Name: 인간 종양 세포 및 종양-xenografted 마우스에 있는 매크로 피노세포증에 의해 중재된 ATP 내재화를 위한 형광 현미경 검사법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 배우세요 형광 현미경을 이용하여 인간 종양 세포와 종양-xenografted 마우스에서 매크로 피노세포증에 의해 중재되는 ATP 내재화를 시각화하는 방법을. 이 기법은 암 세포의 대사 과정 연구에 필수적입니다.

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저온절균은 오하이오 대학 조직 병리학 코어에서 현장에서 수행되었습니다. 이 작품은 C 닐슨에 창업 기금 (오하이오 대학 예술 과학 대학)에 의해 부분적으로 지원되었다; NIH는 R15 CA242177-01 및 RSAC 상을 X Chen에 부여합니다.

<ol><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+hallmarks+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The emerging hallmarks of cancer metabolism.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).</li>
<li>Pellegatti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+level+of+extracellular+ATP+at+tumor+sites%3A+in+vivo+imaging+with+plasma+membrane+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase.</a> PLoS ONE. 3, 25992008(2008).</li>
<li>Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+adenosine+triphosphate+in+the+pericellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120101(2013).</li>
<li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-dependent+anticancer+immune+responses+induced+by+chemotherapeutic+agents+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice.</a> Science. 334, 1573-1577 (2011).</li>
<li>Wilhelm, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease+is+enhanced+by+extracellular+ATP+activating+P2X7R%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R.</a> Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Warburg+effect%3A+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Science. 324, 1029-1033 (2009).</li>
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<li>Chen, X., Qian, Y., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Warburg+effect%3A+evolving+interpretations+of+an+established+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept.</a> Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).</li>
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<li>Patel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+as+a+biological+hydrotrope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ATP as a biological hydrotrope.</a> Science. 356, 753-756 (2017).</li>
<li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+is+internalized+by+macropinocytosis+and+induces+intracellular+ATP+increase+and+drug+resistance+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells.</a> Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).</li>
<li>Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+a+new+player+in+cancer+metabolism%3A+NSCLC+cells+internalize+ATP+in+vitro+and+in+vivo+using+multiple+endocytic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms.</a> Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).</li>
<li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li>
<li>Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dendritic+cell+antigen+uptake+via+alpha2+adrenoceptor-mediated+PI3K+activation+following+brief+exposure+to+noradrenaline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline.</a> Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).</li>
<li>Hoppe, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+quinolines+and+artemisinin+inhibit+endocytosis+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+%26+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).</li>
<li>Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+ATP+cross+the+cell+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+Journal+of+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Does ATP cross the cell plasma membrane.</a> Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).</li>
<li>Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+utilization+of+extracellular+%5Bgamma-32P%5DATP+for+the+phosphorylation+of+intracellular+proteins+in+the+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).</li>
<li>Chaudry, I. H., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+evidence+for+ATP+uptake+by+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Further evidence for ATP uptake by rat tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).</li>
<li>Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otto+Warburg%27s+contributions+to+current+concepts+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).</li>
<li>Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+metabolism+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Links between metabolism and cancer.</a> Genes & Development. 26, 877-890 (2012).</li>
<li>Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+consumption+promotes+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP consumption promotes cancer metabolism.</a> Cell. 143, 669-671 (2010).</li>
<li>Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+and+insulin+secretion%3A+the+ATP-sensitive+K%2B+channel+%28K+ATP%29+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection.</a> Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).</li>
<li>Szendroedi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+mitochondrial+ATP+synthesis+and+glucose+transport%2Fphosphorylation+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes.</a> PLoS Medicine. 4, 154(2007).</li>
<li>Miyamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+reveals+elevated+glomerular+ATP%2FAMP+in+diabetes%2Fobesity+and+identifies+sphingomyelin+as+a+possible+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator.</a> EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

비수성 ATP의 세포 내산화의 공간적, 시간적 및 정량적 분석을 위해 개발되었다. 이 방법은 기술 교육 및 대표 데이터를 제공하는 다양한 종양 유발 모델을 포함한 다양한 생물학적 시스템에서 사용하기 에 광범위하게 적용됩니다. 생체 내 ATP 내재화 연구(프로토콜의 섹션 4)에서 해석 가능한 데이터를 획득하려면 종양 내 주사에서 극저온-포함으로 경과된 실험 시간을 제한하는 것이 중요합니다. 조직 슬라이드 후 종양 절개 고정 -형광 현미경 이미징 전에 필요한 단계입니다. 함께, 이 2개의 중요한 단계는 종양 세포가 화상 진찰 과정 도중 내재된 ATP를 유지한다는 것을 확인합니다. ATP 내재화 분석 중 또 다른 중요한 고려 사항은 이종 이식 종양의 이질성을 설명하는 것입니다. 종양 발생이 암세포 유형 중 다르게 진행됨에 따라, 다른 암세포에 대한 이상적인 실험 조건을 결정하기 위해이 방법의 측면을 해결하는 것이 필요할 수 있습니다. 종양에서 ATP의 대식세포증에 대한 포괄적인 평가를 보장하기 위해서는 상주 세포 와 ...

종양 외 세포 (즉) 영양소의 기회적 섭취는 최근 암 대사1의핵심 특징으로 명명되었습니다. 이러한 중요한 영양소 중 하나는 ATP이며, ieATP의 농도는 정상 조직에서 발견되는 것보다 103 및 104 배 더 높으며, 수백 μM에서 낮은 mM2,3,4,5에있다. 주요 에너지 및 신호 분자로서 ATP는 암과 건강한 세포에서 세포 대사에 중심적인 역할을 한다6,7,8. 세포외 ATP는 암세포 성장에 관여할 뿐만 아니라 약물 내성9도촉진한다. 이전에는 수중성 활동과 같은 ATP의 인식되지 않은 기능이 확인되어 알츠하이머10과같은 질병에 ATP가 관여하는 것을 연루시킨다. 실제로, ATP의 우리의 이해와 암세포에 있는 그것의 기능, 건강한 세포 및 그밖 병된 세포는 완전하지 않습니다 보입니다. 그러나, ATP의 불안정성과 세포에 있는 높은 이직률 때문에, 세포막을 통해 그리고 세포로 ATP의 운동을 감시하는 것은 기술적으로 도전적입니다.
이러한 문제점을 해결하고 이 연구 영역의 필요성을 채우기 위해, ATP의 내재화를 시각화하고 생체 내 및 생체내 11,12의 내재된 ATP의 세포 내 공간 국소화를 관찰하기 위해 비수성 형광 ATP(NHF-ATP)(도1)를대리로 사용하는 방법이개발되었다. . NHF-ATP는 암 세포주 및 면역형 마우스11,12에이식된 인간 종양 조직 에서 동물 세포막을 통해 ATP 운동을 조사하기 위해 내인성 ATP를 대체하는 것으로 입증되었다. 더욱이, 세포에 대식세포 억제제를 투여하여 eATP 내산화를 막아, eATP의 세포내 섭취가9,11,12의대식세포메커니즘을포함한다는 것을 시사한다. 이 프로토콜은 세포 특정 단백질에 대한 면역 기반 공동 라벨링을 허용하고 따라서 어떤 세포 유형이 NHF-ATP를 내면화시키는지 식별합니다. 생체 종양 이종이이식 및 고해상도 현미경 검사법을 사용하여 NHF-ATP는 조직 샘플 전반에 걸쳐 심지어 단일 세포 내에서도 공간적으로 시각화될 수 있습니다. 또한 이러한 방법은 세포 섭취 비율, 거시세포 소포 수 및 내재화 운동과 같은 정량적 분석을 허용합니다. 이 논문은 NHF-ATP가 세포 내재화에 따라 ATP의 내재화 및 세포 내 국소화를 연구하기 위해 다양한 실험 환경에서 어떻게 사용하거나 내분비 추적형 형광덱스트랜스(13,14,15,16)와함께 작업하는지 자세히 설명합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62768/62768fig01.jpg"> 그림 1: 비가수성 형광 ATP 및 테트라메틸lrhodamine의 구조는 높은 분자량 형광 dextran을 표시. (A)NHF-ATP의 구조. (B)HMWFD의 회로도 표현. 약어: ATP = 아데노신 트리호스페이트; NHF-ATP = 비가수성 형광 ATP; TMR = 테트라메틸lrhodamine; HMWFD = 고분자 량 형광 드엑스트라른. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62768/62768fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>A549 세포, 인간 폐 상피, 암종</td><td>국립 암 연구소</td><td>n/a</td><td>저렴한 출처</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S25904</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일, 레이놀즈</td><td>그레인저</td><td>6CHG6</td><td></td></tr><tr><td>수성 장착 매체, ProLong Gold 퇴색 방지 시약</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>ATP 아날로그</td><td>Jena Biosciences</td><td>NK-101</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브, 살균기</td><td>Grainger</td><td>33ZZ40</td><td></td></tr><tr><td>블레이드, 저온 유지 장치, 하이 프로파일</td><td>CL Sturkey, Inc.</td><td></td><td></td>DT554550</tr><tr><td>캘리퍼스, 버니어</td><td>그레인저</td><td>4KU77</td><td></td></tr><tr><td>세포 배지, Ham's Nutrient Mixture F12, 무혈청</td><td>Millipore Sigma</td><td>51651C-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기, 스윙 버킷 로터</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423555000</td><td></td></tr><tr><td>Conical tube, 15 mL</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 50 mL</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립, 유리, 12 mm</td><td>Corning</td><td>2975-245</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat, Leica CM1950</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 작업 와이프, Kim Wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, 라이신 고정성, 고분자량(HMW)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>MW = 70,000, Tetramethylrhodamine</td></tr><tr><td>Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW)</td><td>Invitrogen</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 무혈청</td><td>Fisher Scientific</td><td>11885076</td><td></td></tr><tr><td>Dry ice</td><td>현지 배송</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent imaging system, Nikon NiU 및 Nikon NIS Elements 수집 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>집게, Dumont #7, 곡선</td>형 <td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>집게, Dumont #5, 직선</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>장갑 (소형, 중형, 대형)</td><td>Microflex</td><td>N191, N192, N193</td><td></td></tr><tr><td>장갑, MAPA Temp-Ice 700 보온(드라이아이스 처리용)</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-046-563</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Daigger</td><td>EF16034F EA</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터, 세포 배양</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 S</td><td></td></tr><tr><td>라벨링 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>마킹 펜, Sharpie(초미세)</td><td>스테이플</td><td></td><td></td>642736</tr><tr><td>Mice, immunodeficient (Nu/J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2019</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge, accuSpin Micro17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>microscope slide box</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-751-4983</td><td></td></tr><tr><td>Needle, 27 gauge</td><td>Becton-Dickinson</td><td>752 0071</td><td></td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td>Grainger</td><td>39AL12</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>스테이플</td><td>33550</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>아크로스 유기물</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>천공 스푼, 직경 15mm, 길이 135mm</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-6162</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (10 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-438</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (200 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (1000 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-403</td><td></td></tr><tr><td>피펫, 혈청학적(10mL)</td><td>VWR</td><td>89130-910</td><td></td></tr><tr><td>피펫터, Gilson P2</td><td>Daigger</td><td>EF9930A</td><td></td></tr><tr><td>피펫터 스타터 키트, Gilson(2-10 &mu; L, 20-200 &mu; L, 200-1000 &뮤; L)</td><td>Daigger</td><td>EF9931A</td><td></td></tr><tr><td>Platform shaker - 오비탈, 벤치탑</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-51710-23</td><td></td></tr><tr><td>양전하 현미경 슬라이드, Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>메스, 크기 10, Surgical Design, Inc.</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-707</td><td></td></tr><tr><td>가위, 외과용 - 날카롭고 구부러진</td><td>Fine Science Tools</td><td>14005-12</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석용 소프트웨어, Nikon Elements</td><td>Nikon</td> 이미지 분석용 <td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어, ImageJ (FIJI)</td><td>National Institutes of Health</td><td>n/a</td><td>온라인 다운로드(무료)</td></tr><tr><td>검체 디스크 30mm(척 홀더), 저온 유지 장치 액세서리</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740044</td><td></td></tr><tr><td>염색 트레이, 245 mm BioAssay Dish</td><td>Corning</td><td>431111</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 1 cc</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Tape, 실험실, 19 mm 너비</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5R</td><td></td></tr><tr><td>타이머</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시, 직경 100 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크, 225 cm2</td><td>ThermoFisher</td><td>159933</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트, 24-웰</td><td>Becton-Dickinson</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>조직 매립 금형, 스테인리스강</td><td>Tissue Tek</td><td>4161</td><td></td></tr><tr><td>조직 동결 매체, 최적 절단 온도(OCT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산), 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>수조, 정밀 GP</td><td>2S ThermoFisher</td><td>TSGP2S</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 종양 세포 및 종양-xenografted 마우스에 있는 매크로 피노세포증에 의해 중재된 atp 내재화를 위한 형광 현미경 검사법

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

세포외 ATP(eATP)를 포함한 아데노신 트리호스페이트(ATP)는 약물 내성, 상피-중간엽 전이(EMT) 및 전이와 같은 종양 발생의 다양한 양상에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 종양 내 eATP는 정상 조직보다 농도가 103 ~ 104 배 높다. eATP는 EMT 유도를 위한 순수성 신호 전달을 활성화하기 위한 메신저로서 기능하지만, 또한 특정 유형의 내분세포증인 고세포증을 통해 암세포에 의해 내면화되어 다양한 생물학적 기능을 수행한다. 이러한 기능에는 ATP가 요구하는 생화학 반응에 에너지를 제공하고, 신호 변환 중에 인산염 그룹을 기증하고, 전사 보조 인자로서 유전자 발현을 촉진하거나 가속화하는 것이 포함됩니다. ATP는 쉽게 사용할 수 있으며 암 및 기타 분야에서의 연구는 의심 할 여지없이 증가 할 것입니다. 그러나 eATP 연구는 초기 단계에 남아 있으며 eATP와 내부화된 세포내 ATP가 연주하는 중요하고 다재다능한 활동이 완전히 해명되기 전에 해결되지 않은 질문은 여전히 답이 없습니다.
이러한 초기 eATP 연구에 대한 이러한 저자의 실험실의 기여는 비 가수분해성 형광 ATP의 현미경 이미징을 포함하며, 고분자 및 저분자 형광 덱스트랜스와 결합하여 거시피노세포증 및 내세포 증산 억제제뿐만 아니라 다양한 내세포증 억제제역할을 하며, 내부화를 감시하고 특성화합니다. 이러한 이미징 양식은 종양 세포주 및 면역형 마우스에 적용되었으며, 인간 암 종양과 이식된 이노노이식, 체외 및 생체 내eATP 내재화를 연구하였다. 이 백서는 이러한 체외 및 생체 내 프로토콜을 설명하며, 매크로피노시토시스/내세포 매개 eATP 내분비분석 분석이 다른 시스템에서 성공적으로 수행될 수 있도록 분석 조건을 수정및 미세 조정하는 데 중점을 두고 있습니다.

시험관 내 연구 NHF-ATP의 세포 내산화는 HMWFD 또는 LMWFD(그림4)를가진 NHF-ATP의 공동 국소화에 의해 입증되었다. 이 절차의 성공은 주로 NHF-ATP 및 덱스트랜스의 적절한 농도의 사용과 덱스트랜스(폴리 리신 대 중립)의 적절한 유형(들)을 결정하는 데 의존합니다. 예를 들어, 매크로피노시토시스를 조사하기 위해 HMWFD는 매크로피노솜(13,14,15,16)에의해서만 내면화됨에 따라 선택되었다. 대안적으로, 클래트린 및/또는 카폴라 매개 내분비토가 연구되는 경우, LMWFD는 이러한 내세포증 관련 내분모의 작은 크기만 LMWFD<sup clas...

우리는 높은 세포 분해능을 가진 ATP 대리인 비수성 아데노신 삼위산염(ATP)의 내재화를 시각화하는 재현 가능한 방법을 개발했습니다. 우리는 독립적인 체외 및 생체 내 분석-인간 종양 세포주 및 면역결핍 마우스 를 사용하여 인간 종양 조직과 이식된 우리의 방법을 검증했습니다.

인간 종양 세포 및 종양-xenografted 마우스에 있는 매크로 피노세포증에 의해 중재된 ATP 내재화를 위한 형광 현미경 검사법

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

암세포는 세포 외 환경에서 ATP와 같은 영양소를 내면화하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 우리의 프로토콜은 ATP 내산화를 입증하고 세포 내에서 ATP 지역화를 시각화 할 수 있습니다. 거형화 내의 내부ATP의 고해상도 이미징은 특수 현지화를 이해하고 내재화 분석 수량을 완료하는 데 이상적입니다.이 프로토콜은 ATP 내재화를 연구하기 위한 다양한 실험 응용 프로그램을 설명합니다. 이 방법은 거형 세포 세포증 및 엑소좀 매개 내분법을 포함하여 세포 내재화의 다른 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 대사 질환의 경우 비암 세포에서 ATP 내산화를 이 프로토콜로 연구할 수 있습니다.시작하려면, FBS와 항생제로 보충 DMEM을 포함하는 225 평방 센티미터 플라스크에 암세포를 종자. 세포배양배양에서 세포가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 성장할 수 있도록 합니다. 일단 80%의 합류가 달성되면, 세포와 펠릿을 원심분리에 의한 분리세포를 분리하고, PBS의 100마이크로리터당 6세포의 5배 10~6세포의 세포 밀도를 달성하기 위해 얼음감기 PBS에서 세포를 재연한다.세포 현탁액을 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 면역 결핍 마우스의 측면에 주입 부위를 청소, 75%에탄올, 섬세한 작업 닦아와 여분의 에탄올을 닦아. 27 게이지 정밀 글라이드 바늘이 장착된 1밀리리터 라텍스 프리 주사기로 셀을 그립니다.피하 주사의 경우 바늘을 피부에 약 10도 각도로 잡고 피부 아래를 향한 벨이 있는 바늘 끝을 삽입하여 피부 바깥쪽에 바늘을 1~2밀리미터만 유지합니다. 주사기에서 세포를 약 10초 이상 천천히 분배합니다. 전체 부피를 주입 한 후 바늘을 3 ~ 5 초 동안 제자리에 고정한 다음 바늘을 철회하십시오.주입된 내용물의 누출을 방지하기 위해 손가락으로 3~5초 동안 사출 부위에 부드럽지만 단단한 압력을 가하십시오. 종양이 200 ~500 입방 밀리미터의 부피에 도달할 때까지 Vernier 캘리퍼를 사용하여 종양 성장을 모니터링하고 측정합니다. 밀리리터 고분자 중량 형광 덱텐과 세럼이 없는 DMEM당 16밀리그램의 마이크로리터 300마이크로리터를 녹이고, 30분 동안 섭씨 37도에서 강화된 수조에서 배양한 다음, dextran 용액을 원심분리하고 초퍼를 새로운 1.5밀리리터 미세산경선으로 옮기다.40 마이크로리터에서 1밀리미터 비 가수 분해성 형광 ATP 아날로그 스톡을 160 마이크로리터의 혈청 이없는 DMEM에 공급하여 0.2 밀리머라 비가수분해성 형광 ATP 솔루션을 만듭니다. DMEM의 고분자 또는 저분자량 형광 dextran당 8밀리그램의 치료 솔루션을 DMEM의 100 마이크로몰러 비하이드로졸 형광 ATP의 유무에 관계없이 이전에 제조된 스톡 솔루션을 혼합하여 준비합니다. 1 밀리리터 주사기를 사용하여 하나의 치료 용액 50 마이크로리터를 수집합니다.xenograft 종양에 직접 용액을 주입하고 각 치료의 4 개의 생물학적 복제를 반복하십시오. 마우스를 안락사시키고 종양 조직을 격리한 후 천공 된 숟가락을 사용하여 절제된 종양 조직을 떠서 즉시 조직을 동결 배지에 넣고 조직을 굴려 조직이 중간 목욕에 잠긴 채로 유지되도록합니다. 조심스럽게 동결 매체를 포함하는 포함 형질에 조직을 배치합니다.해당 레이블 태그를 고정 매체 또는 몰드에 수직으로 배치하여 작성된 레이블이 매체 외부에 표시되도록 합니다. 동결 배지가 불투명하게 변하면, 금형에서 조직 블록을 제거하고, 조직 블록을 드라이 아이스에 배치하고 각 종양 섹션에 대해 동결을 반복한다. 극저온 절제 절차 전에 몇 달 동안 영하 80도의 티슈 블록을 저장합니다.조직 블록의 슬라이드를 만든 후, 5 분 동안 영하 18도에서 95 %에탄올로 티슈 섹션 슬라이드를 수정합니다. 고정 된 섹션을 PBS로 5 분 동안 씻으시면됩니다. 단면의 크기에 따라 DAPI를 사용하여 수성 마운팅 배지의 10~50마이크로리터를 조직 섹션에 추가하고, 티슈 섹션 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다.12~24시간 마운팅 후, 고정 종양 섹션의 관심 영역을 식별하고 이전에 설명한 바와 같이 형광 현미경검사를 사용하여 이미지를 습득한다. 인간 종양 세포 고정 및 DAPI와 함께 서 2~ 24 시간 후에, 에피소드 형광 화상 진찰 시스템 및 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 심상을 캡처합니다. 쌍안경 모드에서 직립 상피 현미경의 무대에 슬라이드를 배치합니다.이미징 프로그램을 열고 10배 의 목표를 선택하고 스테이지를 조정하여 초점을 정의합니다. 슬라이드를 좌측에서 오른쪽으로 스캔하여 관심 영역을 식별합니다. 40배 의 목표를 선택하고 현미경의 토글을 사용하여 쌍안경에서 이미지 캡처 모드로 전환합니다.라이브 품질 아이콘을 클릭하여 이미지를 보고 나중에 수집합니다. 획득 도구 모음의 OC 패널을 사용하여 각 필터 큐브 또는 형광 채널에 대한 노출 매개 변수를 정의한 다음 멀티 채널 수집 툴바를 사용하여 정의된 노출 설정으로 세 채널 이미지를 획득합니다. 또는 필터 큐브 사이를 전환하고, 노출 시간을 설정하고, 각 채널의 이미지 수집 사이의 셔터를 닫거나 열고, 개별 채널에 대해 촬영한 각 이미지를 오버레이하여 다중 채널 이미지를 수동으로 획득할 수 있습니다.이미지를 nd2 파일로 저장합니다. 병합된 채널 이미지와 개별 채널 이미지를 포함하여 TIF 파일을 저장합니다. 주석 및 측정 툴바의 개체 수 기능을 사용하여 저장된 nd2 이미지 파일에 NHF-ATP, TMR 고분자중량 형광 드엑스트라및 TMR 저분자량 형광 드엑스트라 포지티브 셀의 수를 계산하고 분석 프로그램을 통해 스프레드시트로 데이터를 내보냅니다.이 프로토콜은 비수성 ATP의 세포 내산화의 공간, 시간적 및 정량적 분석을 위해 개발되었다. 비수성 형광 ATP의 세포 내산화는 체외, 전 생체 및 생체 내에서 높은 또는 저분자 량 형광 dextran을 가진 비가수분해성 형광 ATP의 공동국화에 의해 입증되었다. 종양 세포가 내재화된 ATP를 유지하도록 하기 위해 모든 종양 내 주입을 위한 제한된 실험 시간이 극저온-임베딩에 있습니다.또한 종양 전체에 걸쳐 이미징 조직에 의한 종양 내 변이를 설명합니다. 향후 방법의 반복에는 E-ATP 내재화 프로세스의 실시간 시각화가 포함될 수 있으며, 특정 조직에서 거시노세포 역학 및 인신 매매에 대한 정보를 공개할 수 있습니다.

fluorescence-microscopy-for-atp-internalization-mediated

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 마우스 모델에서 형광 단백질이 태그된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 형광 분자 단층 촬영 또는 FMT에 대해 설명합니다. 이 기술은 분자 수준에서 항종양 치료제의 효과를 밝히는 데 유용합니다.

형광 분자 단층 촬영: 마우스 모델에서 형광 단백질 태그가 지정된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 이미징 기술

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

여기에서는 암 전이에서 폐포 대식세포의 기능을 연구하기 위한 모델과 접근 방식을 설명합니다. 전이에서 이러한 세포의 역할을 입증하기 위해 클로드로네이트 리포좀을 사용한 폐포 대식세포의 고갈과 함께 유방암의 syngeneic(4T1) 모델을 사용했습니다.

유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

종양 세포의 Orthotopic intracranial 주사 공부 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답을 암 연구에 사용 되었습니다. 여기 선물이 형광 분자의 단층 촬영 종양 xenografts 실시간 intravital 이미징 및 종양의 정량화 임상 세포종 모델에서 대량 제공.

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

멀티웰 마이크로플레이트를 사용하는 자동화된 해석은 단일 실험에서 다양한 조건의 평가를 허용함으로써 경로 조절기관을 식별하는 데 유리한 접근 방식입니다. 여기에서는 잘 확립된 매크로피노솜 이미징 및 정량화 프로토콜을 96웰 마이크로플레이트 형식으로 조정했으며 멀티 모드 플레이트 판독기를 사용하여 자동화를 위한 포괄적인 개요를 제공합니다.

형광 표기 매크로피노좀의 정량화를 위한 자동화된 이미징 및 분석

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

배우세요 형광 현미경을 이용하여 인간 종양 세포와 종양-xenografted 마우스에서 매크로 피노세포증에 의해 중재되는 ATP 내재화를 시각화하는 방법을. 이 기법은 암 세포의 대사 과정 연구에 필수적입니다.

인간 종양 세포 및 종양-xenografted 마우스에 있는 매크로 피노세포증에 의해 중재된 ATP 내재화를 위한 형광 현미경 검사법

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