Name: 대형 동물 모델의 전임상 연구를 위한 세포 스택에 있는 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 학습하세요 HEK293 세포를 이용한 고순도 AAV 바이러스 벡터 생산 방법을 통해 대형 동물 모델의 전임상 유전자 치료 연구를 효율적으로 수행하는 기술을 익히세요.

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아미라 D. Rghei, 브레나 A. Y. 스티븐스, 실비아 P. 토마스, 제이콥 지 이 예이츠는 온타리오 수의대 학생 스티펜스와 온타리오 대학원 장학금을 받았다. 아미라 D. Rghei는 미탁스 가속 학생의 수혜자였다. 이 연구는 건강 연구를위한 캐나다 연구소 (CIHR) 프로젝트 보조금 (#66009)과 SKW에 공동 건강 연구 프로젝트 (NSERC 파트너) 보조금 (#433339)에 의해 투자되었다.

<ol><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+A+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
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<li>Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: 
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<li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: 
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<li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: 
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<li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV+vector+toolkit%3A+poised+at+the+clinical+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li>
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<li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li>
<li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li>
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<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li>
<li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%3B+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li>
<li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((single+amino+acid+changes+can+influence+titer%2C+heparin+binding%2C+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li>
<li>Liu, J., Moon, Y. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li>
<li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li>
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<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li>
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<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
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<li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).</li>
</ol>

사라 K. 우튼은 AAV6.2FF 캡시드에 대한 미국 특허 US10806802B2의 발명가입니다.

이 논문에 기재된 재조합 AAV(rAAV) 벡터의 생산은 분자 생물학 연구 실험실 및 시설의 대부분에서 발견되는 일반적인 재료, 시약 및 장비를 사용합니다. 이 논문은 높은 품질의 시험관 내 및 생체 내 등급 rAAV를 독자에 의해 생성 할 수 있습니다. 무엇보다도, rAAV 생산을 위한 이 프로토콜은 세슘 염화 정제와 관련된 보다 지루한 프로토콜에 비해 효율적이며 초원심분리의 사용을 방지한다. HEK293 세포가 전염되면 정제 된 AAV는 5 근무 일 이내에 사용할 준비가되어 있습니다.
rAAV 생산 및 정화 공정 동안, 많은 단계는 벡터의 순도와 최종 티터에 영향을 미칠 수 있습니다. 첫 번째 및 가장 중요한 단계는 벡터 티터에 직접적인 영향을 미치는 HEK293 세포의 상태입니다. HEK293T 세포와 같은 다른 세포 유형 또는 시스템과 는 달리 HEK293 세포의 사용은 HEK293 세포가 지속적인 세포 성장을 위한 견고한 세포 네트워크를 ...

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 이용한 유전자 치료는 지난 3년간1,2에걸쳐 큰 진전을 이루었다. 선천성 실명, 혈우병, 근골격계 및 중추 신경계의 질병을 포함한 다양한 유전질환의 개선을 입증하여 임상 연구3,4의최전선에 AAV 유전자 요법을 도입했다. 2012년, 유럽의약품청(EMA)은 LPL 결핍 의 치료를 위해 지단백질 리파아제(LPL)를 발현하는 AAV1 벡터인 글리베라를 승인하여 유럽 또는 미국에서 유전자 치료 치료를 위한 최초의 마케팅 승인을5. 그 이후, 2개의 추가 AAV 유전자 치료, Luxturna6 및 Zolgensma7는FDA 승인을 수신하고, 시장은 2025년까지 예상되는 10-20의 유전자 치료로 향후 5년 동안 빨리 확장될 것으로 예상됩니다8. 사용 가능한 임상 데이터는 AAV 유전자 치료가 안전하고 잘 용납되며 효과적인 양식으로 가장 유망한 바이러스 벡터 중 하나이며 AAV가 ClinicalTrials.gov 등록한 244개 이상의 임상 시험이 있음을 나타냅니다. AAV 벡터를 포함하는 임상 응용에 대한 관심이 증가함에 따라 대형 동물 모델에서 AAV 치료법의 평가를 용이하게 하기 위해 견고하고 확장 가능한 생산 방법이 필요하며, 이는 번역 파이프라인9에서중요한 단계이기 때문이다.
AAV 벡터 생산을 위해, 두 가지 주요 요구 사항은 AAV 게놈과 캡시드입니다. 야생형(wt)-AAV의 게놈은 길이10에서약 4.7kb인 단일 좌초 DNA이다. wt-AAV 게놈은 게놈의 양끝에서 발견되는 반전된 말단 반복(ItR)을 포함하며, 이는 포장에 중요하며, 담당자 및 캡 유전자(11). 게놈 복제, 바이러스 캡슐화, 바이러스 캡슐화에 필요한 렙 및 캡 유전자는 바이러스 게놈으로부터 제거되고 AAV 벡터생산(12)을위한 트랜스에서 제공된다. 바이러스 게놈에서 이러한 유전자의 제거는 프로모터 및 polyA 신호를 포함하여 치료 간유전자 및 모든 필요한 규제 요소에 대한 공간을 제공합니다. ItR은 적절한 게놈 복제 및 바이러스 캡슐화를 보장하기 위해 벡터 게놈에 남아있다 13,14. 유전자 발현의 역학을 개선하기 위해 AAV 벡터 게놈은 자체 보완적으로 설계되어 AAV 게놈 복제 시 단일 가닥에서 이중 가닥 DNA 변환으로 변환할 필요성을 완화하지만 코딩 용량을 ~2.4 kb15로감소시킨다.
AAV 게놈 설계를 넘어, 캡시드 혈청형 선택은 생체 내 AAV 벡터의 조직 및 세포 트트로피를 결정한다. 조직 트락피즘 이외에, 상이한 AAV 혈청형은 다른 유전자 발현운동학(16)을표시하는 것으로 나타났다. 예를 들어, Zincarelli외. 17 낮은 발현 혈청형 (AAV2, 3, 4, 5), 적당 한 발현 혈청형 (AAV1, 6, 8), 및 높은 발현 혈청형 (AAV7 및 9)으로 상이한 AAV 혈청형을 분류하였다. 또한 AAV 혈청형을 느린 발병 식(AAV2, 3, 4, 5) 또는 급속 발병 식(AAV1, 6, 7, 8 및 9)으로 분류하였다. 이러한 발산 열대성 및 유전자 발현 운동학은 캡시드 단백질의 아미노산 변이, 캡시드 단백질 형성 및 숙주 세포 수용체/공동 수용체와의 상호작용(18)에기인한다. 일부 AAV 캡시드는 내트라바스 내투여(AAV9)에 이어 혈액-뇌 장벽을 넘거나 내구성이 뛰어난 유전자 발현(AAV6, 6.2FF, 8, 및 9)19,20을위한 장수 근육 세포에 상주하는 능력과 같은 추가적인 유익한특성을갖는다.
이 논문은 전임상 대형 동물 모델에 사용하기 위한 고순도, 하이티터, 연구급 AAV 벡터를 생산하는 비용 효율적인 방법을 자세히 설명하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜을 사용하여 AAV의 생산은 세포 스택에서 자란 부착 된 인간 배아 신장 (HEK)293 세포로 이중 플라스미드 형광을 사용하여 달성된다. 더욱이, 연구는 AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 및 DJ21,22를포함하여 헤파린 결합 도메인을 포함하는 AAV 혈청형에 사용될 수 있는 헤파린 황산염 친화성 크로마토그래피 정제를 위한프로토콜을기술한다.
AAV 벡터의 생산에 사용할 수 있는 여러 패키징 시스템이 있습니다. 이 중, Rep 및 Cap 유전자 및 Ad 도우미 유전자(E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 및 VA RNA)가 하나의 플라스미드(pHelper) 내에 포함되는 2-플라스미드 공동 형질 전환 시스템의 사용은 일반적인 3플라스미드(triple) 트랜스포메이션에 비해 몇 가지 실질적인 장점이있으며,23개의플라미드 생산 법, 비용 절감(triple) 트랜스포메이션 에 비해 몇 가지 실질적인 장점이 있다. . 유전자 발현 카세트(pTransgene)를 함유하는 AAV 게놈 플라스미드는 ItR에 의해 측면에 있어야 하며 길이가 ~4.7kb를 초과해서는 안 됩니다. 벡터 티터 및 순도는 형질 전환 시 잠재적인 세포독성 효과로 인해 트랜스진에 의해 영향을 받을 수 있다. 벡터 순도의 평가는 본원에 기재된다. 이 방법을 사용하여 생성된 벡터는 각각 1x10 13 vg/mL을 산출하며, 마우스, 햄스터 및 소 동물 모델에서 평가하였다.
표 1: 필요한 솔루션의 구성. 프로토콜 전체의 다양한 솔루션에 필요한 구성 요소의 백분율 및 볼륨을 포함한 필요한 정보입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 &무; m 필터</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>SM2001C</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td>주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑</td></tr><tr><td>착용 10 챔버 셀스택</td><td>Corning</td><td>3271</td><td></td></tr><tr><td>1L PETG 병</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2019-1000</td><td></td></tr><tr><td>30% 아크릴아미드/비스 솔루션</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>96웰 스커트 플레이트</td><td>FroggaBio</td><td>FS-96</td><td></td></tr><tr><td>접착 플레이트 씰</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄(APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용</td></tr><tr><td>혈액 및 조직 청소 키트</td><td>Qiagen</td><td>69506</td> 프로토콜 Bromophenol blue Fisher Scientific B392-5 주의<td>의 섹션 4.6에서 DNA 청소에 사용합니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용</td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Greiner bio-one</td><td>7000232</td><td>15cm 플레이트</td></tr><tr><td>배양 원뿔형 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>15mL 원뿔형 튜브</td></tr><tr><td>배양 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>14955240 50mL 원뿔형 튜브</td></tr><tr><td>1000mg/L D-포도당, L-글루타민</td><td>Cytiva 생명 과학</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>그린필드</td><td>P016EA95</td><td>에틸 알코올(95% vol)을 섹션 3.7.4의 경우 20%, 섹션 6.1.1.1의 경우 70%로 희석</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with Mg2+ and Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH302268.02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS without Mg2+ and Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 세포</td><td>American Tissue Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td>수령 즉시 제조업체에 설명된 대로 세포와 배양을 해동합니다. s 프로토콜. 세포가 최소한으로 계대형성되고 잘 자라면, 분취액에서 미래를 위해 분획을 동결하고 액체 질소에 저장합니다. 항상 통로 번호 30 아래의 셀을 사용하십시오. 배양된 세포가 30회 이상 계대측정된 후에는 저장된 분취액</td></tr><tr><td>HEK293 숙주 세포 단백질 ELISA 키트</td><td>Cygnus Technologies</td><td>F650S</td><td>Follow manufacturer에서 배양을 다시 시작하는 것이 좋습니다. s 지침</td></tr><tr><td>헤파린 황산염 칼럼</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>17040703</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KC34120</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-글루타민 (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td></td></tr><tr><td>대용량 원심분리기 튜브 지지 쿠션</td><td>Corning</td><td>CLS431124</td><td>지지 쿠션은 반드시 대용량 원심분리기 튜브와 함께 사용해야 하며, 원심분리기 로터에 적절한 V-바닥 쿠션이 있어야 합니다.</td></tr><tr><td>대용량 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>CLS431123-6EA</td><td>500 mL 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브, 사용 전 살균</td></tr><tr><td>Molecular Grade Water</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5125</td><td>주의. 장갑 착용</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP35810</td><td></td></tr><tr><td>Optimem, 감소 혈청 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>사용 전 멸균</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>세포에 사용하기 위해 1x로 희석</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>pHelper plasmid</td><td>De novo design or obtained from plasmid</td><td>repository NA</td><td></td></tr><tr><td>Pipet basin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>멸균 피펫 분지</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)</td> 구매<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>주의. 장갑</td></tr><tr><td>착용 폴리에틸렌이민(PEI)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>제조사 따르기' 1L 솔루션을 생산하기 위한 지침. 0.22&뮤; M 여과하고 4°C에 저장하십시오; C</td></tr><tr><td>폴리 프로필렌 반 스커트 PCR 플레이트</td><td>FroggaBio</td><td>WS-96</td><td></td></tr><tr><td>폴리 소르 베이트 20 (트윈 20)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>주의. 장갑을 착용</td></tr>하십시오 <tr><td>폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>10600023</td><td>집게를 사용하여 조작하십시오. 장갑을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>Primary Antibody</td><td>Progen</td><td>65158</td><td></td></tr><tr><td>Protein Ladder</td><td>FroggaBio</td><td>PM008-0500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>pTrangene plasmid</td><td>De novo design or obtained from plasmid repository</td><td>NA</td> 섹션 5.0 Pump tubing Cole-Parmer<td>의 AAV 적정과 호환되려면 게놈에 SV40 polyA를 포함해야 합니다</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td>RK-96440-14</td><td>분획 E1-E5</td></tr>, <tr><td>RQ1, Dnase 10, 반응 완충액</td><td>Promega</td><td>M6101</td>, 섹션 4.0 RQ1 Rnase-free Dnase Promega M6101 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>샘플 희석제</td><td>Cygnus Technologies</td><td>I700</td>의 프로토콜에서 10배 농도로 사용 <td>HEK293 숙주 세포 단백질 ELISA 키트</td></tr><tr><td>와 함께 사용하려면 별도로 구매해야 합니다.2차 항체, HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G-21040</td><td></td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>옥소이드</td><td>LP0033B</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨(SDS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28312</td><td>주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용</td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-4</td><td></td></tr><tr><td>SV40 폴리A 프라이머 프로브</td><td>IDT</td><td></td><td>합성을 위한 IDT 인용을 위해 표 X의 순서를 사용하십시오</td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15524010</td><td>주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810024</td><td>Ultra-4 Centrifugal 10K 장치는 10000 분자량 컷오프가 있으므로 사용해야 합니다</td></tr>. <tr><td>세포 용해를 위한 범용 뉴클레아제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td>범용 qPCR 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>M3003L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용</td></tr><tr><td>주의:&nbsp; 위험한 화학 물질 사용에 대한 지침은 재료 표를 참조하십시오.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

대형 동물 모델의 전임상 연구를 위한 세포 스택에 있는 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 인간을 위해 승인된 3개의 AAV 유전자 치료와 함께 가장 임상적으로 진보된 유전자 치료 벡터 중 하나입니다. AAV에 대한 새로운 응용 프로그램의 임상 발전은 개, 양 및 비인간 영장류를 포함한 더 큰 동물 모델로 마우스와 같은 작은 동물 모델에서 전환하는 것을 포함합니다. 더 큰 동물에 AAV를 투여의 한계 중 하나는 하이 티터 바이러스의 대량에 대한 요구 사항입니다. 서스펜션 세포 배양은 AAV 벡터 생산을 위한 확장 가능한 방법이지만, 장비(예를 들어, 생물반응기)가 있거나 이러한 방식으로 AAV를 생산하는 방법을 아는 연구실이 거의 없습니다. 더욱이, AAV 티터는 부착된 HEK293 세포에 비해 현탁액 HEK 293 세포에서 생산될 때 현저히 낮습니다. 여기에 설명된 셀 스택을 사용하여 다량의 하이티터 AAV를 생산하는 방법이다. AAV를 적발하기 위한 자세한 프로토콜과 벡터 순도 유효성을 검사하는 방법도 설명되어 있습니다. 마지막으로, 양 모델에서 AAV 매개 된 유전자 발현의 대표적인 결과가 제시된다. 부착 된 세포에서 AAV 벡터의 대규모 생산을위한이 최적화 된 프로토콜은 분자 생물학 실험실이 더 큰 동물 모델에서 새로운 AAV 치료의 테스트를 진행할 수 있게합니다.

작은 설치류 모델에서 더 큰 동물 모델로 의번역및 최종 임상 응용 프로그램은 더 큰 동물을 트랜스포유하고 치료 효과를 달성하는 데 필요한 많은 양의 AAV로 인해 중요한 과제를 제시합니다. 합리적으로 설계된 AAV6.2FF 캡시드의 트랜스듀션 효율을 비교하기 위해, 이전에는 AAV63,마우스, 햄스터 및 양에 비해 뮤린 근육 세포에서 의 연도 효율이 101배 증가하여 인간 단클론 항체(hIgG)를 발현하는 AAV6.2FF를 투여하였다. AAV6.2FF-hIgG 발현 벡터는 CASI 프로모터4,우드척 간염 바이러스 후 조절 원소(WPRE) 및 SV40 폴리아 서열을 포함하였다. 6주 된 암컷 BALB/c(n=4) 마우스는 근육내(IM)를 투여하여 40 μL에서 AAV6.2FF-hIgG의 1 x10 11 vg을 투여하였으며, 혈액은 hIgG 모니터링을 위한 AAV 투여 후 0, 7, 14, 21 및 28일에 수집되었다. 4주된 ...

여기서 는 세포 스택 및 친화성 크로마토그래피 정제에서 자란 부착 된 HEK 293 세포를 사용하여 연구 급 AAV 벡터의 대규모 생산을위한 상세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 지속적으로 >1 x10 13 벡터 게놈/mL을 산출하여 대규모 동물 연구에 적합한 벡터 양을 제공합니다.

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

AAV 바이러스 벡터의 생산을위한이 프로토콜은 비용 효율적이며 전임상, 대형 동물 모델에서 사용하기 위한 고순도, 하이 티터, 연구 급 AAV를 산출합니다. 이 기술은 세포 배양 챔버에서 부착 HEK293 세포를 사용, 이는 시간 효율적이고 덜 실습, 세포에 적은 중단을 허용. 이 프로토콜은 유전자 치료의 분야에 대한 바이러스 벡터 생산에 크게 도움이 될 수 있으며, 또한 헤파란 황산염을 결합하는 다른 AAV 혈청형의 생산에 사용될 수 있다.시작하려면 80%에 도달하면 배양에서 HEK293 세포를 수집합니다. PBS의 3 밀리리터로 세포 배양 판을 부드럽게 세척하기 전에 미디어를 흡인하십시오. 그런 다음 PBS를 흡인하고 트립신의 세 밀리리터를 추가합니다.섭씨 37도에서 플레이트를 2분간 배양합니다. 인큐베이션 후, 트립신을 중화하고, 접시에 완전한 DMEM의 7 밀리리터를 추가하여, 50 밀리리터 원추형 튜브에서 상퍼를 수집합니다. 튜브를 부드럽게 반전하여 세포가 균질한지 확인합니다.세포 밀도를 결정하려면 세포 샘플의 마이크로리터 10개와 트라이팬 블루 10마이크로리터를 혼합합니다. 그리고 셀 카운트 슬라이드에 혼합물을 추가하여 셀 카운터에서 분석한다. 세포 현탁액을 미리 따뜻하게 한 완전 DMEM과 혼합하여 배양 챔버를 볼 수 있습니다.챔버를 부드럽게 회전하여 셀을 균등하게 분배합니다. 챔버를 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 배양합니다. 세포 배양챔버 이외에, 10~제4세포에서 제4세포에서 15센티미터 플레이트에서 제곱된 배양세포가 결합을 위한 기준으로 한다.65시간의 인큐베이션 후, 세포가 80~90%의 컨실수일 때, 세포 배양 챔버 포트에 폴리에틸렌-DNA 및 DMEM 혼합물을 천천히 첨가한다. 액체를 모든 행에 균등하게 분배한 후 섭씨 37도, 이산화탄소 는 72시간 동안 5%로 배양됩니다. 인큐베이션 후, 세포 배양실을 격렬하게 흔들어 세포가 흐리게 될 때까지 세포를 빼내고 4~500밀리리터 원심분리관에 붓습니다.18, 000회 G에서 4°C에서 30분간 원심분리로 세포를 펠렛합니다. 1리터 PETG 병에 정제된 상체를 붓고 500밀리리터 원심분리기 튜브에서 50밀리리터의 허가된 완충제에서 셀 펠릿을 재보페수합니다. 37도에서 60분 동안 튜브를 배양합니다.인큐베이션 후, 튜브를 18, 000배 G에서 30분 동안 원심분리하고, 상체를 동일한 1리터 PETG 병으로 옮긴다. 영하 80도에 보관하십시오. 하룻밤 사이에 4도에서 원유 를 해동하십시오.해동되면 0.22 미크론 필터를 사용하여 필터링하십시오. 정화 단계 바로 전에 사용 중인 각 헤파린-세파로즈 컬럼에 대해 4밀리리터의 필터 전처리 버퍼를 추가하여 원심 농축기를 전달합니다. 튜브를 연동 펌프에 놓습니다.솔루션과 미디어를 순차적으로 실행합니다. 튜브에 5 밀리리터 헤파린-세파로즈 컬럼을 부착하고, 기둥을 통해 25밀리리터의 바젤 DMEM을 실행하여 크로마토그래피를 준비합니다. 그런 다음 여과된 원유 의 0.2 마이크로몰라를 초당 1~2방울의 유량으로 컬럼에 로드합니다.마그네슘과 칼슘을 함유한 염화 나트륨 HBSS 300밀리어로 5밀리리터를 순차적으로 세척하고 5개의 elutions를 E1에서 E5로 라벨을 부착합니다. 준비가 되면 전처리 버퍼를 포함하는 원심 농축기를 900회 G에서 2분 동안 회전시합니다. 흐름을 삭제합니다. 원심 농축기 필터를 마그네슘과 칼슘으로 4밀리리터로 2분간 1000회 G로 회전시 세척합니다.그런 다음 원심 농축기에 용출 E2를 추가하고 5 분 동안 1000 회 G에서 회전합니다. 흐름을 삭제합니다. 마찬가지로 농축 된 바이러스가 약 1 밀리리터가 될 때까지 원심 농축기로 용출 E3를 회전시.P200 여과 팁을 사용하여 원심 농축기에서 농축 된 바이러스를 제거하고 멸균 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브로 수집합니다. 바이러스의 수집 후, 마그네슘과 칼슘과 HBSS의 200 마이크로 리터원 원심 농축기를 헹구세요. 파이펫은 30초 동안 힘차게 위아래로 하여 막에 부착된 바이러스를 빼내고, 동일한 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 농축 바이러스를 수집한다.튜브를 잘 섞습니다. 4섭씨로 보관하기 전에 기둥을 씻고 20%에탄올로 채점합니다. 펌프 튜빙을 수산화 나트륨 1개에 보관합니다.AAV6.2FF 캡시드의 트랜스듀션 효율은 근내 투여 시 28일 동안 쥐, 햄스터 및 양에서 비교되었다. 마우스는 AAV6.2FF 인간 IgG의 킬로그램당 12번째 벡터 게놈에 5회 투여, 혈청에서 인간 IgG의 밀리리터 당 171 에서 237 마이크로그램 사이에 발현하였다. 햄스터는 AAV6.2FF 인간 IgG의 킬로그램 당 13 벡터 게놈에 2회 10에서 투여되며, 마우스보다 훨씬 높은 수준의 인간 IgG를 발현한다.대형 동물 모델은 플라즈마에서 인간 IgG 수준의 밀리리터 당 평균 35 마이크로그램을 표현할 수 있었습니다. 대형 동물 모델은 생체 내에서 AAV 트랜스진의 발현을 결정하고, 전간유전자가 관심 있는 장애 또는 질병에 대한 치료 효과가 있는지 를 결정할 수 있다. 이 연구는 AAV6.2FF의 뛰어난 트랜스듀션 능력, 골격 근육의 새로운 AAV 6 세로형 벡터, 생체내 AAV 바이러스 벡터의 낮은 면역원성을 선보였다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 벡터를 위해 점점 중요 해지고...

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

우리는 molecularly 유전자 가족 걸어갔다 통해 합성 Adeno-관련 바이러스 (AAV) 유전자 치료 벡터를 엔지니어이며 진화하는 기본적인 기법을 보여줍니다. 더욱이, 우리는 선택과 문화 혹은 생쥐의 표적 세포에 대한 향상된 특성을 가진 각각의 키메라 capsids의 분석을위한 일반 지침 및 대표 예제를 제공합니다.

유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

여기, 우리가 생산 하는 효율적이 고 재현 가능한 전략, titer, 및 품질 관리 일괄 adeno 관련 바이러스 벡터의 설명 합니다. 그것은 높은 titer로 벡터 준비를 하면 (13 벡터 게놈/10ml x ≥1)와 고 순도, 생체 외에서 또는 vivo에서 사용에 대 한 준비.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

본 프로토콜에서, AAV2 벡터는 바쿨로바이러스(BV)-AAV2-녹색 형광단백질(GFP) 또는 BV-AAV2-rep-cap 감염Sf9 세포를 현탁액 배양에서 감염한 Sf9 세포를 결합하여 스포드옵테라 검거다(Sf9) 곤충 세포를 공동 배양하여 생성된다. AAV 입자는 세제, 명확성, 친화열 크로마토그래피에 의해 정제되며 접선 흐름 여과에 의해 농축됨을 사용하여 세포로부터 방출된다.

바쿨로바이러스-곤충세포배양시스템을 이용한 아데노 관련 바이러스(AAV)2 벡터의 생산 및 정화를 위한 공정 개발

이 원고에서 결막 하 주사는 주입 / 회수 주사기 펌프와 미세 주입 바늘과 결합 된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주사 시스템을 사용하여 마우스의 안구 조직에 대한 유효한 벡터 전달 방법으로 입증됩니다. 이 주사 시스템은 다른 안내 내 투여 경로에도 적용 가능합니다.

작은 동물 모델에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 결막하 투여

여기에서 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 제시되어 상용 공급업체에서 연구 목적으로 사용할 수 있는 구성 요소를 사용하여 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄일 수 있습니다.

HEK293 부유 세포를 사용한 고수율 Adeno 관련 벡터 배치 생산

유전자 치료 분야가 계속 발전함에 따라 이러한 문제를 해결할 수 있는 혁신적인 방법에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 여기에서는 cell factory 플랫폼을 사용하여 고수율 및 고순도 AAV 벡터를 생성하는 프로세스를 간소화하여 in vivo 연구의 품질 표준을 충족하는 고유한 방법을 제시합니다.

Cell Factory Platform을 활용하여 고역가, 고품질 아데노 관련 바이러스 벡터를 생성하기 위한 간소화되고 표준화된 절차

해양 및 담수 시스템에 바이러스의 매출 비율은 감소하고 reoccurrence 기술로 예상하실 수 있습니다. 데이터는 연구자들이 해양 시스템에서 바이러스 중재의 미생물 사망률의 속도를 추측할 수 있습니다.

아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측

이 문서는 엔도 또는 ectoparasitism을 감지 선별 쥐 및 생쥐를위한 각종 절차에 대해 설명합니다. 여러 진단 assays이 시연되고, 살아있는 동물에서 사용하기에 적합 사람과 동물의 안락사 후 사용되는 모두. 쥐, 마우스 기생충의 식별에 도움을 사진이 포함됩니다.

연구실 고양이와 마우스에 외부의 뜻과 Endoparasites의 진단

학습하세요 HEK293 세포를 이용한 고순도 AAV 바이러스 벡터 생산 방법을 통해 대형 동물 모델의 전임상 유전자 치료 연구를 효율적으로 수행하는 기술을 익히세요.

대형 동물 모델의 전임상 연구를 위한 세포 스택에 있는 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산

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