생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

1 (전자 톤) 생체 발광 광유전학은 유전적으로 인코딩 된 광원이 세포 내와 세포 사이의 생물학적 기능과 네트워크를 시각화하고 제어 할 수있는 플랫폼 기술입니다. 생체 발광은 광섬유에 의한 조직 및 세포 손상 없이 표적 세포 집단에서 발현되는 모든 광 감지 도메인에 도달하고 물리적 광 노출을 연장한다. 시작하려면, 동결건조된 CTZ 5밀리그램을 각각의 용매 250마이크로리터에 용해시켜 루시페린 스톡을 준비하기 시작한다.

피펫팅으로 벽을 따라 CTZ가 용해되도록하십시오. 바이알을 직사광선으로부터 보호하면서 0.5밀리리터 검정 마이크로 원심분리 튜브에 50마이크로리터 분취량을 준비하고 분취량을 섭씨 영하 80도에 보관하여 나중에 사용할 수 있도록 합니다. 적색광으로 비추는 층류 후드의 가벼운 밀폐 된 방에서 모든 추가 조작을 수행하십시오.

단일 생체 발광 광 자극을 수행하기 위해, 100 마이크로몰의 최종 농도로 세포에 첨가하기 직전에 세포 배양 배지에서 루시페린의 작동 용액을 준비한다. 루시페린 함유 배지를 세포에 첨가하고, 원하는 광자극 기간 동안 인큐베이션한다. 빨간불을 끕니다.

눈이 어두워질 때까지 몇 초 동안 기다린 후 눈으로 발광을 모니터링하십시오. 사진을 찍어 발광을 문서화합니다. 루시페린 함유 배지를 배양 배지로 대체하여 광 자극을 종료한 다음, 세포를 배양 배지로 한두 번 세척하여 실험 민감도에 따라 루시페린을 모두 제거한다.

세포 손실을 피하려면, 세포를 PDL 코팅 접시 상에 플레이트하고 세포를 인큐베이션한다. 반복적 인 생체 발광 광 자극을 수행하려면 상자와 검은 색 시트를 사용하여 라이브 세포 이미징 현미경 주위에 가벼운 타이트한 구획을 만들어 라이브 세포 이미징 챔버를 설정하십시오. 방 안에있는 모든 광원을 덮으십시오.

흡입 및 폐기물 용기로 이어지는 챔버 출력을위한 원하는 용액으로 관류 시스템을 설정하십시오. 반복 자극의 수에 따라, 준비된 작동 루시페린 이미징 용액을 마이크로원심분리 튜브 내로 분취한다. 형질감염된 세포가 있는 커버슬립을 챔버에 넣는다.

펌프를 계속 작동시키면서 흡기 비이커에서 펌프의 입구 튜브를 제거하십시오. 입구 튜브를 루시페린 용액에 빠르게 담그고 튜브의 공기 공극을 피하기 위해 전환 시간을 짧게 유지하십시오. 루시페린 용액이 흡수되자마자, 입구 튜브를 흡기 비이커에 다시 넣으십시오.

세포가 노출되어야 하는 생리학적 패턴에 따라 몇 분에서 몇 시간 간격으로 필요한만큼 루시페린에 유입 튜브를 제거하고 침지하는 것을 반복하십시오. 이어서, 세포를 전사 또는 광 자극의 효과가 평가될 때까지 지속기간 동안 16 내지 24시간 동안 광보호된 환경에 보관한다. 생체 내에서 생체 발광 활성화를 수행하려면 CTZ 바이알을 섭씨 영하 80도에서 꺼내어 루시페린을 준비한 다음 빛 보호 구역에서 실온으로 따뜻하게하십시오.

500 마이크로 그램의 CTZ가 들어있는 각 바이알에 피펫을 사용하여 250 마이크로 리터의 멸균수를 넣고 고무 마개를 다시 바이알에 넣으십시오. 재구성된 유리 바이알을 섭씨 55도에서 몇 분 동안 강화된 수조에서 인큐베이션하여 분말을 완전히 용해시킨다. 용액을 검은 색 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 벽을 헹구어 모든 CTZ를 검색하십시오.

필요한 용액의 양을 제거한 후 나머지 용액을 섭씨 네 도에 보관하십시오. 유사한 방식으로 비히클을 준비, 재구성 및 분취한 후, 선택된 동물 및 적용 경로의 크기에 필요한 루시페린 또는 비히클의 부피를 제거함으로써 생체발광 광 자극을 예비성형한다. 설계된대로 루시페린 또는 차량으로 동물을 주입하십시오.

특정 행동 패러다임 동안 원하는 재조합 효소 활성화를 위해, 행동 테스트 직전에 동물을 주사하십시오. phasic 전사를 위해, 수일에 걸쳐 반복적으로 동물을 주입하고 설계된대로 생체 발광 자극 동물로부터 데이터를 수집하십시오. 빠른 빛 및 활성 조절된 발현 시스템은 증가된 세포내 칼슘 이온 및 광을 갖는 리포터 유전자의 전사를 허용하였다.

청색 LED는 견고한 리포터 형광을 유도하였고 FLuc 발현은 루시페린 첨가 후 발광 측정에 의해 결정되었다. 생체내 이미징 시스템에서, LED 및 CTZ 둘 다 FLuc 발현을 견고하게 증가시켰고, 전사 인자 성분 단독의 존재는 아마도 자발적인 단백질 분해로 인해 상당한 배경 신호를 초래하였다. NanoLuc은 CRY/CIB 이량체화 및 감광성 전사 인자 EL222를 통한 옵토제닉 조절에 사용되었습니다.

hCTZ를 HEK-293 세포에 첨가하여 유도하고 15분 후에 제거한 생체 발광은 CRY/CIB 및 EL222에 대한 LED 노출의 20분보다 더 효율적이었다. hCTZ로 공동 형질감염되었을 때 두 시스템 간에 전사 효능에 있어서 유의한 차이는 관찰되지 않았지만, CRY/CIB의 융합 단백질은 EL222보다 더 효율적이었다. CRY/CIB는 hCTZ 농도와 무관하게 EL222에 비해 지속적으로 높은 배경 수준을 보였다.

VVD LOV 단백질 iCreV에 기초한 감광성 분할 Cre 재조합효소의 생체발광을 시험하였다. CTZ 적용의 결과는 CTZ 존재가 백그라운드에서 발현을 견고하게 증가시키고 LED 응용 프로그램과 유사하다는 것을 보여주었습니다. 생체 발광을 사용하여 철분 이동 광수용체를 활성화시킬뿐만 아니라 모든 광감각 도메인은 시간 및 공간 스케일에 걸쳐 세포 기능의 조작을 확장하는 빛 자극에 또 다른 차원을 추가합니다.

생체 발광 광유전학은 세포 및 모델 유기체에 적용되었습니다. 이들 프로토콜은 시험관내 및 생체내에서 광범위한 지시된 가설을 시험하도록 맞춤화될 수 있다.