Name: 마우스에서 가벼운 혐오감을 이용한 편두통과 같은 행동 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: 학습하세요 마우스에서 가벼운 혐오감을 측정하는 행동 분석 방법을 통해 편두통의 광공포증을 연구하세요. 자동 감지 기술로 불안과 구분하여 전임상 모델에서 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작업은 NIH NS R01 NS075599 및 RF1 NS113839의 보조금으로 지원되었습니다. 내용은 VA 또는 미국 정부의 견해를 대표하지 않습니다.

동물 절차는 아이오와 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 정한 표준을 준수하여 수행되었습니다.
1. 빛/어두운 분석
<ol><li>빛/어두운 챔버 장치( 재료 표 참조) 설정. 이 섹션의 모든 장비는 상업적으로 이용 가능합니다.<ol>
<li>선반에 챔버와 어두운 인서트에 쉽게 접근할 수 있도록 풀아웃 서랍이 들어있는 소음 감쇠 칸막이(내부: W x H x D에서 59.7 x 38 x 35.6cm)를 놓습니다.</li>
		<li>DC 전원 공급 장치와 DC 레귤레이트 전원 공급 장치를 방음 큐비클에 연결합니다.</li>
		<li>투명한 이음새가 없는 오픈 필드 챔버(27.31 x 27.31 x 20.32 cm in L x W x H)를 큐비클의 풀아웃 서랍에 놓습니다.</li>
		<li>검정색, 적외선(IR) 투명 플라스틱 다크 인서트(28.7 X 15 X 20.6 cm in L x Wx H)를 오픈 필드 챔버에 놓습니다. 챔버가 같은 크기의 두 구역, 즉 어두운 영역과 밝은 영역으로 나뉘어져 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>오픈 필드 챔버의 X, Y 및 Z 축에 있는 세 세트의 16빔 IR 어레이를 케이블을 통해 IR USB 컨트롤러에 연결합니다.</li>
		<li>IR USB 컨트롤러를 컴퓨터에 연결합니다.</li>
		<li>마우스 위치 및 활동을 기록하고 수집 할 수있는 추적 소프트웨어를 컴퓨터에 설치하십시오.</li>
		<li>조명 패널 설정을 위해 먼저 발광 다이오드(LED) 조명 패널(27.70 x 27.70cm(L x W, LED 360개, 일광 밸런스 컬러, 5600K, 60° 플러드 빔 확산)을 원래 하우징에서 분리합니다.</li>
		<li>조명 패널을 LED 드라이버, 방열판 및 전원 공급 장치로 조립합니다. 여러 개의 LED 조명 패널을 하나의 전원 공급 장치, 방열판 및 LED 드라이버에 연결하여 균일 한 조명 패널 제어를 달성 할 수 있습니다.</li>
		<li>0.53cm 간격으로 7개의 동일한 선반으로 구성된 맞춤형 아크릴 플랫폼(L x W x H에서 29.77 x 27.70 x 8.10cm)을 구성합니다(그림 1B). 맞춤형 아크릴 선반을 챔버 위의 칸막이 내부의 천장에 영구적으로 부착하십시오.</li>
		<li>LED 조명 패널을 하단 두 선반 사이의 슬롯에 삽입합니다. 필요한 경우 조명 패널을 다른 높이로 조정하십시오 (그림 1B, C), (예 : 광유전학 마우스를 사용하는 경우). 자세한 내용은 섹션 3)에서 설명합니다.</li>
		<li>방열판, LED 드라이버 및 전원 공급 장치를 켭니다. LED 드라이버가 챔버 바닥의 광도를 측정하여 LED 광도를 지시할 수 있는지 확인하고 바닥이 고르게 켜져 있는지 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>행동 테스트 절차 참고 : 마우스는 12 시간 빛주기에 보관됩니다. 모든 행동 실험은 광주기 동안 수행된다. 10-20 주 된 남성과 여성 모두를 포함한 마우스가 사용됩니다. 이 프로토콜에서, 순진한 야생형 CD1 및 C57BL/6J 마우스는 빛/어두운 챔버에 두 번의 사전 노출을 경험한 후 치료 및 치료 후 노출을 경험한다. 마우스가 회복할 수 있도록 각 노출 사이에는 3일 간격이 있다(제1일, 제4일, 제7일 및 제10일은 하기 및 도 1A에 기재된 바와 같다). 그러나, CD1 마우스는 2차 사전 노출을 필요로 하지 않으며, 희미한 빛에서 시험될 수 있다.<ol>
<li>1일째(전처리 1)에 밝/어두운 분석 장치를 켜고 광도를 27,000lux로 설정합니다.</li>
		<li>추적 소프트웨어를 열고 새 프로토콜을 설정합니다. 새 프로토콜 설정에서 지속 시간을 30분으로 설정합니다. 새 분석 설정에서 기간별 데이터 저장소 를 300초로 설정합니다.</li>
		<li>새 영역 설정에서 미리 정의된 영역을 선택합니다. 2를 선택한 다음 수평을 선택합니다. 챔버가 녹화를 위해 수평으로 두 개의 동일한 크기의 영역으로 나뉘어져 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>시험 전에 1 시간 동안 시험실에 생쥐를 습관화하십시오. 습관화하는 동안 마우스의 일주기 리듬을 방해하지 않도록 방을 밝게 유지하십시오. 빛/어두운 분석을위한 모든 장비가 켜져 있는지 확인하여 마우스가 시험실 환경에 완전히 적응할 수 있도록하십시오.</li>
		<li>데이터 수집을 선택합니다. 마우스 ID를 입력합니다. 프로토콜을 시작합니다.</li>
		<li>서랍을 소음 감쇠 칸막이 바깥쪽으로 당겨 밝은/어두운 챔버와 어두운 인서트에 접근합니다. 꼬리 밑으로 마우스를 부드럽게 집어 들고 챔버의 조명 영역에 놓고 서랍을 칸막이 안쪽으로 밀어 넣으십시오. 소프트웨어가 마우스를 즉시 감지하고 활동을 기록하기 시작하는지 확인하십시오.</li>
		<li>30분 후에 녹화가 자동으로 중지될 때까지 기다립니다. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.</li>
		<li>항미생물 활성 성분으로서 55.0% 이소프로필 알코올, 0.25% 알킬 C12-18 디메틸에틸벤질암모늄 및 0.25% 알킬 C12-18 디메틸벤질암모늄 클로라이드를 함유하는 알콜-냄새 살균 일회용 물티슈를 사용하여 챔버 및 다크 인서트를 청소하여 이전 마우스에 의해 남겨진 후각 신호를 근절한다.</li>
		<li>4일째(전처리 2)에 1.2.1~1.2.8단계를 반복한다.</li>
		<li>7일째(치료일)에 1.2.1 및 1.2.4단계를 반복한다. 습관화 후 CGRP (0.1 mg / kg, 마우스 체중 기준 10 μl / g, 복강 내 주사 (i.p.))를 투여하고 마우스의 머리를 앞으로 기울이고 오른쪽 아래 사분면에 주사하십시오. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.</li>
		<li>30분 후 프로토콜을 시작하고 1.2.5~1.2.7단계에서 설명한 대로 밝은/어두운 챔버에서 마우스를 실행합니다. 주사 후 홈 케이지의 회복 시간은 치료에 따라 단축되거나 길어질 수 있습니다21.</li>
		<li>챔버를 청소하고 단계 1.2.8에 설명된 대로 어두운 삽입물을 삽입하십시오.</li>
		<li>10일째(치료 후 날)에 1.2.1~1.2.8단계를 반복한다. 실험은 개방 필드 분석을 시작하기 전에 단계 1.2.13에서 일시 중지될 수 있다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 개방 필드 분석
<ol><li>장치 설정<ol>
<li>오픈 필드 챔버 설정: 어두운 인서트를 사용하지 않고 밝은/어두운 분석에 사용된 것과 동일한 사운드 감쇠 큐비클 및 오픈 필드 챔버를 사용하십시오.</li>
		<li>라이트 패널 설정: 밝은/어두운 분석에 사용된 것과 동일한 설정을 사용합니다. 광도가 광/암흑 분석에서 사용된 것과 동일한지 확인하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>행동 테스트 절차<ol>
<li>장치를 켭니다. 조명 강도를 27,000럭스로 설정합니다.</li>
		<li>추적 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>새 영역 설정을 제외하고 밝/어두운 분석에서 사용되는 것과 동일한 새 프로토콜을 설정합니다. 새 영역 설정에서 1을 선택한 다음 중심을 선택합니다. 둘레를 둘레에서 3.97cm, 중심을 19.05cm에서 19.05cm로 설정×십시오.</li>
		<li>단계 1.2.4에 기재된 바와 같이 마우스를 시험실에 습관화시킨다.</li>
		<li>CGRP (0.1 mg / kg, 마우스 체중 기준 10 μl / g, i.p.)를 투여하고 마우스의 머리를 앞으로 기울이고 오른쪽 아래 사분면에 주사하십시오. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.</li>
		<li>30분 후 프로토콜을 시작합니다. 풀아웃 서랍을 사운드 감쇠 칸막이 바깥쪽으로 당기고 마우스를 열린 필드 챔버 중앙에 부드럽게 놓습니다. 서랍을 칸막이 안쪽으로 밀어 넣습니다.</li>
		<li>30 분 동안 행동을 추적하십시오. 그런 다음 생쥐를 집 새장으로 돌려 보내십시오.</li>
		<li>단계 1.2.8에 설명된 대로 장치를 청소합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 광유전학 마우스에 대한 변형된 광/어두운 분석
<ol><li>장치 설정<ol>
<li>어두운 삽입물을 두 번 수정합니다.<ol>
<li>어두운 삽입물의 위쪽과 구멍 사이에 0.95 x 10.16cm(W X H)의 작은 슬릿으로 어두운 삽입물의 개구부를 5.08 x 5.08cm(W x H)로 수정합니다(그림 1D 왼쪽 상단). 참고: 이 수정을 통해 마우스 헤드의 광섬유 캐뉼라가 패치 코드에 부착될 때 마우스가 어려움 없이 어두운 영역으로 이동할 수 있습니다.</li>
			<li>어두운 인서트의 위쪽을 삼각형 현관(H=6.5cm)으로 밝은 영역 위로 뻗습니다(그림 1D 오른쪽 상단과 왼쪽 아래). 현관에서 원형 구멍(D=1.7cm)을 잘라내고 홀더를 구멍에 삽입하여 레이저와 광섬유 패치 코드를 연결하는 회전 조인트를 배치하고 안정화합니다(그림 1D 왼쪽 상단과 왼쪽 하단). 참고: 수정을 통해 어두운 영역의 바닥에 도달하는 광도의 작은 변화가 발생합니다(수정 시 17럭스 대 수정 없이 14럭스, 27,000럭스 미만의 어두운 영역의 오른쪽 뒤쪽 모서리에서 측정됨).</li>
		</ol>
</li>
		<li>회전 조인트를 어두운 인서트의 홀더에 삽입합니다.</li>
		<li>30.5cm 광섬유 패치 코드를 회전 조인트에 연결합니다. 마우스가 챔버를 통과할 때 패치 코드가 어려움 없이 회전할 수 있도록 회전 조인트가 부드럽게 회전할 수 있는지 확인합니다.</li>
		<li>나머지 설정의 경우 섹션 1(밝은/어두운 분석)에 사용된 것과 동일한 장치 설정을 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>행동 테스트 절차 참고: 야생형 마우스와는 달리, 광유전학적 마우스는 사전 노출(전처리 1 및 2)을 받지 않는다.<ol>
<li>시험 당일, LED 조명 패널을 두 번째로 낮은 슬롯(캠버 바닥에서 28.23cm)에 삽입하여 패치 코드를 연결할 수 있는 공간을 확보하십시오. 밝은/어두운 분석 장치를 켜고 조명 강도를 55lux로 설정합니다.</li>
		<li>3.2.3단계에서 레이저 자극 프로토콜과 일치하도록 새 분석 설정에서 지속 시간별 데이터 빈도가 60초로 설정된다는 점을 제외하면 1.2.2 및 1.2.3에서와 동일한 프로토콜 설정을 사용합니다.</li>
		<li>레이저 전원 단추를 켭니다. 레이저 펄스 컨트롤러를 1 분 동안 자극 한 다음 30 분 동안 자극없이 1 분 동안 자극하도록 설정하십시오.</li>
		<li>시험 전에 1 시간 동안 빛을 켜고 시험장에 마우스를 습관화하십시오.</li>
		<li>프로토콜을 시작합니다. 사운드 감쇠 칸막이 바깥쪽으로 풀아웃 서랍을 당겨 밝은/어두운 챔버와 어두운 인서트에 접근합니다.</li>
		<li>마우스를 부드럽게 억제하고 짝짓기 슬리브를 통해 마우스 헤드의 광섬유 캐뉼라를 광섬유 패치 코드에 결합합니다(그림 1D 오른쪽 아래). 마우스를 조명 영역에 부드럽게 놓고 서랍을 칸막이 안쪽으로 밀어 넣으십시오. 프로토콜이 마우스 동작을 자동으로 기록하기 시작하는지 확인합니다.</li>
		<li>1분에 펄스 컨트롤러를 켠 다음 페일세이프 키를 ON으로 켭니다. 표적 뇌 영역의 레이저 자극이 격분마다 발생하는지 확인하십시오.</li>
		<li>프로토콜이 자동으로 중지되면 30분 후 failsafe 키를 OFF로 돌립니다. 그런 다음 펄스 컨트롤러를 끕니다.</li>
		<li>마우스와 광섬유 패치 코드를 분리합니다. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.</li>
		<li>챔버를 청소하고 단계 1.2.8에 설명된 대로 어두운 삽입물을 삽입하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 광유전학 마우스에 대한 변형된 개방장 분석
<ol><li>장치 설정<ol>
<li>스탠드와 클램프를 사용하여 챔버 위의 회전 조인트를 안정화합니다(그림 1E).</li>
		<li>길이가 50cm인 광섬유 패치 코드를 회전 조인트에 연결합니다. 회전 조인트가 부드럽게 회전할 수 있는지 확인합니다.</li>
		<li>회전 조인트를 스탠드의 적절한 높이로 설정하십시오 : 광섬유 패치 코드가 챔버의 모든 구석에만 도달 할 수 있는지 확인하여 마우스 움직임에 대한 간섭을 피하십시오.</li>
		<li>나머지 설정의 경우 섹션 1(밝은/어두운 분석)에 사용된 것과 동일한 장치 설정을 사용하되 어두운 삽입은 사용하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>행동 테스트 절차<ol>
<li>밝은/어두운 분석 장치를 켜고 조명 강도를 55lux로 설정합니다.</li>
		<li>새 영역 설정을 제외하고 수정된 광/어킴 분석(섹션 3)에서와 동일한 프로토콜 설정을 사용합니다. 새 영역 설정에서 중심에서 다음 1을 선택합니다. 둘레를 둘레에서 3.97cm, 중심을 19.05cm에서 19.05cm로 설정×십시오.</li>
		<li>레이저 전원 단추를 켭니다. 레이저 펄스 컨트롤러를 설정하여 1 분 동안 자극 한 다음 30 분 동안 자극없이 1 분 동안 자극하십시오.</li>
		<li>단계 3.2.6에 대한 두 가지 변경을 제외하고 단계 3.2.4 내지 3.2.10에 설명된 바와 같이 습관화 및 나머지 시험을 수행한다: 마우스를 조명 영역 대신 챔버의 중앙에 부드럽게 놓는 단계; 마우스의 머리에 연결되는 패치 코드 때문에 풀아웃 서랍을 칸막이 바깥쪽에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Loder, S., Sheikh, H. U., Loder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence%2C+burden%2C+and+treatment+of+severe%2C+frequent%2C+and+migraine+headaches+in+US+minority+populations%3A+statistics+from+National+Survey+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Headache%22%5BJournal%5D)">The prevalence, burden, and treatment of severe, frequent, and migraine headaches in US minority populations: statistics from National Survey studies.</a> Headache. 55 (2), 214-228 (2015).</li>
<li>Collaborators, G. B. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+burden+of+migraine+and+tension-type+headache%2C+1990-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national burden of migraine and tension-type headache, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> Lancet Neurology. 17 (11), 954-976 (2018).</li>
<li>GBD 2017 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+incidence%2C+prevalence%2C+and+years+lived+with+disability+for+354+diseases+and+injuries+for+195+countries+and+territories%2C+1990-2017%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).</li>
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<li>Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CGRP+as+the+target+of+new+migraine+therapies+-+successful+translation+from+bench+to+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338-350 (2018).</li>
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<li>Ramachandran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Toll-like+receptor+4+signaling+in+mast+cell-mediated+migraine+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Role of Toll-like receptor 4 signaling in mast cell-mediated migraine pain pathway.</a> Molecular Pain. 15, 1744806919867842(2019).</li>
<li>Marek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Melanopsin+and+Trigeminal+Neural+Pathways+in+Blue+Light+Photosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Implication of Melanopsin and Trigeminal Neural Pathways in Blue Light Photosensitivity in vivo.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 497(2019).</li>
<li>Christensen, S. L. T., Petersen, S., Sorensen, D. B., Olesena, J., Jansen-Olesen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+low+dose+glyceryl+trinitrate+has+no+consistent+effect+on+burrowing+behavior%2C+running+wheel+activity+and+light+sensitivity+in+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Infusion of low dose glyceryl trinitrate has no consistent effect on burrowing behavior, running wheel activity and light sensitivity in female rats.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 80, 43-50 (2016).</li>
<li>De Vera Mudry, M. C., Kronenberg, S., Komatsu, S., Aguirre, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+by+the+light%3A+retinal+phototoxicity+in+the+context+of+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Blinded by the light: retinal phototoxicity in the context of safety studies.</a> Toxicologic Pathology. 41 (6), 813-825 (2013).</li>
<li>White, D. A., Fritz, J. J., Hauswirth, W. W., Kaushal, S., Lewin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+to+light-induced+damage+in+a+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity to light-induced damage in a mouse model of autosomal dominant retinal disease.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (5), 1942-1951 (2007).</li>
<li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pre-conditioning+by+CD59a+knockout+protects+against+light-induced+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Retinal pre-conditioning by CD59a knockout protects against light-induced photoreceptor degeneration.</a> PloS One. 11 (11), 0166348(2016).</li>
<li>Matynia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+aversion+and+corneal+mechanical+sensitivity+are+altered+by+intrinscally+photosensitive+retinal+ganglion+cells+in+a+mouse+model+of+corneal+surface+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Light aversion and corneal mechanical sensitivity are altered by intrinscally photosensitive retinal ganglion cells in a mouse model of corneal surface damage.</a> Experimental Eye Research. 137, 57-62 (2015).</li>
</ol>

저자는보고 할 이해 상충이 없습니다.

빛/어둠 분석은 불안과 같은 행동을 평가하기 위해 널리 사용됩니다12. 이 분석은 빛에 대한 생쥐의 타고난 혐오감과 새로운 환경 (조명 영역)에 배치 될 때 탐구하려는 욕구에 의존합니다. 그러나 여기에서보고 한 바와 같이이 분석은 가벼운 혐오스러운 행동을 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다.
테스트 전에 사전 노출의 수와 필요성을 고려하는 것이 중요합니다. 이것은 마우스 변형 또는 모델에 따라 다릅니다. 예를 들어, 우리의 빛/어두운 분석 프로토콜에서, 순진한 야생형 CD1 및 C57BL/6J 마우스는 치료 테스트 절차를 거치기 전에 두 번 빛/어두운 챔버에 사전 노출되는 반면, 광유전학적 마우스는 사전 노출을 겪지 않습니다. 최근의 한 간행물은 CD1 마우스가 i.p. CGRP 투여 후 가벼운 혐오감을 나타내기에 충분하다고 보고했다17. 결과적으로, 참신 파라미터의 중요성은 치료일<sup cl...

편두통은 널리 퍼진 신경 질환으로 미국인의 약 17 %에 영향을 미치며1 전 세계적으로 장애의 두 번째 주요 원인입니다2,3. 환자는 메스꺼움 및 / 또는 구토, 또는 광공포증 및 음파 공포증4 중 적어도 하나의 증상과 함께 4-72 시간 지속되는 두통을 경험합니다. 현재 FDA가 승인한 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 항체 개발의 최근 발전은 편두통 치료의 새로운 시대를 열었습니다5,6,7. 이 항체는 CGRP 또는 그 수용체를 차단하고 편두통 환자의 약 50 %에서 편두통 증상을 예방합니다7. 지난 한 해 동안, CGRP 수용체의 두 개의 소분자 길항제는 편두통의 중단 치료를 위해 FDA 승인을 받았으며 두 개 이상의 파이프 라인에 있습니다8. 이러한 치료 진행에도 불구하고 편두통 발작이 발생하는 메커니즘은 여전히 애매합니다. 예를 들어, CGRP 동작의 사이트는 알려져 있지 않다. 혈액 뇌 장벽을 상당히 넘지 않는 치료 항체의 효능은 CGRP가 수막 및 / 또는 삼차 신경절과 같은 말초 부위에서 작용한다는 것을 암시합니다. 그러나 우리는 혈액 - 뇌 장벽이 부족한 원주 심실 기관에서의 중심 행동을 배제 할 수 없습니다9. 적어도 광공포증의 경우, 우리는 hRAMP1이 신경 조직에서 과발현되는 트랜스제닉 네스틴/hRAMP1 마우스를 사용한 가벼운 혐오감으로 인한 결과를 고려할 때 이것이 덜 가능하다고 생각합니다10. 편두통 병리 생리학의 메커니즘을 이해하는 것은 편두통 치료제의 개발에 새로운 길을 제공 할 것입니다.
전임상 동물 모델은 질병 메커니즘과 신약 개발을 이해하는 데 중요합니다. 그러나 동물의 편두통 평가는 동물이 통증에 대한 감각을 구두로보고 할 수 없기 때문에 어렵습니다. 편두통 환자의 80-90 %가 광공포증11을 나타낸다는 사실을 감안할 때, 가벼운 혐오감은 동물 모델에서 편두통의 지표로 간주됩니다. 이로 인해 마우스의 빛 혐오감을 평가하기위한 분석법을 개발해야했습니다.
밝은/어두운 분석에는 밝은 영역과 어두운 영역이 포함되어 있습니다. 그것은 빛에 대한 타고난 혐오감에 의해 상쇄되는 새로운 환경에 대한 자발적인 탐구를 기반으로 생쥐의 불안을 측정하는 데 널리 사용됩니다12. 일부 연구는 챔버의 1/3을 어두운 영역으로 설정하고 다른 연구는 챔버의 1/2을 어두운 영역으로 설정합니다. 이전 설정은 종종 불안을 감지하는 데 사용됩니다13. 처음에는 동일한 크기의 밝은 / 어두운 챔버를 선택했지만 두 개의 상대 크기를 비교하지는 않았습니다. 우리는 초기 테스트 박스(14 )가 후속 장치15보다 상당히 컸기 때문에 두 챔버의 전체 크기가 주요 요인이 아니라는 것을 언급할 수 있지만, 결과는 본질적으로 동일하였다.
빛 혐오감을 평가하기 위한 이 밝은/어두운 분석의 두 가지 중요한 수정은 테스트 조건과 광도였습니다(그림 1). 첫째, 마우스는 탐사 구동을 줄이기 위해 밝은/어두운 챔버에 사전 노출된다(그림 1A). 사전 노출의 필요성과 시간은 마우스 균주 및 모델에 따라 다릅니다. 야생형 C57BL/6J 마우스는 보통 두 번의 사전 노출이 필요하지만10, CD1 마우스에 대한 사전 노출은 단 한 개만 있으면 충분합니다17. 이러한 방식으로, 광-혐오스러운 거동은 이들 두 마우스 균주에서 마스킹되지 않을 수 있다. 둘째, 챔버 조명은 어두운 흐린 날과 비교할 수있는 희미한 (55 럭스)에서 밝은 (27,000 럭스)까지 조정 가능한 범위의 광도를 포함하도록 조정되었으며, 27,000 럭스는 그늘에서 밝고 화창한 날과 비슷합니다10. 우리는 필요한 빛의 강도가 균주와 유전 모델에 따라 다르다는 것을 발견했습니다. 이러한 이유로 개인은 먼저 실험 패러다임에 대한 최소 광도를 평가해야합니다.
가벼운 혐오스러운 표현형을 나타낼 수있는 분석법에 대한 이러한 수정에도 불구하고, 빛만으로 인한 빛 혐오감과 불안으로 인한 빛의 혐오감을 구별하기 위해 불안과 같은 행동을 테스트 할 필요가 있습니다. 개방형 필드 분석은 새로운 환경의 자발적인 탐구를 기반으로 불안을 측정하는 전통적인 방법입니다. 그것은 탐험 드라이브가 보호되지 않은 열린 공간에 대한 타고난 혐오감에 의해 반대된다는 점에서 빛 / 어둠 분석과 다릅니다. 챔버의 중심과 가장자리는 모두 빛에 있으므로 개방 필드 분석은 빛에 독립적 인 불안 분석입니다. 따라서, 빛/어둠 및 개방장 분석의 조합은 우리가 빛의 회피로 인한 빛의 혐오감과 불안의 전반적인 증가로 인한 빛의 혐오감을 구별할 수 있게 해준다.
CGRP는 혈관 확장, nociception 및 염증을 조절하는 다기능 신경 펩티드입니다18. 그것은 말초 및 중추 신경계에서 널리 발현됩니다. 편두통 병태생리학18에서 중요한 역할을 한다. 그러나 편두통에서 CGRP 작용의 기초가되는 메커니즘은 명확하지 않습니다. 이 변형된 테스트 패러다임과 함께 밝은/어둡고 개방된 필드 분석을 활용함으로써, 우리는 peripheral10,16(그림 2) 및 central14,15,16,19 CGRP 투여 후 마우스에서 광혐오적 거동을 확인할 수 있었습니다. 신경 펩티드 이외에, 가벼운 혐오감에 관여하는 뇌 영역의 확인은 편두통 병리 생리학을 이해하는 데에도 중요합니다. 후부 시상 핵은 통증과 가벼운 처리를위한 통합 뇌 영역이며19, 시상은 편두통 동안 활성화됩니다20. 따라서, 우리는 채널로돕신-2 (ChR2) 또는 eYFP를 함유하는 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 이 영역에 주입함으로써 후부 시상 핵을 표적으로 삼았다. 이 광유전학적 접근법을 이들 두 분석법과 결합함으로써, 우리는 후부 시상 핵에서 ChR2 발현 뉴런의 광학 자극이 광 혐오감을 유도한다는 것을 입증하였다19 (도 3). 이 실험에서, 이들 광유전학적으로 조작된 마우스에서 유발된 광 혐오감에 대한 극적인 효과를 감안할 때, 챔버에 대한 사전 노출은 생략되었다.

<table><tbody><tr><td>활동 모니터</td><td>Med Assoc. Inc</td><td></td><td>소프트웨어 추적 마우스 동작</td></tr><tr><td>맞춤형 아크릴 선반</td><td></td><td></td><td>LED 패널 높이 조정용</td></tr><tr><td>다크 박스 인서트</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>ENV-511</td><td></td></tr><tr><td>DC 전원 공급 장치</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>SG-500T</td><td></td></tr><tr><td>DC 조절 전원 공급 장치</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>SG-506</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 캐뉼라</td><td>Doric</td><td>MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT</td><td></td></tr><tr><td>살균 일회용 물티슈</td><td>Sani-Cloth</td><td>SKU # Q55172</td><td></td></tr><tr><td>히트싱크</td><td>Wakefield</td><td>490-6K</td><td>LED 패널에 연결</td></tr><tr><td>IR 컨트롤러 전원 케이블</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>SG-520USB-1</td><td></td></tr><tr><td>IR USB 컨트롤러</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>ENV-520USB</td><td></td></tr><tr><td>짝을 이루는 슬리브</td><td>Doric</td><td>SLEEVE_ZR_1.25</td><td></td></tr><tr><td>수정 LED 조명 패널</td><td>Genaray Spectro</td><td>SP-E-360D</td><td>일광 균형 색상 (5600K)</td></tr> <tr><td>전원 공급 장치</td><td>MEAN WELL USA</td><td>SP-320-12</td><td>LED 패널에 연결</td></tr><tr><td>원활한 개방 필드 챔버</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>ENV-510S</td><td></td></tr><tr><td>사운드 감쇠 큐비클</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>ENV-022MD-027</td><td></td></tr><tr><td>스탠드 앤 클램프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3개의 16빔 IR 어레이</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>ENV-256</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스에서 가벼운 혐오감을 이용한 편두통과 같은 행동 조사

Investigating Migraine-Like Behavior Using Light Aversion in Mice

편두통은 광공포증으로 관찰되는 빛에 대한 과민증과 같은 두통과 감각 이상을 특징으로하는 복잡한 신경 장애입니다. 마우스가 편두통을 겪고 있는지 확인하는 것은 불가능하지만 가벼운 혐오감은 광공포증의 편두통 증상에 대한 행동 대리자로 사용될 수 있습니다. 가벼운 혐오감을 테스트하기 위해, 우리는 밝은 / 어두운 분석을 사용하여 마우스가 밝거나 어두운 환경에서 자유롭게 보내는 시간을 측정합니다. 이 분석은 테스트 절차를 실행하기 전에 챔버에 사전 노출되고 조정 가능한 챔버 조명의 두 가지 중요한 수정을 도입하여 개선되었으며 55lux에서 27,000lux까지의 다양한 광도를 사용할 수 있습니다. 어둠 속에서 더 많은 시간을 보내는 선택은 불안을 나타내기 때문에, 우리는 또한 불안과 가벼운 혐오스러운 행동을 구별하기 위해 빛에 독립적 인 불안 테스트 인 오픈 필드 분석을 사용합니다. 여기에서는 밝은/어둡고 개방된 필드 분석에 대한 수정된 테스트 패러다임을 설명합니다. 이들 분석의 적용은 두 개의 마우스 균주에서 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP)의 복강내 주사 및 광유전학적 뇌 자극 연구를 위해 기술된다.

이 행동 테스트 패러다임은 가벼운 혐오스러운 행동을 테스트하도록 설계되었습니다. 순진한 야생형 마우스와 광유전학 마우스 모두를 사용하여 표적 뉴런 집단의 자극 동안 실시간으로 빛 혐오감을 조사할 수 있다.
이 절차는 CD1 및 C57BL/6J 마우스10,16에서 말초 CGRP 치료의 효과와 C57BL/6J 마우스19의 후부 시상 핵에서 뉴런의 광학 자극이 빛-혐오스러운 행동에 미치는 영향을 연구하는 데 사용되었다. 10-20주령의 수컷 및 암컷 모두를 포함하는 마우스를 실험에 사용하였다(도 2A, 도 2B-D, 및 도 3). 그 결과, CGRP...

설치류는 편두통 증상을보고 할 수 없습니다. 여기에서는 편두통 환자에서 가장 흔하고 귀찮은 증상 중 하나 인 가벼운 혐오감을 측정하기위한 관리 가능한 테스트 패러다임 (빛 / 어둠 및 개방 필드 분석)을 설명합니다.

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as ...

이 방법은 편두통 환자의 주요 불만 인 광공포증에 대한 전임상 행동 대리자를 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 감지가 자동이므로 매우 편리하다는 것입니다. 또한 가벼운 혐오감과 불안은 이러한 테스트를 수행함으로써 구별 될 수 있습니다.첫날에는 밝은/어두운 분석 장치를 켭니다. 조명 강도를 27, 000럭스로 설정합니다. 어두운 삽입물을 밝은/어두운 챔버에 넣습니다.추적 소프트웨어를 열고 새 프로토콜을 설정합니다. 새 프로토콜 설정에서 지속 시간을 30분으로 설정합니다. 새 분석 설정에서 지속 시간별로 데이터 저장소를 300초로 설정합니다.새 영역 설정에서 미리 정의된 영역을 선택합니다. 두 개를 선택한 다음 수평을 선택합니다. 챔버가 녹화를 위해 수평으로 두 개의 동일한 크기의 영역으로 나뉘어져 있는지 확인하십시오.테스트 전에 마우스를 한 시간 동안 시험실에 습관화하고 마우스의 일주기 리듬을 방해하지 않도록 방을 밝게 유지하십시오. 빛/어두운 분석용 모든 장비가 켜져 있는지 확인하여 마우스가 시험실 환경에 완전히 적응할 수 있도록 하십시오. 데이터 획득을 선택하고 마우스 ID를 입력한 후 프로토콜을 시작합니다.서랍을 사운드 감쇠 칸막이 바깥쪽으로 당겨 밝은/어두운 챔버와 어두운 인서트에 접근합니다. 마우스를 챔버의 조명 영역에 부드럽게 놓고 서랍을 칸막이 안쪽으로 밀어 넣습니다. 소프트웨어가 마우스를 즉시 감지하고 활동을 기록하기 시작하는지 확인하십시오.30분 후에 녹화가 자동으로 중지될 때까지 기다립니다. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다. 이전 마우스가 남긴 후각 신호를 근절하기 위해 알코올 냄새 살균 일회용 물티슈를 사용하여 챔버와 어두운 삽입물을 청소하십시오.넷째 날에는 첫날에 수행 된 모든 단계를 반복하십시오. 일곱째 날에는 첫날에 수행 된 단계를 반복하지만 마우스가 습관화 될 때까지만 반복하십시오. 습관화 후, 마우스를 복강내 CGRP로 투여한다.그런 다음 생쥐를 집 새장으로 돌려 보내십시오. 30분 후 프로토콜을 다시 시작하고 앞에서 언급한 대로 밝은/어두운 챔버에서 마우스를 실행합니다. 앞에서 설명한 대로 챔버와 어두운 삽입물을 청소하십시오.10 일째에 수행 된 모든 단계를 반복하십시오. 장치를 켜고 광도를 27, 000lux로 설정합니다. 추적 소프트웨어를 열고 이전에 설명한 대로 새 프로토콜을 설정합니다.새 영역 설정에서 가운데를 선택한 다음 하나를 선택합니다. 주변을 3.97cm로, 중심을 19.05 x 19.05 센티미터로 설정하십시오. 이전에 입증 된 것처럼 마우스를 시험실에 습관화하십시오.마우스를 복강내 CGRP로 투여한다. 생쥐를 집 새장으로 돌려 보내십시오. 30분 후에 프로토콜을 시작합니다.풀아웃 서랍을 소리 감쇠 칸막이 바깥쪽으로 당기고 마우스를 열린 필드 챔버 중앙에 부드럽게 놓습니다. 서랍을 칸막이 안쪽으로 밀어 넣습니다. 30 분 동안 마우스의 행동을 추적 한 다음 마우스를 집 케이지로 되돌립니다.앞에서 설명한 대로 장치를 청소합니다. 결과는 CGRP의 복강내 주사가 CD1 및 C57 검정 6J 마우스의 광/암흑 분석에서 광 영역에서 소요된 시간의 지속기간을 유의하게 감소시켰지만, CD1 및 C57 검정 6J 마우스에서 개방 필드 분석에서 마우스가 중앙에서 보낸 시간에는 영향을 미치지 않았다는 것을 밝혀냈다. CGRP에 의한 처리는 또한 마우스가 어두운 구역에서 쉬는 시간의 양을 증가시켰지만, CD1 및 C57 검정 6J 마우스 둘 다에서 밝은 영역에서는 그렇지 않았다.후부 시상 핵에서 뉴런의 광학 자극은 대조군 바이러스 주입 마우스에 비해 channelrhodopsin-2 주입 마우스의 빛/어두운 분석에서 광 영역에서 보낸 마우스의 지속 시간의 상응하는 감소를 가져왔다. 어두운 영역에서는 휴지 시간의 증가가 그러나 광 영역에서는 관찰되지 않았지만 대조군 바이러스 주입 마우스와 비교하여 채널로돕신-2 주입 마우스의 경우에도 관찰되었다. 마우스를 밝고 어두운 방에 넣을 때 가능한 한 많은 스트레스를 피하기 위해 마우스를 부드럽게 다루어야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 기술은 편두통 및 기타 광공포증 관련 장애의 기초가되는 메커니즘을 탐구하고 잠재적 인 치료제에 대한 전임상 효능을 테스트 할 수있는 길을 열어 줄 것입니다.

investigating-migraine-like-behavior-using-light-aversion-in-mice

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

어둠 / 빛으로 전환 시험은 마우스의 동작과 같은 불안을 측정하기 위하여 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 여기, 우리가 테스트를 실시하는 방법에 대한 자세한 절차를 보여주는 동영상을 제시한다.

마우스에 대한 진한 / 라이트 전환 테스트

고가 플러스 미로 테스트에서 마우스 동작과 같은 불안을 측정하는 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 여기, 우리는 테스트를 수행을위한 세부 절차를 보여주는 동영상을 제시한다.

마우스에 대한 고가 플러스 메이즈

출처: Zhang, L., et al. 근적외선(NIr) 광은 마우스 전정 감각 상피에서 미토콘드리아 기능 마커의 발현을 증가시킵니다. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 면도한 쥐 두피에 NIr 빛을 적용하여 전정 뉴런을 활성화하고 슈퍼옥사이드 디스뮤타제-1(SOD-1) 생성을 자극하여 신경 기능을 지원하는 과정을 보여줍니다. 이 절차는 신경 보호 전략으로서의 NIr 요법을 강조합니다.

근적외선을 사용한 마우스 모델에서 감각 신경 신호 조절

이 프로토콜은 쥐가 학습 및 기억 작업에 참여하는 동안 개별 뇌 영역의 뉴런 활동을 일시적 및 원격으로 침묵시키는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 약물 유전학(Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs)과 학습의 다양한 구성 요소를 구별하도록 설계된 행동 패러다임(감각 사전 조건화)을 결합합니다.

학습의 개별 단계에서 설치류에서 원격 음소거 신경 활동하는 방법

Photobiomodulation 치료 다양 한 신경학 상과 정신 장애의 처리를 위한 혁신적인 비 침 투 적인 양식 적임 이며 건강 한 두뇌 기능을 향상 시킬 수 있다. 이 프로토콜은 다른 실험실 설치류에 있는 사용을 위해 적응 시킬 수 있다 transcranial 빛 배달 여 쥐에서 뇌 photobiomodulation를 수행 하는 단계별 가이드를 포함 합니다.

마우스에 Transcranial Photobiomodulation 치료에 대 한 프로토콜

여기에서 우리는 마우스에 있는 optogenetics를 사용하여 장소 환경 설정 패러다임에 대한 2개의 따르기 쉬운 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이러한 두 가지 설정을 사용하여, 선호도 및 회피 거동은 높은 공간 및 시간 선택성을 가진 동일한 장치 내에서, 그리고 간단한 방식으로 단단히 평가될 수 있다.

마우스의 복부 테그멘탈 영역 내에서 광유전학을 사용하는 두 가지 실시간 장소 선호 패러다임

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

편두통의 가장 주목할만한 증상은 심한 두부 통증이며, 이것이 수막에 신경을 쓰는 감각 뉴런에 의해 매개된다는 가설이 있습니다. 여기에서는 안면 과민증을 출력으로 사용하면서 최소 침습적 방식으로 경막에 물질을 국부적으로 적용하는 방법을 제시합니다.

Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache

기계적 충돌-회피 분석은 다양한 마우스 통증 모델에서 정서적-동기 부여 반응을 더 잘 이해하기 위해 사용될 수 있는 마우스에서 통증 감수성의 비반사적 판독으로서 사용된다.

마우스의 통증 행동을 측정하기위한 기계적 충돌 회피 분석

이 프로토콜은 신경 생리학적 측정에 대한 시간 잠금과 호환되는 방식으로 시간이 지남에 따라 설치류의 자동화된 눈 사시를 추적하는 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 편두통과 같은 통증 장애의 메커니즘을 연구하는 연구자들에게 유용할 것으로 기대됩니다.

마우스 통증 연구에서 시간 동기화 행동 및 뇌 역학을 위한 자동화된 곁눈질 방법

학습하세요 마우스에서 가벼운 혐오감을 측정하는 행동 분석 방법을 통해 편두통의 광공포증을 연구하세요. 자동 감지 기술로 불안과 구분하여 전임상 모델에서 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

마우스에서 가벼운 혐오감을 이용한 편두통과 같은 행동 조사

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