Name: Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende a bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para ingeniería de tejido neural. Este método permite estudiar la funcionalidad de astrocitos y su papel en enfermedades neurológicas.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP), números de subvención 2018/23039-3 y 2018/12605-8; Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), números de subvención 465656/2014-5 y 309679/2018-4; y Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES), código financiero 001.

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Los autores no tienen conflictos que revelar.

La tecnología de bioimpresión 3D ha surgido como una alternativa de biofabricación que permite la ingeniería de construcciones refinadas que estructural y fisiológicamente se asemejan a tejidos nativos22,incluido el cerebro23. La biofabricación de tejidos neurales permite el modelado de microambientes nativos in vitro, siendo una herramienta importante para comprender los mecanismos celulares y moleculares asociados con el desarrollo y tratamiento de muchas enferme...

Los astrocitos son el tipo de célula más abundante en el Sistema Nervioso Central (SNC) y juegan un papel clave en la homeostasis cerebral. Además de soportar el apoyo neuronal, los astrocitos son responsables de modular la absorción de neurotransmisores, mantener la integridad de la barrera hematoencefálica y regular la sinaptogénesis neuronal1,2. Los astrocitos también tienen un papel esencial en la inflamación del SNC, respondiendo a lesiones en el cerebro en un proceso que conduce a la reactividad astrociátrica o astrogliosis reactiva3,4,formando una cicatriz glial que impide la exposición del tejido sano a agentes degenerativos5. Este evento resulta en cambios en la expresión génica, morfología y función de los astrocitos6,7. Por lo tanto, los estudios que involucran la funcionalidad de los astrocitos son útiles para el desarrollo de terapias para tratar trastornos neurológicos.
Los modelos in vitro son cruciales para estudiar los mecanismos relacionados con las lesiones neurológicas, y aunque se ha establecido un aislamiento exitoso y un cultivo bidimensional (2D) de astrocitos corticales8,este modelo no proporciona un entorno realista que imite el comportamiento de las células nativas y reproduzca la complejidad del cerebro9 . En condición 2D, el pobre soporte mecánico y bioquímico, las bajas interacciones célula-célula y célula-matriz, y el aplanamiento celular que conduce a la ausencia de polaridad basal-apical, afectan la dinámica de señalización celular y los resultados experimentales que conducen a la alteración de la morfología celular y la expresión génica, que comprometen la respuesta a los tratamientos10. Por lo tanto, es crucial desarrollar alternativas que proporcionen un entorno neuronal más realista, con el objetivo de traducir los resultados a la clínica.
El cultivo celular tridimensional (3D) representa un modelo más avanzado que recapitula con mayor fidelidad las características de órganos y tejidos, incluido el SNC11. En cuanto al cultivo glial, los modelos 3D contribuyen al mantenimiento de la morfología de los astrocitos, la polaridad basal-apical celular y la señalización celular12,13. La tecnología de bioimpresión 3D surgió como una poderosa herramienta para biofabricar tejidos vivos 3D de manera controlada mediante el uso de células y biomateriales para recrear la estructura y las propiedades de los tejidos nativos. El uso de esta tecnología ha supuesto una mejora sustancial de la predicción de resultados y ha contribuido a la medicina regenerativa aplicada al SNC14,15,16.
El protocolo descrito aquí detalla el aislamiento y cultivo de astrocitos corticales. El protocolo también detalla un método reproducible para bioimprimir astrocitos incrustados en gelatina / gelatina metacriloilo (GelMA) / fibrinógeno, complementado con laminina. En este trabajo, se utilizó una bioimpresora basada en extrusión para imprimir la composición del biomaterial que contiene astrocitos corticales a una densidad de 1 x 106 células/ ml. El estrés de cizallamiento de bioimpresión se minimizó mediante el control de la velocidad de impresión, y los astrocitos mostraron una alta viabilidad después del proceso. Los constructos bioimpresos se cultivaron durante 1 semana, y los astrocitos pudieron propagarse, adherirse y sobrevivir dentro del hidrogel, manteniendo la morfología astrocítica y expresando un marcador específico de proteína ácida fibrilar glial (GFAP)4.
Este procedimiento es compatible con bioimpresoras basadas en extrusión accionadas por pistón y se puede utilizar para bioimprimir astrocitos derivados de diferentes fuentes. El modelo bioimpreso en 3D propuesto aquí es adecuado para una amplia gama de aplicaciones de ingeniería neuronal, como los estudios de los mecanismos involucrados en la funcionalidad de los astrocitos en tejidos sanos y la comprensión de la progresión de las patologías neurológicas y el desarrollo de tratamientos.

<table><tbody><tr><td>Bioimpresora 3D</td> Soluciones <td></td> de <td>biotecnología 3D</td><td>Bioimpresora basada en extrusión</td></tr><tr><td>Pinza de punta roma</td><td>Integra Miltex</td><td>6--30</td><td>Pinzas para disección cerebral previamente esterilizadas</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Sin proteasas, sin ácidos grasos, esencialmente sin globulina</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular</td><td>Fisher Scientific</td><td>156340</td><td>Matraz de cultivo T25</td></tr><tr><td>Colador</td><td>de células Corning Incorporated</td><td>352340</td><td>Colador de células 40 &micro; m</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscopía confocal TCS SP8 acoplada a un sistema confocal Olympus FluoView 300</td></tr><tr><td>Tubos cónicos</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651, 339652</td><td>Tubos estériles de 15 mL y 50 mL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab224589</td><td>DAPI solución de tinción</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>12500062</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) con L-glutamina Tubo de</td></tr><tr><td>diálisis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>Peso molecular de corte = 14 kDa</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-15-5</td><td>Grado reactivo</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>12657011</td> Fibrinógeno <td>de grado de investigación</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-32-5</td><td>Fibrinógeno en polvo cristalino de plasma bovino</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td>Gelatina en polvo de piel porcina</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-40-6</td><td>Glicina en polvo</td></tr><tr><td>Hanks Solución salina tamponada (HBSS)</td><td>Gibco; Corporación de Tecnologías de la Vida</td><td>14175095</td><td>Sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-85-9</td><td>L-Glutamina polvo cristalino</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td>Laminina 1-2 mg/mL L en 50 mM Tris-HCl Kit de</td></tr> células <tr><td>muertas vivas kit de imagen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37601</td><td>Fluorescencia verde en células vivas (ex/em 488 nm/515 nm). Fluorescencia roja en células muertas (ex/em 570 nm/602 nm)</td></tr><tr><td>Anhídrido metacrílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>760-93-0</td><td>Para la preparación</td></tr><tr><td>de GelMA Microtubos</td><td>Corning Incorporated</td><td>MCT-150-C</td><td>Microtubos de NaCl de 1,5 mL</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Aguja 22G</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1362045</td><td>Aguja roma estéril</td></tr><tr><td>En funcionamiento tijera</td><td>Integra Miltex</td><td>05--02</td><td>Tijera afilada para la disección del cerebro previamente esterilizada</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Paraformaldehído en polvo</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>15070063</td><td>Estreptococo de pluma (5,000 unidades/mL de penicilina; 5,000 ug/mL de estreptomicina)</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Corning Incorporated</td><td>430591, 430588</td><td>Placas de Petri estériles de 35 y 100 mm</td></tr><tr><td>Faloidina</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>iFluor 488 reactivo</td></tr><tr><td>Fotoiniciador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>106797-53-9</td><td>2-Hidroxi-4&prime;-(2-hidroxietoxi)-2- tampón de fosfato de metilpropiofenona</td></tr><tr><td>solución salina (PBS)</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>10010023</td><td>PBS 1 x, grado de cultivo, sin calcio, sin magnesio</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25988-63-0</td><td>Hidrobromuro de poli-L-lisina mol wt 30,000-70,000</td></tr><tr><td>Antocuerpo primario</td><td>Abcam</td><td>ab4674</td><td>Policlonal de pollo a GFAP</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario</td><td>Abcam</td><td>ab150176</td><td>Alexa fluor 594</td></tr><tr><td>espátula</td> <td>anti-polloMiltex</td><td>V973-70</td><td>Espátula de cemento número 24 previamente esterilizada</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>estereoscópico Fisherbrand</td><td></td><td>3000038 Microscopio para disección cerebral</td></tr><tr><td>Jeringa 5 mL</td><td>BD</td><td>1222C84</td><td>Jeringa estéril</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 2 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-105 Filtro de</td><td>polipropileno para esterilización</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002--04-4</td><td>Trombina polvo cristalino de plasma bovino</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td> de grado de laboratorio <td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>15400054</td><td>Rojo de tripsina sin fenol 1 x diluido en la solución de PBS</td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>15040066</td><td>Solución Versene (0,48 mM) formulada como 0,2 g de EDTA(Na4) por litro de PBS</td></tr><tr><td>Placa de pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>144530</td><td>Placa estéril de 24 pocillos</td></tr></tbody></table>

bioimpresión 3d de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Los astrocitos son células gliales con un papel esencial en el sistema nervioso central (SNC), incluyendo el soporte neuronal y la funcionalidad. Estas células también responden a las lesiones neuronales y actúan para proteger el tejido de eventos degenerativos. Los estudios in vitro de la funcionalidad de los astrocitos son importantes para dilucidar los mecanismos implicados en tales eventos y contribuir al desarrollo de terapias para tratar trastornos neurológicos. Este protocolo describe un método para biofabricar una estructura de tejido de tipo neural rica en astrocitos mediante bioimpresión 3D de biotinta cargada de astrocitos. En este trabajo se utilizó una bioimpresora 3D basada en extrusión, y se extrajeron astrocitos de las cortezas cerebrales de los cachorros de ratones C57Bl / 6. La biotinta se preparó mezclando astrocitos corticales de hasta el pasaje 3 a una solución de biomaterial compuesta de gelatina, gelatina-metacriloil (GelMA) y fibrinógeno, complementada con laminina, que presentaba condiciones óptimas de bioimpresión. Las condiciones de bioimpresión 3D minimizaron el estrés celular, contribuyendo a la alta viabilidad de los astrocitos durante el proceso, en el que el 74,08% ± el 1,33% de las células eran viables justo después de la bioimpresión. Después de 1 semana de incubación, la viabilidad de los astrocitos aumentó significativamente a 83.54% ± 3.00%, lo que indica que la construcción 3D representa un microambiente adecuado para el crecimiento celular. La composición del biomaterial permitió la unión celular y estimuló el comportamiento astrocítico, con células que expresan el marcador específico de astrocitos glial de proteína ácida fibrilar (GFAP) y poseen la morfología astrocítica típica. Este protocolo reproducible proporciona un método valioso para biofabricar tejido neural 3D rico en astrocitos que se asemeja al microambiente nativo de las células, útil para los investigadores que tienen como objetivo comprender la funcionalidad de los astrocitos y su relación con los mecanismos involucrados en las enfermedades neurológicas.

Este trabajo tuvo como objetivo desarrollar un tejido similar a un neural utilizando la tecnología de bioimpresión 3D para depositar capa por capa la biotinta cargada de estratocitos primarios / GelMA / fibrinógeno. Los astrocitos fueron extraídos y aislados de la corteza cerebral de cachorros de ratones(Figura 1),añadidos a una composición de biomaterial, permitiendo la biofabricación de una construcción 3D viva.
El diseño asistido por ordenador (CAD) se desarrol...

Aquí informamos un método de bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para biofabricar tejidos neurales para estudiar la funcionalidad de los astrocitos en el sistema nervioso central y los mecanismos que involucran a las células gliales en enfermedades y tratamientos neurológicos.

Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

La bioimpresión 3D de astrocitos supone un avance en la ingeniería de tejidos neuro, permitiendo la biofabricación de modelos in vitro que son útiles para comprender los mecanismos implicados en la enfermedad neurológica. La principal ventaja de la bioimpresión 3D es biofabricar estructuras adjuntas de células que imitan las características bioquímicas y mecánicas de los tejidos, proporcionando una mejor comprensión de la dinámica celular en la salud y la enfermedad. Este protocolo se puede aplicar a la biofabricación de otros tejidos blandos, ya que se basa en la bioimpresión 3D de una biotinta compuesta por polímeros naturales y componentes de matriz extracelular.Para empezar, corte el tejido cortical aislado del ratón eutanasiado en trozos pequeños con una micro tijera curva. Lave las piezas de tejido tres veces con un mililitro de HBSS mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Después de eliminar el HBSS agregado por tercera vez, agregue un mililitro de tripsina al 0.05% e incube el tejido durante cinco minutos a 37 grados centígrados.Para la disociación mecánica del tejido, pipetee suavemente la mezcla de tripsina tisular hacia arriba y hacia abajo 15 veces. A continuación,

3d-bioprinting-murine-cortical-astrocytes-for-engineering-neural-like

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video muestra un método para generar andamios de astrocitos tridimensionales dentro de microcolumnas de hidrogel. El interior de las microcolumnas está recubierto de colágeno. Se introducen astrocitos, que se adhieren al colágeno y, con una incubación posterior, se autoensamblan en un andamio tridimensional.

Un método in vitro para generar andamios de astrocitos dentro de microcolumnas de hidrogel

El video muestra el proceso de creación de una construcción bioimpresa en 3D utilizando astrocitos suspendidos en una solución de biotinta. La construcción bioimpresa, después de la reticulación, facilita la adhesión de los astrocitos y su propagación, formando tejido similar a un neural.

Un método para la bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos

Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

La comprensión de las complejas acciones del cerebro requiere herramientas de investigación avanzadas. Aquí demostramos un novedoso modelo de ingeniería 3D basado en colágeno de seda de tejido neuronal que se asemeja a una arquitectura similar a la del cerebro. El modelo se puede utilizar para estudiar el ensamblaje de redes neuronales, la guía axonal, las interacciones célula-célula y la actividad eléctrica.

Modelo de polarizado Neural tisular basada Silk-colágeno-Engineered 3D

Nos muestra el desarrollo de los paquetes uno mismo-montado, tridimensionales de somata astrocytic longitudinalmente alineado y procesos dentro de un protector nuevo biomaterial. Estos diseñados "andamios de vida", que diámetro de la escala del micrón pero extiende centímetros de longitud, puede servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico o facilitar la Neurorregeneración por dirige la migración neuronal y axonal pathfinding.

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Aquí, presentamos un protocolo para producir cocultivos bioimpresos en 3D de neuronas y astrocitos derivados de iPSC. Este modelo de cocultivo, generado dentro de un andamio de hidrogel en formatos de 96 o 384 pocillos, demuestra una alta viabilidad post-impresión y crecimiento de neuritas en 7 días y muestra la expresión de marcadores de madurez para ambos tipos de células.

Bioimpresión tridimensional de cocultivos de neuronas-astrocitos derivados de iPSC humanos para aplicaciones de cribado

Tejido muscular Engineered tiene un gran potencial en medicina regenerativa, como modelo de la enfermedad y también como una fuente alternativa para la carne. Aquí se describe la ingeniería de una construcción de músculo, en este caso a partir de células progenitoras de mioblastos de ratón y la estimulación por impulsos eléctricos.

Los tejidos de ingeniería músculo esquelético de células mioblastos murinos progenitoras y aplicación de estimulación eléctrica

Este artículo y el vídeo de acompañamiento presentar nuestro protocolo para la generación de tejido de ingeniería intestino en el ratón, utilizando un organoide unidades-on-andamio enfoque.

Ingeniería de tejidos del intestino en un modelo murino

Se describen los métodos para crear los tejidos tumorales 3D humanos como sistemas de prueba. Estas tecnologías se basan en un descelularizado Biológica vascularizado Andamios (BioVaSc), las células humanas primarias y una línea de células tumorales, que pueden ser cultivadas bajo condiciones estáticas, así como en condiciones dinámicas en un biorreactor de flujo.

Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Prueba de Tumores

Aprende a bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para ingeniería de tejido neural. Este método permite estudiar la funcionalidad de astrocitos y su papel en enfermedades neurológicas.

Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural

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