Name: 대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 배우세요 대식세포 발달에서 전사인자를 선별하는 방법을 iHSPCs와 렌티바이러스 매개 shRNA 녹다운을 사용하여. 이 기술은 안정적인 녹다운 세포주를 생성하여 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tz-Ling Chen 박사의 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 shRNA 렌즈바이러스 (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw)를 제공하는 국립 RNAi 코어 시설 (학계 시니카, 대만)에 감사드립니다. 이 작품은 대만 과학기술부(대부분 108-2320-B-002-037-MY3 및 MOST 109-2320-B-002-002-054-MY3)에 의해 지원되었다.

렌티바이러스의 취급은 국립 대만 대학 의과 대학의 환경 보건 및 안전학과의 규정에 따라 수행됩니다.
1. 불멸의 조혈 줄기 및 선조 세포주 준비 (iHSPC)
<ol><li>100 ng/mL FL 및 1 μM β-estradiol을 포함하는 완전한 RPMI 1640 배지에서 iHSPC 세포줄을 유지합니다.</li>
	<li>3일마다 1:10의 비율로 세포를 통과합니다. 참고: 10% 태아 소 혈청(FBS), 5 x 10-5M β-메르카포에탄올, 10 μg/mL 젠타미신으로 보충하여 완전한 RPMI 1640 배지를 만듭니다. 재조합 뮤린 FL도 시판됩니다.</li>
</ol>2. 렌티바이러스 트랜스듀션
<ol><li>플레이트 iHSPC는 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol 및 8 μg/mL 폴리브레인을 포함하는 완전한 배지의 1mL에서 12웰 플레이트에서 1 x 105 셀/웰의 밀도로. 참고: 폴리브레인의 농도는 세포 유형에 따라 다르며 일반적으로 4-8 μg/mL 범위에 있습니다.</li>
	<li>100의 감염 (MOI)의 복합성에 각 우물에 shRNA 운반 렌티 바이러스를 추가합니다. 참고: 렌티바이러스 벡터는 푸오마이신 선택 마커가 있는 pLKO.1-Puro입니다(도 1). LacZ, Tcf4 및 Id2 에 대한 shRNAs의 대상 시퀀스는 각각 재료 표에 나열됩니다. MOI는 감염 도중 세포 당 추가되는 virions의 수에 의해 정의됩니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62730/62730eq01.jpg">
</li>
	<li>37°C에서 90분 동안 1,100 x g 에서 플레이트를 회전시합니다. 참고: 스핀 감염은 스윙 버킷 로터를 사용하여 수행됩니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 감염된 세포를 함유하는 플레이트를 배양한다. 참고: 세포가 폴리브레인에 민감한 경우 스핀 감염 후 폴리브레인없이 완전한 배지로 세포를 새로 고칩니다.</li>
	<li>감염 후 100 ng/mL FL 및 1 μM β-estradiol 24 h를 포함하는 완전한 배지를 가진 세포를 새로 고침합니다.</li>
	<li>추가 24 시간 후에 감염된 세포를 선택하기 위하여 매체에 puromycin의 6 μg/mL를 추가합니다. 참고: 트랜스듀싱렌티바이러스 벡터는 일반적으로 푸오마이신 내성 유전자를 포함한 유전자를 발현하는 데 48h가 소요됩니다. 푸오마이신의 농도가 각 세포주에 최적화되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>3일마다 100 ng/mL FL, 1μM β-estradiol 및 6 μg/mL 퓨로마이신을 포함하는 선택 배지를 새로 고치고 안정적으로 변환된 iHSPC 세포를 확장하기 위해 적어도 1주일 동안 세포를 유지한다. 참고: Puromycin 선택은 일반적으로 48 시간 후에 효력을 발휘하고, 선택의 기간은 셀 모형에 달려 있습니다.</li>
</ol>3. 역전사 및 실시간 PCR(RT-PCR)에 의한 녹다운 효율 측정
<ol><li>1 x 107 shLacZ, shTcf4 및 shId2 안정녹다운 iHSPC 세포로부터 의 추출물 총 RNA를 이소프로판올로 수성 층으로부터 시약 및 침전 RNA를 사용하여 RNA를 75% 에탄올로 세척하였다.</li>
	<li>DEPC 처리 H2O의 5 μL로 RNA(~ 5 μg)를 용해하고 농도를 1 μg/μL로 조정합니다.</li>
	<li>RNA의 1-3 μg를 가지고, DEPC 처리 H2O와 혼합 17.4 μL의 최종 부피, 1 단위 / μL RNase 무료 DNase I의 1 μL을 추가하고 37 ° C에서 20 분 동안 배양하십시오. 참고: 이 단계는 RNA 샘플에서 게놈 DNA를 소화하는 것입니다.</li>
	<li>RNA 샘플에 20mM EDTA의 1 μL을 추가하고, 65°C에서 10분 동안 배양하여 DNase I를 비활성화하고 RNA 샘플을 즉시 4°C로 넣습니다.</li>
	<li>올리고(dT) 프라이머(45 μM), 5x 1위 가닥 버퍼의 6μL을 포함하는 반응 믹스의 11.6 μL을 추가, 3 μL 의 dNTP (2 mM), RNase 억제제의 0.6 μL (50 단위 /μL) 및 1 μL의 역 전사제 (200 단위/μL)를 RNA 샘플에 넣고 40 °C에서 1 h.</li>
	<li>반응을 70°C에서 10분 동안 가열하여 반응을 멈추고 반응 혼합물을 H2O 30μL로 희석시하십시오.</li>
	<li>희석된 RT 반응 믹스를 DNA 템플릿으로 복용하고 PCR은 Tcf4 또는 Id2에 대한 프라이머를 사용하여 증폭합니다(열사이클러 조건의 표 1 참조). 참고: 프라이머 시퀀스는 재료 표에 포함됩니다.</li>
</ol>4. 안정적인 녹다운 iHSPC 세포주 체의 체외 분화
<ol><li>FL의 100 ng/mL 및 1 μM β-estradiol을 포함하는 완전한 매체에서 LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4), 또는 Id2 (shId2)의 안정적인 단일 넉다운을 유지합니다.</li>
	<li>shLacZ, shTcf4 및 shId2 비분화 iHSPC를 15mL 튜브및 원심분리기로 500 x g에서 5분 동안 수집하여 세포를 펠릿합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 10mL의 PBS를 추가하여 세포를 씻으십시오. 이 단계를 두 번 반복합니다.</li>
	<li>iHSPC 세포를 2 x 105 셀/mL의 밀도로 100 ng/mL FL만 함유하는 완전한 배지의 1mL에서 12웰 플레이트로 재일시 중지 및 시드한다.</li>
	<li>3일 후 100 ng/mL FL을 포함하는 신선한 완전 매체 1mL를 추가합니다.</li>
	<li>2일 후 혈중 세포측정을 통해 분화세포(shLacZ, shTcf4 및 shId2 iHSPC)를 분석한다.</li>
</ol>5. 차별화된 DC의 흐름 세포 측정 분석
<ol><li>플레이트에서 2-3배, 실온(RT)에서 500xg에서 5분 동안 원심분리기를 위아래로 피펫하여 세포를 1.5mL 튜브로 채집한다. 참고: 시험관 내 차별화된 DC는 플레이트에 약간 부착됩니다. 부드러운 파이펫팅은 플레이트에서 DC를 복구하는 데 도움이됩니다.</li>
	<li>상체를 버리고 FACS 버퍼의 50 μL에서 셀을 다시 중단합니다. 다음으로, 안티 CD16/32 hybridoma 수퍼나탈의 50 μL을 추가하고 얼음에 5-10 분 동안 배양합니다. 참고: Fc 차단 항체는 일부 골수성 세포 및 B 세포에 발현하는 Fc 수용체에 대한 항체의 비특이적 결합을 방지하고 다양한 공급 업체를 통해 시판됩니다.</li>
	<li>형광염항체(각 항체에 대해 0.04 μg)를 직접 첨가하고 어둠 속에서 얼음에 15분 동안 배양한다. 사용되는 항체는 APC/cy7 항마우스 CD11c, FITC 항마우스 CD11b 및 PE 항마우스 B220이다. 참고: pDC는 CD11c+CD11b-B220+로 정의되며 cDC는 CD11c+CD11b+B220-로 정의됩니다.</li>
	<li>RT에서 500 x g 에서 5 분 동안 FACS 버퍼 및 원심 분리기 1 mL로 셀을 세척하십시오.</li>
	<li>FACS 버퍼의 100 μL에서 세포를 다시 중단하고 유동 세포측정에 의해 분석한다.</li>
</ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+monocytes+and+macrophages%3A+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li>
<li>Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siglec-H+is+an+IPC-specific+receptor+that+modulates+type+I+IFN+secretion+through+DAP12%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12.</a> Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+Professional+Type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).</li>
<li>Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).</li>
<li>Durai, V., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functions of murine dendritic cells.</a> Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).</li>
<li>Mashayekhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+are+the+critical+source+of+interleukin-12+that+controls+acute+infection+by+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites.</a> Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+and+monocyte-derived+CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li>
<li>Persson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+transcription-factor-dependent+CD103%28%2B%29CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+drive+mucosal+T+helper+17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).</li>
<li>Kumamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD301b%2B+dermal+dendritic+cells+drive+T+helper+2+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.</a> Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).</li>
<li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li>
<li>Grajkowska, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+expression+and+feedback+regulation+of+E+protein+TCF4+control+dendritic+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification.</a> Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).</li>
<li>Jackson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id2+expression+delineates+differential+checkpoints+in+the+genetic+program+of+CD8%CE%B1%2B+and+CD103%2B+dendritic+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages.</a> The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+interferon+regulatory+factor+4+in+CD11bhighCD8alpha-+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).</li>
<li>Rodrigues, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+lineages+contribute+to+the+heterogeneity+of+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).</li>
<li>Brown, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li>
<li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li>
<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li>
<li>Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+enhances+lipid-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer.</a> Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).</li>
<li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li>
<li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions%3A+Digesting+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Lentivirus 기반 shRNA 벡터는 종종 세포로 바이러스 성 변환에 의해 유전자 침묵에 사용되며 숙주 게놈으로 안정적인 통합을 허용합니다. 그러나, 상이한 세포 모형에 있는 각종 감과 효율을 고려해야 하고, 이 문제점을 극복하기 위하여 접근의 다수가 취해졌습니다. 
폴리브레인은 세포막상에서 전하를 중화시킬 수 있는 다정화 폴리머로, 이를 통해 배관20 동안 세포에 대한 비리온의 결합을 강화한다. 그것은 트랜스듀션 속도를 증가 시키는 효과적인 방법이지만, 또한 과도 한 금액을 추가할 때 일부 세포 유형에 독성. 이 경우 폴리브레인의 독성을 테스트하고 상이한 세포에서 농도를 최적화하는 것이 요구된다. 프로타민 황산염, 양이온 화합물, 어쩌면 세포 생존을 증가 시키기 위해 다른 접근 21. 더욱이, 감염 당일에 완전한 매체를 새로 고침하면 트랜스듀션 후 생존율을 나타낼 수 있다.
<p ...

DC는 선천적이고 적응형 면역의 주요 레귤레이터입니다1. DC는 주로 두 개의 기능적으로 구별되는 인구, 즉 pDC 및 cDC로 분류됩니다. 또한 cDC는 각각 I 형 및 유형 II cDC 또는 cDC1 및 cDC2의 두 개의 하위 집합을 포함합니다2. pDC, 발현 BST2, Siglec-H, 및 mice3,4에서 CD11c의 중간 수준은 염증 및 바이러스 감염 동안 많은 양의 IFN-I를 분비할 수 있는 세포입니다5. 그들의 강력한 IFN-I 생산 능력 때문에, 그(것)들은 또한 전신 루푸스 홍반성 (SLE)6를 포함하여 자기 면역 질병의 진행에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 의심됩니다. cDC1s는 XCR1, CD8a, CLEC9A 및 CD103의 표면 발현에 의해 정의된 마우스7, 항원 교차 프레젠테이션을 통해 세포독성 CD8+ T 세포(CTL)의 활성화 및 편광에 전문화되어, 세포내 병원체 및 암에 대한 응답으로 I 면역을 시공한다. 한편, 인간과 마우스 모두에서 CD11b 및 CD172α(Sirpα라고도 함)를 발현하는 cDC2s는 CD4+ T 세포를 활성화하고 알레르겐 및 기생충에 대한 II형 면역 반응을 촉진할 수 있으며, 세포외 박테리아 및 미생물 인식에 따른 변조형 III 면역성을 11,12로 촉진할 수 있다.
DC의 다양화는 BM. E2-2(Tcf4에 의해 인코딩)에서 조혈 줄기 및 선조 세포(HSPC)로부터의 TF그룹에 의해 결정되며 pDC13,14의 분화 및 기능에 대한 마스터 레귤레이터이다. 대조적으로, DNA 결합 2(ID2)의 억제제는 cDC 사양을 구동하고 E 단백질 활성을 차단하여 pDC 개발을 억제한다15. 또한 cDC1의 개발은 IRF8 및 BATF3가 필요하며 cDC2의 차별화는 IRF416에 따라 다릅니다. 최근 작품은 pDC17및 cDC와 그들의 전사 규정18의 이질성을 탐구했다. DC 네트워크의 복잡성으로 인해 DC의 개발 및 기능을 제어하는 다른 TF를 식별할 수 있는 플랫폼을 구축해야 합니다.
여기서, 우리는 BM 세포에서 Hoxb8의 에스트로겐 조절 핵 전좌를 표현하여 생성된 iHSPC를 (Hoxb8-FL 세포라고도 함)를 사용했다 19. iHSPC는 β 에스트라디올과 Flt3 리간드(FL)가 있는 상황에서 차별화되지 않은 단계에 남아 있는 반면, β-estradiol19의 철수 시 FL의 존재속에서 다른 DC 유형으로 차별화하기 시작합니다. 이 기능을 바탕으로, 우리는 전조 단계에서 관심의 유전자를 노크 할 수 있습니다, 다음 PDC와 CDC의 체외 분화에 미치는 영향을 검사. 따라서, 이 방법은 DC의 발달 과 기능을 조절하는 유전자를 발견하는 강력한 도구이다.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody</td><td>Biolegend</td><td>117324</td><td>(클론: N418)</td></tr><tr><td>FITC 안티-마우스/human CD11b 항체</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>(클론: M1/70)</td></tr><tr><td>PE anti-mouse/human B220 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>(Clone: RA3-6B2)</td></tr><tr><td>Cell culture</ 강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 튜브</td><td>&nbsp; ExtraGene</td><td>TUBE-170-C</td><td></td></tr><tr><td>12-well tissue culture-treated plate</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>gibco</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758-250MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol (&beta;-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>FACS 버퍼</td><td>홈메이드</td><td></td><td>포뮬러: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3</td></tr><tr><td>Flt3 리간드 (FL)</td><td>홈메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>BIOLINE</td><td>BIO-38032</td><td></td></tr><tr><td>shRNA (Taregt sequence/clone ID)</td><td>Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shId2&nbsp; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td><td>RNAi 컨소시엄 (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td><td>RNAi 컨소시엄 (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td><td>RNAi 컨소시엄 (TRC)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 rna 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

수지상 세포 (DC)는 선천적이고 적응성 면역 반응을 연결하는 중요한 항원 제시 세포입니다. DC는 이질적이며 기존의 DC(cDC) 및 플라즈마 사이토이드 DC(pDC)로 나눌 수 있습니다. cDC는 순진한 T 세포를 위한 항원 제시를 전문으로 합니다. 한편, pDC는 바이러스 감염 시 다량의 타입 I 인터페론(IFN-I)을 생성할 수 있다. DC의 사양은 골수(BM)의 DC 전구체의 초기 단계에서 발생하며 전사 인자(TFs)의 네트워크에 의해 정의됩니다. 예를 들어, cDC는 높은 표현 ID2, PC는 높은 표현 E2-2 동안. 점점 더 많은 DC 하위 집합이 식별되고 있기 때문에 DC 개발을 제어하는 특정 TF를 이해하는 데 관심이 증가하고 있습니다. 여기서, 우리는 짧은 머리핀 RNA (shRNA)를 불멸의 조혈 줄기 및 선조 세포 (iHSPC) 라인으로 운반하는 렌즈 바이러스를 전달하여 시험관 내에서 DC 분화에 중요한 TFs를 선별하는 방법을 확립합니다. 안정적인 녹다운 세포 주 cDC 및 pDC 전위는 셀토메트리에 의해 분석된다. 이 접근은 시험관내선에서 선조에게서 DC 운명을 잠재적으로 지배하는 유전자를 확인하는 플랫폼을 제공합니다.

렌티바이러스 벡터 pLKO.1-Puro의 지도가 표시됩니다(도 1). lacZ에 대한 shRNA를 발현하는 렌즈바이러스(비표적 제어), Tcf4 및 iHSPCPc에서 IHSPCC에서 확인된 녹다운 효율은 tcf4의 발현이 shLacZ iHSPCPC(그림 2A)에 비해 shTcf4 iHSPC에서 감소된 것으로 나타났습니다. 한편, id2의 감소된 발현은 shLacZ iHSPC 제어(도 2B)에 비해 shId2 iHSPC에서도 관찰되었다. shLacZ, shTcf4 및 shId2 iHSPC 세포주 FL을 가진 시험관내 pDC 및 cDC로 분화되었다. shLac...

여기서 우리는 체외 DC 분화에 대한 안정적인 녹다운 세포주를 얻기 위해 shRNA의 렌즈바이러스 트랜스듀션을 사용하여 수지상 세포(DC)의 개발에 관여하는 잠재적 전사 인자를 선별하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

수지상 세포, 또는 DC는, 선천적이고 적응성 면역 계통을 연결하는 중요한 면역 세포입니다. DC는 이질적이지만,이 방법은 전사 요인을 포함하여 DC 개발을 조절 할 수있는 유전자를 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 시험관 내의 전구에서 DC 발달을 통제하는 유전자를 확인하는 간단하고 빠른 방법을 제공합니다.시작하려면, 완전한 RPMI 1640 배지에서 불멸의 조혈 줄기 및 선조 세포 또는 iHSPC를 유지, FLT3 리간드의 밀리리터 당 100 나노 그램과 하나의 마이크로 몰라 베타 estradiol로 보충. 렌티바이러스 트랜스듀션의 경우, iHSPC를 12개의 웰 플레이트에서 10배의 밀도로 잘 10배, FLT3 리간드, 베타 에스트라디올 및 폴리브레인을 함유한 완전한 배지의 1밀리리터를 잘 한다. 이어서, 100의 감염의 복합성에서 각각의 잘 짧은 머리핀 RNA를 운반하는 렌티바이러스를 추가한다.다음으로, 90분 동안 1100배, 섭씨 37도에서 플레이트를 돌린 다음, 감염된 세포를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한다. 다음 날, 원심분리에서 15밀리리터 튜브로 세포를 수집하여 폴리브레인을 제거하고, FLT3 리간드 및 베타 estradiol을 포함하는 신선한 완전한 배지로 미디어를 대체한다. 추가 24 시간 후에, 감염된 세포를 선택하기 위하여 매체에 puromycin의 밀리리터 당 6 마이크로그램을 추가합니다.선택 매체를 3일마다 교체하고 안정적으로 변환된 iHSPC를 확장하기 위해 적어도 1주일 동안 셀을 유지관리한다. FLT3 리간드 및 베타 에스트라디올로 보완된 완전한 매체에서 LacZ, Tcf4 및 Id2용 안정적인 넉다운 iHSPC를 생성하고 유지합니다. 시험관 분화를 시작하려면 15 밀리리터 튜브로 미분화 iHSPC를 수집하고 원심분리에 의해 세포를 펠릿한다.원심 분리 후, 상체를 버리고 PBS의 10 밀리리터로 세포를 두 번 씻으십시오. 두 번째 세척 후, FLT3 리간드만 을 포함하는 완전한 배지에서 세포를 다시 중단한 다음 밀리리터당 2회 10~5분의 1의 밀도로 12개의 웰 플레이트로 셀을 종자한다. 3일 후 FLT3 리간드를 함유한 신선한 완전 배지 1밀리리터를 추가합니다.추가 이틀 후, 혈류 세포측정에 의해 분화된 세포를 분석하였다. 유동 세포 측정 분석을 위해, 플레이트에서 2~3회 위아래로 세포를 피펫한 다음 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 수집합니다. 팩스 버퍼의 50 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하기 전에 튜브를 원심 분리하고 슈퍼 네티얼을 폐기하십시오.다음으로, 안티 CD16 의 50 마이크로 리터를 32 hybridoma 상수로 추가하고 얼음에 5 ~ 10 분 동안 배양합니다. 그런 다음, 형광 염료-컨쥬게이드 항체를 세포에 직접 추가하고 어둠 속에서 얼음에 15분 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 팩스 버퍼의 1 밀리리터로 세포를 세척하고 샘플을 원심분리합니다.원심 분리 후, 팩스 버퍼의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 흐름 세포 측정에 의해 샘플을 분석합니다. iHSPCS에서 LacZ, Tcf4 및 Id2의 짧은 헤어핀 RNA 매개 녹다운 후 RTQ-PCR에 의한 녹다운 효율확인은 LacZ 녹다운 iHSPC에 비해 Tcf4 및 Tcf4 넉다운 iHSPC의 발현이 감소한 것으로 나타났습니다. Id2 녹다운 iHSPC에서 Id2 발현에 대해 도유사한 결과가 관찰되었다.5일 동안 LacZ 녹다운 iHSPC를 배양한 후, 수지상 세포 집단을 나타내는 CD11c 양성 세포의 주파수는 약 95%였으며, Tcf4 또는 Id2를 쓰러뜨리면 CD11c 양성 수지상 세포의 생성이 약간 감소하였다. LacZ 녹다운 iHSPC에서 파생된 CD11c 양성 수지상 세포의 추가 분석에 따르면 70%는 종래의 수지상 세포였으며 22%는 플라즈마세포 이드 수지상 세포였습니다. Tcf4 녹다운 iHSPC는 LacZ 가래가 제어하는 플라즈마 세포 분해 수지상 세포의 상당히 낮은 비율을 생성했습니다.대조적으로, Id2 녹다운 iHSPC는 LacZ 녹다운 대조군보다는 기존의 수지상 세포의 상당히 낮은 비율을 생성하지만 플라즈마 세포 이드로이드 수지상 세포의 높은 비율을 생성하였다. 스핀 감염은 렌즈바이러스 운반 shRNA의 변환 효율을 iHSPC로 증가시다. 이 기술은 전사 요인의 역할을 해결하고 DC 개발에 관여 할 가능성이 있는 사이토카인 신호 변환 또는 신진 대사에 있는 그밖 유전자의 연구를 용이하게 합니다.

study-dendritic-cell-development-short-hairpin-rna-mediated-gene

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

우리는 세포 성숙을 유발하지 않고 플라스미드 DNA 나 siRNA 중과 기본 인간 단핵구 파생 돌기 세포를 transfecting의 효율적인 방법으로서 최적화된 높은 처리량 nucleofection 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 타겟 유전자 mRNA와 단백질 수준 모두에서 릭 - 전의 성공적인 siRNA의 입을 대한 증거를 제공합니다.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

이 비디오는 성체 쥐의 골수에서 수지상 세포(T 세포를 활성화하는 핵심 항원 제시 세포)를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

골수 유래 수지상 세포 생성: 마우스 골수에서 수지상 세포를 생성하는 방법

이 동영상에서는 shRNA 렌티바이러스 벡터의 transduction을 수행하여 immortalized hematopoietic stem and progenitor cells (iHSPCs)에서 안정적인 knockdown cell line을 얻는 방법을 보여줍니다.

짧은 헤어핀 RNA 매개 유전자 knockdown in iHSPCs In vitro: 특정 유전자 발현의 Knockdown을 위해 iHSPC에 렌티바이러스 기반 shRNA 발현 시스템 전달

이 동영상은 일반적인 림프구 전구 세포(CLP)에서 형질세포(plasmacytoid dendritic cell, pDC)를 생성하는 체외 분석을 보여줍니다. Fms-like tyrosine kinase-3 ligand(FL)가 있는 상태에서 γ조사된 공급 세포와 함께 정제된 CLP를 공동 배양하면 CLP는 비부착성 pDC로 분화되며, 유세포 분석을 사용하여 그 존재를 확인합니다.

In vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors(일반 림프구 전구 세포에서 Plasmacytoid 수지상 세포의 체외 생성)

이 프로토콜은 FACS - 매개 세포 분리, 유체 역학적 유전자 전달하고, Peyer의 패치 면역 부분 집합의 흐름 분석과 관련된 기술을 사용하여, 일반적인 돌기 세포의 전구 세포에서 Peyer의 패치 plasmacytoid 수지상 세포의 분화를 평가하는 실험 절차에 대해 설명합니다.

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

이 연구에서는 Flt3 리간드가 있는 상태에서 AC-6 공급세포와 공통 림프구 전구세포를 공동 배양하여 pDC를 효율적으로 생성할 수 있는 체외 배양 시스템을 제시합니다.

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

배우세요 대식세포 발달에서 전사인자를 선별하는 방법을 iHSPCs와 렌티바이러스 매개 shRNA 녹다운을 사용하여. 이 기술은 안정적인 녹다운 세포주를 생성하여 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

더 많은 동영상 탐색