Name: 단백질 저거짓말 형성 상태를 검출하기 위한 고압 NMR 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: 학습하세요 고압 NMR 실험을 통해 단백질의 고에너지 구조 상태를 분석하는 방법을 배우세요. 질소-15 표지 샘플을 지르코니아 튜브에 주입하고 압력에 따른 피크 강도와 화학적 이동 변화를 측정하여 단백질 폴딩 경로와 구조적 안정성에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

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이 작품은 로이 J. 카버 자선 신탁에서 줄리앙 로슈에 이르는 기금으로 지원되었습니다. 우리는 친절하게 RRM2 샘플을 제공 J. D. 레벤트와 B. S. 톨버트 감사합니다.

참고: 여기에 설명된 프로토콜은 (i) 2.5 kbar 등급의 알루미늄 강성 지르코니아튜브(18),(ii) NMR 스펙트럼 분석을 위한 소프트웨어 SPARKY19, (iii) 곡선 피팅 소프트웨어가 있는 고압 펌프 및 셀이 필요합니다.
1. 샘플 준비, 고압 셀조립 및 실험 설정.
<ol><li>버퍼선택: 인산염 및 트리스20,21과같은 음이온 및 양이온 버퍼의 동등한 혼합물을 사용합니다. 참고: 인산염 및 MES와 같은 음이온 완충제의 pKa는 상당한 반응 부피(즉, 산 및 이온화된 제품의 부분 용액 량의 차이)와 관련이 있습니다. 따라서 이러한 버퍼의 pH는 압력 변경(~0.25-0.5 pH 단위/kbar)의 변화에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다.</li>
	<li>필요한 시료 부피가 표준 3mm 직경 NMR 튜브(~300μL)와 유사한지 확인합니다.</li>
	<li>지르코니아 튜브에 유리 파이펫이 있는 15개의N 라벨 샘플을 소개합니다. 튜브 하단의 샘플 시트를 확인합니다. 200μL의 미네랄 오일로 완성되어 시료가 전송 액(예: 물)과 혼합되는 것을 방지합니다. 전송 액체로 튜브의 나머지 부분을 채웁니다.</li>
	<li>지르코니아 튜브 위에 일회용 O-링을 넣고 튜브를 베이스로 밀어 넣습니다(도1A,B). 그런 다음 튜브를 고압 밧줄 라인에 연결하고 직접 셀에 베이스를 조입니다. 그런 다음, 낮은 압력(그림 1C,D)에서 누출을 방지하기 위해 토크의 14.7Nm을적용합니다.</li>
	<li>압력 세포 조립의 무결성을 확인하려면 세포 지지체 및 봉쇄 용기를 사용하여 분광계 외부에서 최대 300 bar의 튜브를 가압하십시오. 15분 간 기다렸다가 압력을 1bar로 재설정하고 깨끗한 보풀이 없는 물티슈로 누출을 확인하십시오.</li>
	<li>테더 라인을 신중하게 안내하여 억제되지 않은 튜브를 분광계에 삽입합니다. 샘플 앉는위치(그림 1E)에도달할 때까지 분광계에서 튜브를 밀어냅니다.</li>
	<li>평소와 같이 1H 및 15N 채널을 잠그고, 쉬고, 일치하고, 조정합니다. 참고: 고압 등급 지르코니아 튜브용 심은 표준 NMR 튜브와 매우 다릅니다. 향후 사용을 위해 최적화된 심을 저장하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>1H-15N-HSQC 또는 TROSY-HSQC를 설정하고 대기 조건(1bar)에서 참조 실험을 기록합니다.</li>
</ol>2. 고압 NMR 실험 기록
<ol><li>점차적으로 단백질의 전반적인 안정성을 시험하기 위하여 500 바 증분으로 1 bar에서 2.5 kbar로 압력을 증가시다. 기본적으로 압력 펌프의 속도를 ~18 bar/s로 설정합니다. 정확한 접이식/전개 속도를 알 수 없는 경우 샘플이 각 500bar 증분 후 15-20분을 평형화하도록 합니다. 스펙트럼을 2.5 kbar에서 기록합니다.</li>
	<li>압력 의 가역성을 테스트하기 위해 500 바 단계로 압력을 1 bar로 점차적으로 줄입니다. 대기 조건에서 다른 스펙트럼을 기록하고 화학 적 변화와 피크 강도를 이전에 동일한 조건에서 기록 된 참조 스펙트럼의 것과 비교합니다. 참고: 압력 실행 후 네이티브 크로스피크가 더 강렬한 경우 대기압의 용액에 존재하는 작은 골재가 해리되고 적절하게 다시 접혀있을 수 있음을 나타낼 수 있습니다. 한편, 강도 나 유의한 화학적 변화 에서의 손실은 단백질이 고압 조건에서 비 가역적 인 오해를 경험할 수 있음을 시사한다.</li>
	<li>500bar마다 1bar에서 2.5 kbar까지 일련의 2D 실험을 기록합니다. 접이식/전개 전환의 변곡점 근처에서 추가 실험을 기록하여 핏의 정밀도를 향상시키는 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. 피크 강도 변화 분석
<ol><li>모든 스펙트럼을 처리하고 참조 스펙트럼에서 1 bar에서 500 bar에 기록된 스펙트럼으로 백본 할당을 전송한 다음 할당을 500 bar에서 1 kbar로 전송합니다. 참고: 압력은 1H및 15N 화학 적 시프트의 비 균일한 변화를 유도하기 때문에 단순히 한 스펙트럼에서 다음 스펙트럼으로 백본 할당을 복사하지 마십시오. 수동으로 조정합니다.</li>
	<li>스파키 메뉴에서 피크 > 피크 목록(lt)을 클릭합니다. 피크 목록 창에서 옵션을 클릭하고 주파수(ppm)와 데이터 높이를 모두 표시하는 옵션을 선택합니다. 각 스펙트럼에 대해 얻은 목록을 저장합니다.</li>
	<li>커브 피팅 소프트웨어에서 크로스피크 ID 및 피크 강도 값을 복사하여 압력 값(막대)을 X축 변수로, 강도는 Y축 변수로 갖습니다.</li>
	<li>완전하거나 거의 완전(>80%)이 전개되는 경우 개별 피크 강도 프로파일에 맞게 간단한 2상태 모델을 사용하여 전개 시 각각 자유 에너지 및 볼륨 변화를 추출합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62701/62701eq01.jpg">Eq. 1 여기서, "I"는 주어진 압력 p에서 크로스 피크의 관찰 강도이며 IF는 완전히 접힌 상태에서 동일한 크로스 피크의 강도입니다. R은 가스 상수, T는 절대 온도, ΔGU0은 대기압 p0(1 bar)에서 전개된 및 접힌 상태 간의 표준 깁스 자유 에너지 차이( 및 ΔVu)가 전개시 부피 변화이다. 켈빈의 바 및 온도 T의 압력 p와 함께, R = 1.987 cal/K, ΔGU0은 cal/mol에, ΔVU는 cal/mol/bar에 있습니다. mL/mol으로 변환하기 위해 41.84에 의해 적합성으로부터 얻은 ΔVU 값을 곱하여. ΔVU 값은 구형단백질(22)에대해 -50 ~ -150mL/mol의 범위에 전형적으로 이다. 여기서, 모든 파라미터는 전개 반응에 관하여 표현되지만 접이식 반응 파라미터(ΔGU0 = -ΔGF0 및 ΔVU = -ΔVF)로쉽게 변환될 수 있다.</li>
</ol>4. 화학 적 변화 변화 분석
<ol><li>압력 점을 변수로 지정하고 스파키 목록에서 추출한 1H화학 적 시프트를 Y 축으로 정렬합니다.</li>
	<li>간단한 이차 방정식에 1H 화학 적 변화의 압력 의존도에 맞게 : δ (p) = δ0(p0)+ B1(p-p0)+ B2 (p-p0)2 Eq. 2 여기서,δ(p)은주어진 압력 p및 δ0(p0)에서크로스피크의 측정된 1H화학적 시프트이며, 1bar에 기록된 기준 스펙트럼에서 동일한 크로스피크의 1H화학적 시프트이다. B1 및 B2는 ppm/bar 및 ppm/bar2로각각 발현된 첫 번째 및 2차 매개 변수를 나타냅니다.</li>
</ol>

<ol><li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probing+invisible%2C+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+An+application+to+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li>
<li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li>
<li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMG+relaxation+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li>
<li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+exchange+saturation+transfer+%28CEST%29%3A+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins%27+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li>
<li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li>
<li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li>
<li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li>
<li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561(2017).</li>
<li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244(2018).</li>
<li>Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li>
<li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li>
<li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li>
<li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure%3A+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li>
<li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li>
<li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li>
<li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state%3A+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li>
<li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-contained+high-pressure+cell%2C+apparatus%2C+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101(2005).</li>
<li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoddard%2C+TD+%22Sparky+3%22">Sparky 3</a>. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).</li>
<li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li>
<li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Solution+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li>
<li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li>
<li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li>
<li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+The+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li>
<li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics%2C+folding+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li>
</ol>

모든 저자는 원고를 읽고 승인했습니다. 그들은 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 연구는 압력 동요에 대한 단백질 구조 및 열역학 반응을 조사하기 위해 구현된 프로토콜을 자세히 설명합니다. RRM2에 기록된 고압 실험은 비완전 협동 전개를 나타내는 ΔVU 값의 큰 변화가 상대적으로 작은 단일 도메인 단백질에서 발견될 수 있음을 보여준다. 압력하에서 1H화학 적 변화 변화의 분석에서 유사한 그림이 나타난다. 칼비처와 동료들은 화학적 시프트 변화에 대한 보다 심층적인 분석이 비선형계계수(B2/B1) 사이의 비율을 압축성 및 부피의 변화비율(Δβ/ΔV)(23)과 연계하여 수행할 수 있음을 입증하였다. 이러한 결과는 전개와 관련된 로컬 열역학 안정성 및 볼륨 변화에 따라 개별 구조 모티프 및 하위 도메인을 불안정하게 하는 높은 유압의 능력을 강조합니다. 압력 적정 실험의 간단한 세트를 기록하는 것은 그러므로 단백질의 접이식 기계장치 및 서브도메인 건축에 관하여 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다...

단백질과 단백질 복합체의 고에너지, 인구밀도가 낮은 형태가 많은 생물학적경로1,2,3에서중요한 역할을 한다는 것은 오랫동안 인식되어 왔다. 카-퍼셀-메이붐-길(CPMG)4,화학교류 포화전달(CEST)5,암흑상태 교환 포화전달(DEST)6 펄스 서열(그 외) 등) 실험덕분에, 용액 NMR 분광법은 일시적인 축축상태를 특성화하기 위한 선택의 방법으로등장했다. 이러한 실험과 함께, 온도, pH 또는 화학 적 강수제와 같은 교란은 더 높은 에너지 형성 하위 상태의 상대적 인구를 증가시키기 위해 도입 될 수있다. 마찬가지로, 단백질 평형증은 또한 높은 정압을 적용하여 혼란을 수 있습니다. 해당 형태 변화와 관련된 부피 변화의 크기에 따라, 수백~몇 천 개의 바의 압력 증가는 더 높은 에너지 상태를 현저하게 안정화하거나 단백질이8,9,10으로완전히 전개될 수 있다. 단백질 NMR 스펙트럼은 일반적으로 정수 압력으로 두 가지 유형의 변화를 표시합니다: (i) 화학 적 변화 변화와 (ii) 피크 강도 변화. 화학적 변화 변화는 단백질 표면-물 인터페이스 및/또는 단백질 구조의 국소 압축에서의 변화를 빠른 시간 척도(NMR 시간 척도에 비해)11로반영한다. 큰 비선형 화학적 변속 압력 의존성을 나타내는 크로스피크는12,13의높은 에너지 형성 상태의 존재를 나타낼 수 있다. 반면에, 피크 강도 변화는 접힌 상태 집단의 변화와 같은 느린 시간 척도의 주요 형태 전환을 가리킵니다. 접이식 중간체 이상의 에너지 상태의 존재는 주어진 단백질14,15,16,17의상이한 잔류물을 측정하여 전개시 부피 변화의 크기가 큰 변화로부터 검출될 수 있다. 우리의 경험을 바탕으로, 일반적으로 2 상태 폴더로 분류되는 작은 단백질조차도 압력에 대한 균일하지 않은 반응을 나타내며, 이는 현지 접이식 안정성에 대한 유용한 정보를 제공합니다. 여기에 설명된 아미드 피크 강도및 1H화학적 변화 압력 의존성의 수집 및 분석을 위한 프로토콜이, 모델 단백질로서 이질적인 핵 리보뉴클레오프로틴 A1(hnRNPA1)의 절연 RNA 인식 모티프 2(RRM2)를 사용하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td><td>Daedalus Innovations LLC</td><td>NMRCELL-B</td><td></td></tr><tr><td>Sparky3</td><td>University of California San Francisco, CA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Xtreme-60 주사기 펌프</td><td>Daedalus Innovations LLC</td><td>XTREME-60</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 저거짓말 형성 상태를 검출하기 위한 고압 nmr 실험

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

고압은 구형 단백질을 불안정하게 하고 단백질 복합체를 가역적 방식으로 해리시키는 데 사용할 수 있는 잘 알려진 교란 방법입니다. 유압은 낮은 어금니 볼륨을 가진 주쪽으로 열역학 평형을 구동합니다. 증가하는 압력은, 그러므로, 구형 단백질의 안정성및 단백질 복합체의 올리고머화 평형을 미세하게 조정할 수 있는 기회를 제공합니다. 고압 NMR 실험은 압력 변투의 미세한 안정성 튜닝 능력과 솔루션 NMR 분광법에 의해 제공되는 사이트 해상도를 결합하여 구형 단백질의 안정성, 접이식 메커니즘 및 올리고머화 메커니즘의 안정성을 관장하는 요인의 상세한 특성화를 허용합니다. 여기서 우리는 1 bar에서 2.5 kbar로 기록된 2D 1H-15N 실험세트를 통해 단백질의 국소 접이식 안정성을 조사하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 실험의 수집 및 분석에 필요한 단계는 hnRNPA1의 RRM2 도메인에서 획득한 데이터와 함께 설명됩니다.

여기서 설명된 프로토콜은 2.5 kbar 범위(>90%) 내에서 거의 완전히 전개되는 hnRNPA1(잔기 95-106)의 제2 RNA 인식 모티프인 RRM2의 압력 의존성을 조사하는 데 사용되었다. 1 H-15N 스펙트럼은 1 바, 500 바, 750 바, 1 kbar, 1.5 kbar, 2.5 kbar(그림 2)에서수집되었습니다. 네이티브 크로스피크가 2.5kbar의 노이즈 레벨 이상으로 보이지 않았기 때문에, 모든 상응하는 잔류물은 이압력(그림 3A)에서강도 값이 0으로 기인하였다. 총 45개의 개별 압력 강도 프로파일이 방정식 1(Eq. 1)에 따라 장착되어 전개반응(도 3A)과관련된 표준 깁스 자유 에너지(ΔGU0)및 부피(ΔVU)의상응하는 변화를 얻었다. 계산된 Δ...

우리는 고압 세포를 조립하고, 고압 NMR 실험을 설정하고 기록하고, 마지막으로 압력하에서 피크 강도 와 화학 적 변화 변화를 모두 분석하는 데 필요한 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 실험은 단백질의 접이식 통로 및 구조적인 안정성에 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

단백질 저거짓말 형성 상태를 검출하기 위한 고압 NMR 실험

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

고압은 단백질 형성 시료의 상대적 집단을 변화시킬 수 있는 방법이다. 고에너지 형성 상태를 격리하고 특성화하는 데 매우 유용합니다. pH 또는 온도와 같은 모든 변투 방법에 비해 압력 중단은 쉽게 적용되고 완전히 되돌릴 수 있습니다.또한 유리 충치 또는 보이드 볼륨이 있는 영역에 주로 영향을 미치는 국소 의 동요이기도 합니다. 먼저, 유리 파이펫을 사용하여 지르코니아 튜브에 질소-15 라벨이 부착된 샘플을 소개하고 튜브 바닥의 샘플 시트를 확인합니다. 시료가 투과액과 혼합되는 것을 방지하기 위해 샘플을 200 마이크로리터의 미네랄 오일로 오버레이한 다음 나머지 튜브를 전송 액체로 채웁니다.지르코니아 튜브 위에 일회용 O 링을 넣고 튜브를 베이스로 밀어 넣습니다. 그런 다음 튜브를 고압 밧줄 라인에 연결하고 손으로 기지를 셀에 조입니다. 그런 다음 14.7 뉴턴 미터 토크를 적용하여 낮은 압력에서 누출을 방지하십시오.압력 세포 조립의 무결성을 확인하려면 세포 지지체 및 봉쇄 용기를 사용하여 분광계 외부에서 최대 300 개의 막대를 가압하십시오. 15분 후, 압력을 한 막대로 재설정하고 깨끗한 보풀이 없는 물티슈로 누출을 확인합니다. 테더 라인을 신중하게 안내하여 억제되지 않은 튜브를 분광계에 삽입합니다.튜브가 샘플 앉아 위치에 도달 할 때까지 분광기에 튜브를 밀어 넣습니다. 고정, 심, 일치 하 고 프로티움과 질소 채널을 조정 하 고 미래에 대 한 최적화 된 심을 저장 합니다. 이종 단일 양자 일관된 분광법으로 횡방향 이완 최적화 분광법을 설정하고 대기 조건에서 참조 실험을 기록합니다.500개의 막대마다 한 막대에서 2.5킬로바까지 일련의 2D 실험을 기록합니다. 정확한 접이식 또는 전개 속도가 알려지면 각 500bar'증분 후에 샘플을 15~20분 동안 평형화하게 하십시오. 접기 또는 전개 전환의 변곡점이 도달하면 추가 실험을 기록하여 적합성의 정밀도를 향상시킵니다.이 프로토콜은 제2 RNA 인식 모티프 이질적인 핵 리보뉴클레오프로틴 A1의 압력 의존성을 조사하는 데 사용되었다. 이종 단일 양자 일관성 분광기 분광기 분광기를 가진 횡방향 휴식 최적화 분광기는 1bar, 1.5 킬로바, 2킬로바 및 2.5 킬로바에서 수집되었다. RRM2는 2.5킬로바 범위 내에서 거의 완전히 전개됩니다. 개별 압력 강도 프로파일은 여기에 표시된 방정식에 따라 장착되었으며, 전개 반응과 관련된 표준 깁스 자유 에너지 및 부피의 해당 변화를 얻었다.도메인 구조에 매핑되었을 때, 볼륨 변화의 가장 큰 크기의 잔류물은 도메인 구조 코어 내에서 발견되었으며, 볼륨 변화의 크기가 가장 작은 잔류물은 주로 베타 가닥과 베타 가닥 사이의 C 단자 나선 사이의 연결 루프에 위치했다. 접힌 상태 앙상블의 압축성 및 형태 이질성의 정도를 조사하기 위해, 프로티움 화학적 변화가 분석되었다. 프로티움 화학 적 변화의 개별 프로파일은 도시된 방정식을 사용하여 장착되어 사이트별 선형 및 비선형 계수를 추출하였다.가장 큰 비선형 계수를 가진 잔류물은 주로 도메인의 구조 코어에서 발견되었으며, 가장 작은 비선형 계수를 가진 잔류물은 대부분 다른 구조 모티브를 연결하는 루프 내에 위치했다. 누출을 방지하기 위해 튜브를 압력이 올바르게 설정하여 설정하는 것이 중요합니다. 누출이 발생하면 미네랄 오일의 흔적을 정리하기 위해 프로브를 제거해야 할 것입니다.

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JoVE Journal

Biochemistry

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단백질 Low-Lying Conformational State를 검출하기 위한 고압 NMR 실험

이 비디오는 15개의 N-표지된 야생형 및 돌연변이 엔보플라킨 단백질과 표지되지 않은 비멘틴 단백질 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명 분광법 기술에 대해 설명합니다. 야생형 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 성공적인 상호 작용은 NMR 스펙트럼에서 광범위한 라인 확장과 피크 소멸로 이어지는 반면, 돌연변이된 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 상호 작용이 없으면 NMR 스펙트럼에서 잘 분리된 피크를 초래합니다.

원자 수준의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명

핵 자기 공명은 가장 중요한 분광 도구 중 하나입니다. 여기에서는 현재 최대 10.1 GPa의 고압에서 새로운 접근 방식의 개발이 제시됩니다. 이는 고압 연구가 매우 중요한 응집 물질 물리학 및 화학에 대한 새로운 창을 열어줍니다.

극한의 상황에서도 응집 물질의 전자 화학적 특성을 프로빙을위한 새로운 도구 : 기가 파스칼의 압력에서 고감도 핵 자기 공명

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

여기서, 솔루션 NMR 분광법에 의한 15N이완 분산 프로파일의 수집 및 분석을 위해 실험실에서 구현된 프로토콜에 대한 자세한 설명이 제공된다.

15 Μs-ms 타임스케일에 단백질 형성 역학의 조사를 위한 N CPMG 이완 분산

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

여기에서는 용액에서 단백질-글라이칸 상호 작용을 특성화하는 것을 목표로 하는 일련의 NMR 실험의 획득, 처리 및 분석을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 가장 일반적인 리간드 기반 및 단백질 기반 방법론이 요약되어 있으며, 이는 의심할 여지 없이 구조 당생물학 및 분자 인식 연구 분야에 기여합니다.

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

핵 자기 공명(NMR) 분광법은 잔류물 특이적 방식으로 구조적 단백질 역학을 특성화할 수 있습니다. 당사는 피코초에서 나노초의 시간 척도에 민감한 NMR 15NR1 및 R2 이완 및 {1H}-15N 이종 핵 오버하우저 효과(hetNOE) 실험을 기록하기 위한 실습 프로토콜을 제공합니다.

단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR 15N 이완 실험

이 NMR 기반 프로토콜은 시아노비린-N 및 D-만노스를 사용하여 약한 단백질-글리칸 상호작용을 조사합니다. 리간드 및 단백질 검출 방법을 결합하여 결합 부위를 매핑하고, 알로스테릭 효과를 감지하고, 만남 복합체를 식별합니다. 이 접근 방식은 샘플 준비 및 데이터 분석을 간략하게 설명하며 글리칸 특정 진단 및 인식 메커니즘에 유용한 구조적, 동적 통찰력을 제공합니다.

단백질-글리칸 상호작용 탐구: 핵 자기 공명의 발전

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

이 프로토콜에는 저해상도 ab initio 모델 및 대비 세제의 일치와 작은 각 중성자 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 세제 solubilized 막 단백질의 구조 정보를 가져오는 방법을 보여 줍니다.

막 단백질 구조 분석 및 Ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제

학습하세요 고압 NMR 실험을 통해 단백질의 고에너지 구조 상태를 분석하는 방법을 배우세요. 질소-15 표지 샘플을 지르코니아 튜브에 주입하고 압력에 따른 피크 강도와 화학적 이동 변화를 측정하여 단백질 폴딩 경로와 구조적 안정성에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

단백질 저거짓말 형성 상태를 검출하기 위한 고압 NMR 실험

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