단백질 저거짓말 형성 상태를 검출하기 위한 고압 NMR 실험

고압은 단백질 형성 시료의 상대적 집단을 변화시킬 수 있는 방법이다. 고에너지 형성 상태를 격리하고 특성화하는 데 매우 유용합니다. pH 또는 온도와 같은 모든 변투 방법에 비해 압력 중단은 쉽게 적용되고 완전히 되돌릴 수 있습니다.

또한 유리 충치 또는 보이드 볼륨이 있는 영역에 주로 영향을 미치는 국소 의 동요이기도 합니다. 먼저, 유리 파이펫을 사용하여 지르코니아 튜브에 질소-15 라벨이 부착된 샘플을 소개하고 튜브 바닥의 샘플 시트를 확인합니다. 시료가 투과액과 혼합되는 것을 방지하기 위해 샘플을 200 마이크로리터의 미네랄 오일로 오버레이한 다음 나머지 튜브를 전송 액체로 채웁니다.

지르코니아 튜브 위에 일회용 O 링을 넣고 튜브를 베이스로 밀어 넣습니다. 그런 다음 튜브를 고압 밧줄 라인에 연결하고 손으로 기지를 셀에 조입니다. 그런 다음 14.7 뉴턴 미터 토크를 적용하여 낮은 압력에서 누출을 방지하십시오.

압력 세포 조립의 무결성을 확인하려면 세포 지지체 및 봉쇄 용기를 사용하여 분광계 외부에서 최대 300 개의 막대를 가압하십시오. 15분 후, 압력을 한 막대로 재설정하고 깨끗한 보풀이 없는 물티슈로 누출을 확인합니다. 테더 라인을 신중하게 안내하여 억제되지 않은 튜브를 분광계에 삽입합니다.

튜브가 샘플 앉아 위치에 도달 할 때까지 분광기에 튜브를 밀어 넣습니다. 고정, 심, 일치 하 고 프로티움과 질소 채널을 조정 하 고 미래에 대 한 최적화 된 심을 저장 합니다. 이종 단일 양자 일관된 분광법으로 횡방향 이완 최적화 분광법을 설정하고 대기 조건에서 참조 실험을 기록합니다.

500개의 막대마다 한 막대에서 2.5킬로바까지 일련의 2D 실험을 기록합니다. 정확한 접이식 또는 전개 속도가 알려지면 각 500bar'증분 후에 샘플을 15~20분 동안 평형화하게 하십시오. 접기 또는 전개 전환의 변곡점이 도달하면 추가 실험을 기록하여 적합성의 정밀도를 향상시킵니다.

이 프로토콜은 제2 RNA 인식 모티프 이질적인 핵 리보뉴클레오프로틴 A1의 압력 의존성을 조사하는 데 사용되었다. 이종 단일 양자 일관성 분광기 분광기 분광기를 가진 횡방향 휴식 최적화 분광기는 1bar, 1.5 킬로바, 2킬로바 및 2.5 킬로바에서 수집되었다. RRM2는 2.5킬로바 범위 내에서 거의 완전히 전개됩니다. 개별 압력 강도 프로파일은 여기에 표시된 방정식에 따라 장착되었으며, 전개 반응과 관련된 표준 깁스 자유 에너지 및 부피의 해당 변화를 얻었다.

도메인 구조에 매핑되었을 때, 볼륨 변화의 가장 큰 크기의 잔류물은 도메인 구조 코어 내에서 발견되었으며, 볼륨 변화의 크기가 가장 작은 잔류물은 주로 베타 가닥과 베타 가닥 사이의 C 단자 나선 사이의 연결 루프에 위치했다. 접힌 상태 앙상블의 압축성 및 형태 이질성의 정도를 조사하기 위해, 프로티움 화학적 변화가 분석되었다. 프로티움 화학 적 변화의 개별 프로파일은 도시된 방정식을 사용하여 장착되어 사이트별 선형 및 비선형 계수를 추출하였다.

가장 큰 비선형 계수를 가진 잔류물은 주로 도메인의 구조 코어에서 발견되었으며, 가장 작은 비선형 계수를 가진 잔류물은 대부분 다른 구조 모티브를 연결하는 루프 내에 위치했다. 누출을 방지하기 위해 튜브를 압력이 올바르게 설정하여 설정하는 것이 중요합니다. 누출이 발생하면 미네랄 오일의 흔적을 정리하기 위해 프로브를 제거해야 할 것입니다.