는 올바른 apicobasal 극성을 보여주는 로제트 모양의 구조로 조직된다20,21,22. 더욱이, 3차원(3D) 배양 시스템은 인간 뇌피질 발달의 많은 특징을 재구성하는 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성을 가능하게 한다23,24,25,26. 이 두 가지 보완적인 세포 기반 모델링 접근법은 대뇌 피질의 정상 및 병리학 적 발달 중에 PC의 참여를 해부하는 흥미로운 관점을 제공합니다.
여기에서는 신경 로제트및 파생 된 NSPC뿐만 아니라 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성 및 특성화를위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 소닉 고슴도치 통로의 전도를 테스트하고 이 경로에 관련된 중요한 분자의 역학을 분석하여 NSPC에 존재하는 PC의 생체 발생 및 기능을 분석하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 대뇌 오르가노이드의 3D 조직을 활용하기 위해, 우리는 또한 전체 오르가노이드의 가벼운 시트 현미경 덕분에, 전체 오르가노이드의 가벼운 시트 현미경 덕분에, 빠른 취득을 허용하는 토토 면역 스테인드 대뇌 오르가노이드의 3D 이미징을위한 간단하고 비용 효율적인 방법을 설정, 고해상도와 전장기의 뉴런의 모든 유형에 PC를 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 150μm 자유부동 구간에 면역조직화학을 적용하여 공진스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 후속 개간 및 획득을 통해 PC 생체 발생 및 기능의 상세한 분석에 필요한 고해상도 이미지 수집을 가능하게 했습니다. 구체적으로, 3D 이미징 소프트웨어는 PC의 길이, 수 및 방향을 포함한 형태학적 매개변수의 후속 분석과 함께 PC의 3D 재구성뿐만 아니라 축사메를 따라 섬모 구성 요소의 신호 강도 측정을 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토&이아큐트; 타놀 (50 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment</td><td>Microplate Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), 무혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CellAdhere 희석 완충액</td><td>StemCell Technologies</td><td>7183</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>StemCell Technologies</td><td>72102</td><td></td></tr><tr><td>Easy Grip 35 10mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGF, 25&마이크로; g</td><td>Thermofischer</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>FGF2, 25&micro; g</td><td>Thermofischer</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>StemCell Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (1mg)</td><td>Thermofischer</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>StemCell Technologies</td><td>72147</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 성장 인자 감소</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액(100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381-250G</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>신경 기저 매체</td><td>Thermofischer</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>Dutscher</td><td>995002</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PFA 32%</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴(PO)</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 BDNF 10 &마이크로; g</td><td>줄기 세포 기술</td><td>78005</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>rSHH</td><td>R & D Systems</td><td>8908-SH</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-202814</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>StemCell Technologies</td><td>72232</td><td></td></tr><tr><td>스템비즈 FGF2</td><td>StemCulture</td><td>SB500</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td> 시<td>그마 Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 접착 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>공급&이큐트; 멘트 N2- (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>TDE 2,2'-티오디에탄올</td><td>시그마 알드리치</td><td>166782-500G</td><td></td></tr><tr><td>비트로넥틴</td><td>스템셀 테크놀로지</td>스 <td>7180</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>스템셀 테크놀로지</td>스 <td>72304</td><td></td></tr><tr><td><강력한>일차 항체</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARL13B</td><td>Abcam</td><td>Ab136648</td><td>1/200e</td></tr><tr><td>ARL13B</td><td>Proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>1/500e</td></tr><tr><td>CTIP2</td><td>Abcam</td><td>Ab18465</td><td>1/500e</td></tr><tr><td>GLI2</td><td>R& D 시스템</td><td>AF3526</td><td>1/100</td></tr><tr><td>GPR161</td><td>Proteintech</td><td>13398-1-AP</td><td>1/100</td></tr><tr><td>N-Cadherin</td><td>BD 형질전환 연구소</td><td>610921</td><td>1/500e</td></tr><tr><td>P-Vimentin</td><td>MBL</td><td>D076-3</td><td>1/500e</td></tr><tr><td>PAX6</td><td>Biolegend</td><td>PRB-278P</td><td>1/200e</td></tr><tr><td>PCNT</td><td>Abcam</td><td>Ab4448</td><td>1/1000e</td></tr><tr><td>S0X2</td><td>R& D 시스템</td><td>MAB2018</td><td>1/200e</td></tr><tr><td>SATB2</td><td>Abcam</td><td>Ab51502</td><td>1/200e</td></tr><tr><td>TBR2</td><td>Abcam</td><td>Ab216870</td><td>1/400e</td></tr><tr><td>TPX2</td><td>NovusBio</td><td>NB500-179</td><td>1/500e</td></tr><tr><td>&gamma; TUBULIN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6557</td><td>1/500e</td></tr><tr><td>Secondary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit AF488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21206</td><td>1/500e</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 AF555</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21422</td><td>1/500e</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 AF647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21236</td><td>1/500E</td></tr><tr><td>염소 안티 랫트 AF555</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21434</td><td>1/500e</td></tr></tbody></table>

2d 및 3d 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

1차 섬모(PC)는 대부분의 포유류 세포의 표면에서 튀어나온 비운동적 동적 마이크로투룰계 세포기관이다. 그(것)들은 세포 주기의 G1/G0 단계 도중 오래된 중심에서 나타나고, 세포가 G2/M 상 경계에서 세포 주기를 다시 입력할 때 분해하는 동안. 그들은 많은 세포 프로세스에 중요한 세포 외 신호를 감지하고 변환하여 신호 허브로 작동합니다. 대부분의 세포 유형과 유사하게, 모든 신코르티칼 신경줄기 및 전구 세포(NSPC)는 정상 뇌피질 발달에 필요한 특정 신호를 감지하고 변환할 수 있도록 PC를 수용하는 것으로 나타났습니다. 여기서, 신피성 발달 시 PC의 참여를 더욱 해부하기 위해 인간 유도 만능 줄기 세포(hIPSC)로부터 2차원(2D) 및 3차원(3D) 세포 기반 모델을 생성하고 특성화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 특히 소닉 고슴도치(SHH) 경로의 트랜스듀션을 포함한 2D 신경 로제트 유래 NSPC에서 PC 생체 발생 및 기능을 연구하는 프로토콜을 제시합니다. 대뇌 오르가노이드의 3차원(3D) 조직을 활용하기 위해 토토 면역스테인드 대뇌 오르가노이드의 3D 이미징을 위한 간단한 방법을 설명합니다. 광학 클리어링 후, 전체 오르가노이드를 빠르게 획득하면 전체 오르가노이드의 신코르테컬 전구및 뉴런에서 센트로좀과 PC를 모두 검출할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 3D 공간 정보의 상당한 정도를 보존하고 PC 생체 발생 및 기능의 상세한 질적 및 정량적 분석에 필요한 고해상도 획득을 허용하는 두꺼운 자유 부동 오르가노이드 섹션의 면역 염색 및 청산 절차를 자세히 설명합니다.

2D hIPS 세포 기반 모델은 1 차 적인 실륨 생물 발생 및 기능을 연구합니다 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 이전에 발표된 연구에서 20,21,22로 조정되었습니다. 이 프로토콜은 개발 신피질에서 보인 것과 유사한 신피성 전구 및 뉴런을 포함하는 신경 로제트 구조물의 생성을 허용합니다. 상세한 검증은 특정 제조자를 이용한 종래의 면역염색 분석에 의해 수행될 수 있다3. 예를 들어, apical 전구체(AP)는 SOX2 및 PAX6로 이중 염색되어야 하며, 중간 전구(IP)는 TBR2/EOMES 염색에 의해 드러나며, 초기 태어난 신코르티컬 뉴런은 CTIP2 염색(그림 1A-C</str...

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

우리가 여기에서 상세히 설명하는 절차의 전반적인 목표는 신코티컬 발달 도중 1 차적인 cilium의 참여를 해부하는 것입니다. 1 차 적인 섬모는 전조 세포 확장, 운명 결정, 신경 이동 및 성숙을 포함하여 신피성 발달의 많은 단계에 대한 결정적인 표시되었습니다. 신코르피컬 개발 중 세포 개입을 더욱 해부하기 위해 신코테컬 개발의 신흥 2D 및 3D iPS 세포 기반 모델을 활용하여 관련 도구를 설정했습니다.즉, 신경 장미와 등쪽 전뇌 오르가노이드. 3D iPS 세포 기지를 둔 모형은 배아 바디 형성으로 시작합니다. 말의 배아 체의 접착은 2D 신경 로제트 구조물의 생성을 허용하고, 이러한 EB의 자유 부동 문화는 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성을 허용합니다.대뇌 오르가노이드를 생성하기 위해 설정한 프로토콜은 이중 SMAD 억제라고도 하는 활성질 노달 및 BMP 경로의 억제제를 사용하여 도럴 전뇌 오르가노이드를 구체적으로 생성하기 위해 미리 패터닝 인자를 추가하여 재갈 방법을 사용하여 이전에 게시된 프로토콜을 기반으로 합니다. 오르가노이드의 3D 조직을 활용하기 위해 간단하고 빠른 방법을 설정하여 고해상도로 전체 오르가노이드의 총 면역 라벨링, 지우기 및 조명된 획득을 가능하게 했습니다. 그리고 1차 실륨 생물 발생 및 기능에 초점을 맞추기 위해, 우리는 진동으로 절단된 자유 부동 섹션에 면역 히스트토케화학을 적용했습니다.면모를 제거하고 절개한 후 공명 스캐닝 공초점 현미경 검사를 사용하여 이미지를 획득했습니다. iPS 세포 배양으로 시작하여 10% 미만의 분화를 나타내며 80% 이하의 규정을 준수하지 않습니다. 바늘을 사용하여 각 iPS 세포 식민지를 수동으로 해부하여 각 식민지를 수평 및 수직 방향으로 정확하게 잡을 수 있어 각 식민지를 동일한 클러스터로 나누어 체크 무늬 패턴을 만듭니다.세포 스크레이퍼를 사용하여 식민지를 분리하고 초저 부착 배양 판에 옮겨 놓습니다. 배아 체를 형성할 수 있도록 인큐베이터에서 하룻밤 동안 떠있게 하십시오. 다음 날, 배지를 돌려 배아 체를 흡인하지 않도록 주의하고, 신경 장미가 형성될 때까지 폴리 L-ornithine Laminine 코팅 요리로 옮겨넣습니다.약 12~14일이 소요됩니다. 매일 새로 고침 유도, 중간, 신경 로제트 구조의 형성에 대한 현미경에서 확인. 이 단계에서, 신경 장미는 분리된 신경 줄기 및 선천성 세포 배양을 얻기 위하여 면역 염색 분석을 위해 확장, 분화 및 처리될 수 있습니다.우선, 10% 미만의 분화를 나타내고 단층층에서 거의 한 번 통과된 대규모 일반 식민지를 수용하는 iPS 문화로 시작합니다. 0일째에 iPS 세포가 eJ2의 낮은 농도와 hiiPS 세포 생존에 필요한 고농도의 ROCK 억제제를 포함하는 EB 배지에서 배아 체를 형성하여 중간 변화 없이 3일 동안 EB 형성 인큐베이터 플레이트를 방해하지 않도록 할 수 있도록 한다. 3일째에, EB는 약 400 마이크로미터를 측정하고 정규 국경을 보여주어야 합니다.과거의 기준이 대부분의 EB에 풍부하면 이중 SMAD 억제제가 함유된 유도 배지로 배지를 변경하여 콘트라 DB를 최상의 6~7개로 밝게 하여 신경 토말리 양보를 나타냅니다. 그리고 그들은 총 요인 감소 지하 막 메트릭으로 다른 DB를 켭니다. 이 단계에서 항상 멸균 가위를 사용하여 소화체의 개구부를 사용하여 오르가노이드의 손상을 방지합니다.먼저 임상 튜브에 약 15 개의 오르가노이드를 전달합니다. EB는 유도 매체 2의 50 마이크로리터에서 배지를 정착시키고 제거하고 100 마이크로리터의 매트릭스를 포함하는 미세민감성 튜브로 유기체를 이송하고 위아래로 배관하여 균질화하게 한다. 중성 부착 판의 우물의 중앙에 혼합물을 확산.그리고 마지막으로, 그들은 융합을 피하기 위해 서로 만지지 않도록 공간 EBs. 이 물질을 인큐베이터에서 45분 동안 굳게 하고, 유도 매체 2를 각 우물에 추가하고 인큐베이터에 인큐베이션을 넣습니다. 격일로 2개의 유도 를 새로 고칩니다.17일, 지하 멤브레인 매트릭스를 5ml 파이펫으로 10회 위아래로 피펫으로 수동으로 분리합니다. 영양 흡수를 향상시키기 위해 교반 하에 번역 매체 1에서 오르가노이드 플레이트를 배양합니다. 중요한 것은, 부착 된 iPS 세포 성장에 해로운 진동을 피하기 위해 궤도 셰이커에 고정 문화와 문화에 대한 다른 인큐베이터를 사용합니다.고정 후, 투과성, 1차 및 이차 항체와의 차단 및 배큐베이션은 세척 단계를 포함하여 10 일이 걸립니다. 우리가 선호하는 청산 방법은 글리콜 유도체인 TDE에 의존합니다. 최적의 클리어링을 위해 TDE 용액의 오르가노이드를 각각 24시간 동안 점차적으로 증가시면 비가노이드를 삽관합니다.오르간성 포함의 경우, 메스를 사용하여 팁이 잘린 1ml 주사기로 만든 맞춤형 메인 몰딩 시스템을 사용하십시오. 녹는 온도는 섭씨 약 60도에 불과하기 때문에 낮은 융점 아가로스가 권장됩니다. 60% TDE 용액으로 4% 낮은 녹는 아가로즈를 준비하고 물베이스 사전 오르가노이드 포함시 섭씨 약 37도를 식힙니다.플런저를 사용하여 젤 용액의 주사기 600 마이크로리터에 넣고 샘플을 배치하고 젤 용액의 400 마이크로리터로 주사기를 채웁니다. 젤을 중합하게 하고 마지막으로, 시료는 겔 내에서 이상적으로 장착되고, 비춰진 챔버 내에서 쉽게 밀어내고 목표 앞에 오르가노이드를 배치할 수 있다. 빛형 현미경 검사는 그러한 명확한 오르가노이드의 첫번째 화상 진찰에 이상적입니다.우리는 사진 이미징을 줄이고 세포 이하 해상도의 무게를 측정했습니다. 여기서, 우리는 우리의 청산 방법의 굴절지수에 정확하게 적응할 수 있도록 샘플 챔버에 추가된 80% TDE 용액에 침수된 20배 목표를 사용했습니다. 가장 큰 샘플 순서는 시료 순서가 목표 앞에 오르가노이드를 배치하기 위해 장착되면 작동 할 수있는 플런저와 상단에서 삽입 할 수있는 1 밀리리터 주사기를 수용하도록 설계되었습니다.전체 오르가노이드를 획득하는 데 약 5~10분이 소요됩니다. 자유 부동 섹션에 면역 염색을 위해, 수집하고 섭씨 4도에서 하룻밤 4 인 분에 오르가노이드를 수정합니다. 비동기를 사용하여 비동기를 사용하여 비구를 4% 저용 아가로즈 및 섹션에 포함시켜 PBS 용액으로 전송된 6개의 섹션 중 150마이크로미터를 획득하여 페인트브러시를 사용하여 손상을 입히는 것을 방지합니다.투과 및 차단 후, 섭씨 4도에서 밤새 1 차 항체와 자유 부동 섹션을 배양하 하 고 동요 하에. 실내 온도에서 2 시간 동안 및 동요 하에 이차 항체로 잠복하기 전에 섹션을 주의 깊게 씻으면하십시오. 마지막으로, 최적의 클리어링을 위해 TDE 솔루션의 섹션을 60%TDE에서 1시간 30분 동안 점진적으로 증가한 다음 실온에서 하룻밤 사이에 80%TDE로 배양합니다.이 섹션을 섭씨 80% TDE 및 TLAC 솔루션에 섭씨 4도에 저장합니다. 세포 챔버에 프리 플로팅 섹션을 마운트하여 80%TDE 용액으로 샘플을 유지하기 위해 노력하고 임상 현미경의 전동 단계에 적응하도록 설계되었습니다. 먼저, 챔버에 둥근 커버 슬립 을 넣고 페인트 브러시를 사용하여 명확한 보호를 조심스럽게 전달합니다.챔버를 80% TDE 솔루션으로 채운 다음 표준 커버 슬립 2개와 2차 커버 슬립 1개와 실리콘 씰을 추가합니다. 마지막으로, 완벽하게 시스템을 밀봉 챔버의 나사 링에 나사. 나이트시트뿐만 아니라 공명 인수는 3D 활용을 가능하게 하는 소프트웨어와 전체 면역스테인 샘플의 분석 덕분에 처리됩니다.이러한 소프트웨어를 사용하면 우리가 생성한 거대한 데이터를 빠르게 열어 쉽게 스냅샷과 애니메이션을 만들 수 있습니다. 예를 들어, 샘플을 서로 다른 방향으로 이동할 수 있었고, 예를 들어 X, Y 및 Y, Zed등 다양한 방향으로 2D 슬라이서 도구 덕분에 이미지의 2D 뷰를 생성할 수 있습니다. 또한 이러한 소프트웨어는 중추 및 기본 섬모를 자동으로 감지하여 병리학적 대 제어 조건에서 수를 정량화할 수 있게 합니다.또한 사이트의 정확한 측정을 위해 기본 섬모의 3D 재구성을 허용합니다. 새로운 피질 발달의 2D iPS 세포 기지를 모델링하기 위해 기술한 프로토콜은 개발 중인 신피질에서 보인 것과 유사한 새로운 피질 전구 및 뉴런을 포함하는 신경 로제트 구조물의 생성을 허용합니다. 상세한 검증은 종래의 면역염색 분석에 의해 수행될 수 있다.CTIP2 양성 염색에 의해 TBI2 염색 및 초기 뼈 신피성 뉴런에 의해 중간 선조가 드러나는 동안 적용 가능한 선조는 감도에 영향을 미치기 위하여 우리와 함께 이중 염색되어야 합니다. 이러한 신경 로제트 와 같은 구조는 미토틱 스핀들을 유지하는 인양성 핵과 TBX2를 염색하는 인양성에 대하여 제기된 항체와 면역염색에 의해 시각화될 수 있는 급진적인 선조의 상호 키네틱 핵 이동을 모델링합니다. 마지막으로, 섬모발생은 1차 섬모의 후몸을 얼룩지게 하고 공리를 얼룩지게 하는 특정 수단인 pericentric에 대하여 제기된 항체로 면역염색에 의해 분석될 수 있다.이러한 로제트 구조에서, 정압 폴리 파브리 칼 선조에서 추출된 1차 섬모는 CTIP2 양성 뉴런에서 튀어나온 동안 각 심실류의 중앙 루멘 위에 조밀하게 추출된다. 아데노신경성 로제트의 해리는 1차 실륨 생체 발생 및 기능을 분석하는 데 매우 유용한 고립 된 신경 줄기 및 전구 세포 배양을 생성 할 수 있습니다. 특히, 권장음음약물 또는 삼투압작용제로 치료 후 소닉약물 경로의 유도를 시험하는 절차를 상세히 설명한다.후속 RTPCR SA는 GLI1 및 PTCH1과 같은 소닉나 약물 표적 유전자의 유도를 테스트하고, 면역 불피성 분석은 오픈 소스 도구, 일라스티크 및 CiliaQ 덕분에 정량화되는 1 차 용실을 따라 주요 음향 약물 성분의 역학을 테스트합니다. 길이 및 방향을 포함한 상이한 섬광 파라미터는 조사되지만, 1차 실륨 성분의 강도는 각각 권장된 소닉나 약물 치료에 대응하여 1차 실슘에서 수용 또는 빠져 나가는 GLI2 및 GPR161을 위해 여기에 나와 있다. 신코르피컬 개발의 3D iPS 세포 기반 모델링을 위해 자세히 설명하는 프로토콜은 기존의 면역 염색 분석 또는 여성 염색에 의해 특징지어질 수 있는 등쪽 전뇌 정체성을 가진 균일한 대뇌 오르간노이드의 생성을 허용하며, 여기에 나타난 바와 같이, 항체의 최적의 침투와 함께 N--cher cadin, PAX6, 및 CTIP2의 염색체 영역, 녹색 및 모든 신생아 신피성 뉴런과 같은 심실 영역에서 분홍색, 정색 선조, 지역과 같은 피질 판에 위치한.여기에 항체가 다시 제기 된 전체 면역 스테인 오르간노이드의 두 번째 영화입니다, CTIP2, 빨간색으로, 아마도 분홍색으로 유지, 및 TPX2, 녹색, 같은 네오코르테칼 선조의 여러 특성을 테스트 할 수 있도록, 파브리 칼 선조의 중간 키네틱 핵 이동. 흥미롭게도, 인비멘틴 양성 선조는 또한 영역과 같은 상류 영역에서 관찰되며, 외부 방사형 신경교선 선조를 연상시키는 양성 표면으로 확장되는 독특한 양성 공정을 항구하며, 이 방법의 고해상도를 설명한다. 여기에 면역 스테인의 영화입니다, 자유 부동 섹션, 분홍색으로, 공리를 얼룩 진 고 체, 녹색, 그리고 ARLT3B 항체로 검출 된 1 차적인 섬모를 보여주는 공명 스캐닝 현미경 덕분에 취득, 분홍색으로.1 차 적인 섬모는 모든 신경 줄기및 전구 세포에서 확장, 특히, 서사시 선조의 서사시 표면뿐만 아니라 영역과 같은 전판의 신피성 뉴런에서. 마지막으로 2D 뉴런 로제트와 분리된 줄기 및 전구 세포는 뇌피질 발달의 여러 측면을 재구성하고 수분 생체 발생 및 기능을 테스트하는 보완적이고 유용한 도구를 나타냅니다. 우리가 여기에서 검출하는 프로토콜은 우리가 이 절차의 견고성을 보장하는 균일한 결과를 초래하는 이 명백한 iPS 세포주에서 등쪽 전뇌 오르가노이드를 성공적으로 생성할 수 있었습니다.전체 오르가노이드 또는 자유 부동 섹션의 면역 스테인링, 지우기 및 이미징을 위해 설정한 프로토콜은 간단하고 빠르며 비용 효율적입니다. 이러한 세포 기반 모델과 iPS 세포에 대한 3D 이미징 분석을 결합하여, ciliary 변투 세포를 다시 프로그래밍하거나 CRISPR 9 기술을 사용하여 섬모 유전자를 구체적으로 편집함으로써, 대뇌 피질의 정상 및 병리학 적 발달 동안 1 차 실륨의 기여도에 대한 이해에 상당한 진전을 허용해야합니다.

2d-3d-human-induced-pluripotent-stem-cell-based-models-to-dissect

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

일차 섬모 신경 전구 세포의 증식, 신경 세포 분화, 성인 신경 기능에 근본적으로 중요하다. 여기서 우리는 ciliogenesis 및 기본 neurosphere 문화를 사용하여 신경 줄기 / 전구 세포 및 분화 된 신경 세포의 섬모에 신호 단백질의 인신 매매를 연구하는 방법을 설명합니다.

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

신경 상피 조직의 전례 없는 복잡성으로 인해 인간의 뇌 발달을 모델링하는 데 방해를 받았습니다. 여기에서는 인간 뇌 발달의 초기 사건을 묘사하고 체외에서 소두증을 모델링하기 위해 뇌 오가노이드의 강력한 생성 방법을 설명합니다.

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

라이브 영상 실시간에 세포 행동을 공부 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 시간 경과 비디오-현미경 기본 대뇌 피 질 세포의 차별화 된 뉴런을 명과 기본 신경 줄기 세포에서 혈통 진행 동안 제정 단계의 상세한 검사를 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

우리 간단한 3D 차별화를 사용 하 여 hPSCs에 대 한 프로토콜 정의 매체를 설명 하 고 초기 neuroepithelial 구조와 셀 집계를 생성할 수와 소 뇌 관련 표식으로 옵션에 대 한 긍정적인 성장 요인 감소 기능적 뉴런을 생성 하는 단층으로 셀을 차별화 하는 데 2D 수정.

효율적인된 3D 소 뇌 분화 프로토콜 옵션 2D 수정

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

본 프로토콜은 소뇌 발달의 초기 단계를 조사하기 위해 유도 만능 줄기 세포로부터 소뇌 세포의 2D 단층 생성을 설명합니다.

2D 구조에서 체 외에서 인간 소뇌 발달 모델링

여기에서는 전기천공법에 의한 절쇄된 인간 피질 오가노이드의 급성 유전자 조작을 제시합니다. 이러한 피질 오가노이드 모델은 절단 후 심실과 같은 구조를 쉽게 식별할 수 있기 때문에 특히 주입이 용이하여 인간의 피질 발달, 신경 발달 장애 및 피질 진화에 대한 기능적 연구를 가능하게 합니다.

유전자 기능 연구를 위한 sliced human cortical organoids의 Electroporation

프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 및 사체 연구에 기초하여 두 개의 시험관 발생 독성 시험 시스템 (UKK 및 UKN1)를 설명한다. 테스트 시스템은 인간 발생 독성 위험을 예측하고, 동물 연구, 비용 및 화학 물질의 안전성 검사에 필요한 시간을 단축에 기여할 수있다.

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

배우세요 신피질 발달에서 1차 섬모의 역할을 해부하는 2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델을 사용하는 방법을. 이 프로토콜은 신경 줄기세포 확장과 신경 세포 성숙 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

더 많은 동영상 탐색