대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

수지상 세포, 또는 DC는, 선천적이고 적응성 면역 계통을 연결하는 중요한 면역 세포입니다. DC는 이질적이지만,이 방법은 전사 요인을 포함하여 DC 개발을 조절 할 수있는 유전자를 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 시험관 내의 전구에서 DC 발달을 통제하는 유전자를 확인하는 간단하고 빠른 방법을 제공합니다.

시작하려면, 완전한 RPMI 1640 배지에서 불멸의 조혈 줄기 및 선조 세포 또는 iHSPC를 유지, FLT3 리간드의 밀리리터 당 100 나노 그램과 하나의 마이크로 몰라 베타 estradiol로 보충. 렌티바이러스 트랜스듀션의 경우, iHSPC를 12개의 웰 플레이트에서 10배의 밀도로 잘 10배, FLT3 리간드, 베타 에스트라디올 및 폴리브레인을 함유한 완전한 배지의 1밀리리터를 잘 한다. 이어서, 100의 감염의 복합성에서 각각의 잘 짧은 머리핀 RNA를 운반하는 렌티바이러스를 추가한다.

다음으로, 90분 동안 1100배, 섭씨 37도에서 플레이트를 돌린 다음, 감염된 세포를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한다. 다음 날, 원심분리에서 15밀리리터 튜브로 세포를 수집하여 폴리브레인을 제거하고, FLT3 리간드 및 베타 estradiol을 포함하는 신선한 완전한 배지로 미디어를 대체한다. 추가 24 시간 후에, 감염된 세포를 선택하기 위하여 매체에 puromycin의 밀리리터 당 6 마이크로그램을 추가합니다.

선택 매체를 3일마다 교체하고 안정적으로 변환된 iHSPC를 확장하기 위해 적어도 1주일 동안 셀을 유지관리한다. FLT3 리간드 및 베타 에스트라디올로 보완된 완전한 매체에서 LacZ, Tcf4 및 Id2용 안정적인 넉다운 iHSPC를 생성하고 유지합니다. 시험관 분화를 시작하려면 15 밀리리터 튜브로 미분화 iHSPC를 수집하고 원심분리에 의해 세포를 펠릿한다.

원심 분리 후, 상체를 버리고 PBS의 10 밀리리터로 세포를 두 번 씻으십시오. 두 번째 세척 후, FLT3 리간드만 을 포함하는 완전한 배지에서 세포를 다시 중단한 다음 밀리리터당 2회 10~5분의 1의 밀도로 12개의 웰 플레이트로 셀을 종자한다. 3일 후 FLT3 리간드를 함유한 신선한 완전 배지 1밀리리터를 추가합니다.

추가 이틀 후, 혈류 세포측정에 의해 분화된 세포를 분석하였다. 유동 세포 측정 분석을 위해, 플레이트에서 2~3회 위아래로 세포를 피펫한 다음 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 수집합니다. 팩스 버퍼의 50 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하기 전에 튜브를 원심 분리하고 슈퍼 네티얼을 폐기하십시오.

다음으로, 안티 CD16 의 50 마이크로 리터를 32 hybridoma 상수로 추가하고 얼음에 5 ~ 10 분 동안 배양합니다. 그런 다음, 형광 염료-컨쥬게이드 항체를 세포에 직접 추가하고 어둠 속에서 얼음에 15분 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 팩스 버퍼의 1 밀리리터로 세포를 세척하고 샘플을 원심분리합니다.

원심 분리 후, 팩스 버퍼의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 흐름 세포 측정에 의해 샘플을 분석합니다. iHSPCS에서 LacZ, Tcf4 및 Id2의 짧은 헤어핀 RNA 매개 녹다운 후 RTQ-PCR에 의한 녹다운 효율확인은 LacZ 녹다운 iHSPC에 비해 Tcf4 및 Tcf4 넉다운 iHSPC의 발현이 감소한 것으로 나타났습니다. Id2 녹다운 iHSPC에서 Id2 발현에 대해 도유사한 결과가 관찰되었다.

5일 동안 LacZ 녹다운 iHSPC를 배양한 후, 수지상 세포 집단을 나타내는 CD11c 양성 세포의 주파수는 약 95%였으며, Tcf4 또는 Id2를 쓰러뜨리면 CD11c 양성 수지상 세포의 생성이 약간 감소하였다. LacZ 녹다운 iHSPC에서 파생된 CD11c 양성 수지상 세포의 추가 분석에 따르면 70%는 종래의 수지상 세포였으며 22%는 플라즈마세포 이드 수지상 세포였습니다. Tcf4 녹다운 iHSPC는 LacZ 가래가 제어하는 플라즈마 세포 분해 수지상 세포의 상당히 낮은 비율을 생성했습니다.

대조적으로, Id2 녹다운 iHSPC는 LacZ 녹다운 대조군보다는 기존의 수지상 세포의 상당히 낮은 비율을 생성하지만 플라즈마 세포 이드로이드 수지상 세포의 높은 비율을 생성하였다. 스핀 감염은 렌즈바이러스 운반 shRNA의 변환 효율을 iHSPC로 증가시다. 이 기술은 전사 요인의 역할을 해결하고 DC 개발에 관여 할 가능성이 있는 사이토카인 신호 변환 또는 신진 대사에 있는 그밖 유전자의 연구를 용이하게 합니다.