Name: 신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 효소 단백질의 미토콘드리아 내 위치를 결정하는 방법을 Saccharomyces cerevisiae에서. 이 프로토콜은 단백질 기능 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리는 제출 에 대한 제기 항체를 제공 에 이 치골로프 박사 (컬럼비아 대학) 박사 에게 감사드립니다 Cyt. b2, αKGD 및 스코1. 우리는 또한 이 프로토콜의 수립 기간 동안 유용한 토론과 의견에 대한 마리오 헨리크 드 바로스 박사 (Universidade 드 상파울루)에게 감사드립니다.
이 작품은 Fundação 드 Amparo à Pesquisa do Estado de 상파울루 (FAPESP) (보조금 2013/07937-8)의 연구 보조금에 의해 지원되었습니다.
페르난도 고메스와 헬레나 투라노도 FAPESP의 지원을 받으며, 2017/09443-3및 2017/23839-7을 각각 지원합니다. 앙겔리카 라모스는 코르데나샤오 데 아페르페이소아멘토 데 페소알 드 니벨 슈페리어(CAPES)의 지원을 받고 있습니다.

1. 효모 세포의 성장
<ol><li>-80°C 글리세롤 스톡으로부터 세포의 작은 부분을 YPD(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 포도당 2% 포도당)에 적신시켜 관심의 단일 콜로니를 분리한다. 플레이트를 30°C에서 2-3일 동안 배양한다. 참고: 이 프로토콜에 사용되는 S. 세레비시아에 균주는 BY4741(MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). 보조 영양 마커 유전자를 제외하고,이 균주는 삭제 된 유전자를 포함하지 않으며 플라스미드를 수행하지 않습니다. 따라서, 그것은 성공적으로 활발한 세포 성장을 자극, 풍부한 매체에서 재배 될 수있다. 플라스미드로 변형된 균주로 작업할 때 플라스미드 선택을 위해 적절한 최소 배지를 사용합니다.</li>
	<li>YPGal 배지의 10-20 mL에서 YPD 한천 플레이트에서 2-3 개의 개별 콜로니를 접종하여 스타터 문화를 준비 (1% 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 갈락토세) 100 mL Erlenmeyer 플라스크에서. 30°C에서 24시간 동안 활발한 흔들림으로 배양합니다. 참고: 성장 배지의 선택은 프로토콜에 사용되는 효모 변형에 따라 달라집니다. YPD와 YPGal은 모두 미토콘드리아 호흡을 수행하지 않는 균주의 성장을 허용하는 발효 탄소 원을 함유하고 있습니다. 그러나, 포도당은 많은 미토콘드리아 유전자의 발현을 억압하기 때문에, 미토콘드리아의 더 적은 양을 생성하기 때문에 이 탄소 원을 사용하는 것이 좋습니다. 호흡할 수 있는 호흡기 유능한 균주와 함께 작업할 때, 미토콘드리아의 더 높은 수율을 얻기 위해 글리세롤과 에탄올과 같은 탄소원을 사용할 수도 있다.</li>
	<li>스타터 문화를 신선한 YPGal 배지 1L로 희석하여 OD600 미만으로 0.1 이내로 희석합니다. OD600이 1-1.5에 도달할 때까지 활발한 흔들림으로 30 °C에서 세포를 경작시다. 참고: 실험을 수행하기 전에 각 효모 변형에 대한 성장률(두 배 시간)을 결정합니다. 이것은 문화권이 1-1.5의 OD600 에 도달하는 데 필요한 배양 시간의 정확한 추정을 제공합니다.</li>
</ol>2. 고도로 정제된 미토콘드리아의 격리
참고: 이 프로토콜은 17에서 약간 수정되어 조정됩니다.
<ol><li>실온에서 5 분 동안 3,000 x g 에서 원심 분리로 세포를 수확하십시오.</li>
	<li>증류수로 세포를 씻고 실온에서 5 분 동안 3,000 x g 에서 원심 분리로 수집하십시오.</li>
	<li>세포의 젖은 무게를 결정합니다. 참고: 2.2단계에서 세포 펠릿의 중량을 측정하는 가장 쉬운 방법은 세포 수집 직전에 빈 원심분리기 튜브의 무게를 결정하는 것입니다. 원심 분리 후, 상체를 버리고 세포와 동일한 튜브의 무게를 측정합니다. 셀의 무게는 두 측정간의 차이입니다.</li>
	<li>파스퇴르 파이펫 또는 P5000 팁을 사용하여 DTT 버퍼(셀 1g당 2mL)에서 세포를 다시 중단합니다. DDT 버퍼 컴포지션의 표 1 을 참조하십시오.</li>
	<li>부드러운 흔들림 (~70 rpm)으로 20분 동안 30°C에서 세포를 배양합니다.</li>
	<li>심열기는 3,000 x g 에서 실온에서 5 분 동안 세포를 펠렛합니다.</li>
	<li>효소없이 Zymolyase 버퍼로 세포를 씻으면 (세포 1 g당 약 7 mL). Zymolyase 버퍼 컴포지션의 표 1 을 참조하십시오.</li>
	<li>심열기는 3,000 x g 에서 실온에서 5 분 동안 세포를 펠렛합니다.</li>
	<li>Zymolyase없이 버퍼에서 세포를 다시 일시 중지 (세포의 1 g 당 7 mL).</li>
	<li>셀 서스펜션을 250mL 에렌마이어 플라스크로 옮기고 Zymolyase-20T(젖은 체중 당 3 mg)를 추가합니다.</li>
	<li>30°C에서 30-40분 동안 부드러운 흔들림(~70rpm)으로 세포를 배양합니다. Zymolyase 치료 전후에 세포 현탁액의 탁도를 비교하여이 과정의 효율성을 확인하십시오. 참고: 이 단계에서 세포는 Zymolyase에 의한 세포 벽 소화로 인해 구형으로 변환됩니다.<ol>
<li>이를 위해 각 셀 서스펜션의 50 μL을 2mL의 물을 포함하는 별도의 유리 튜브에 추가하십시오. 적극적으로 혼합 한 후, Zymolyase로 치료 된 세포 현탁액의 탁도는 구엽세포의 삼투질 중단으로 인해 급격히 감소해야합니다. 한편, 비처리된 세포 현탁액의 탁도는 변하지 않아야 한다. 참고: 탁도의 효과는 간단한 육안 검사또는 두 샘플의 OD600 을 측정하여 모니터링할 수도 있습니다. 두 번째 경우, Zymolyase 처리 된 샘플의 OD600 은 비 처리 된 샘플의 10 %-20 %여야합니다. 대체 방법은 가벼운 현미경 검사를 사용하여 두 샘플모두에서 세포를 계산하는 것을 포함한다.</li>
		<li>구엽세포 형성의 수율이 낮으면 Zymolyase를 더 추가하고 추가 로 15 분 간격으로 인큐베이션하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>4°C에서 5분 동안 2500 x g 에서 원심분리로 구형성형을 수확하십시오. 참고: 모든 추가 단계는 가수분해 효소에 의한 단백질 분해를 피하기 위해 얼음또는 4°C에서 빠르고 빠르게 수행되어야 합니다.</li>
	<li>스푸퍼러스트에 얼음-차가운 균질화 버퍼(세포 1g당 약 6.5mL)와 펠릿을 4°C에서 5분 동안 2,500xg에서 원심 분리하여 세척합니다. 균질화 버퍼 컴포지션의 표 1을 참조하십시오.</li>
	<li>얼음 차가운 균질화 완충제(세포 1g당 6.5mL)로 구형 세포를 다시 중단하고 미리 냉각된 유리 두스균제로 옮긴다. 약 30mL의 대형 유리 균질화제를 사용하십시오.</li>
	<li>유봉을 사용하여 15 스트로크로 구획을 균질화합니다. 참고: 유봉 피팅에 따라 스트로크 수를 조정해야 합니다. 단단한 유봉의 경우 15 스트로크가 충분합니다. 다른 한편으로는, 느슨한 유봉을 사용하는 경우, 최대 수행 하는 것이 좋습니다 25 스트로크.</li>
	<li>균류를 50mL 원심분리기 튜브로 옮기고 1부의 얼음-차가운 균질화 버퍼를 추가합니다.</li>
	<li>원심분리기는 저속으로 균동화, 4°C에서 5분 동안 1,500 x g 의 핵, 세포 이물질 및 끊어지지 않은 세포를 환원한다.</li>
	<li>펠릿을 방해하지 않도록 주의를 기울이는 파스퇴르 파이펫 또는 P5000 팁을 사용하여 새로운 50mL 원심분리기 튜브로 상체를 전송합니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 4,000 x g 의 원심분리기.</li>
	<li>상체를 고속 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 원심분리기를 전달하여 조잡한 미토콘드리아 분획을 펠렛합니다.</li>
	<li>P5000 팁을 사용하여 부드러운 파이펫팅으로 20-30mL 얼음-차가운 균질화 버퍼에서 상체를 버리고 원유 미토콘드리아 펠릿을 부드럽게 세척합니다.</li>
	<li>현탁액을 50mL 원심분리기 튜브및 원심분리기로 4,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 나머지 세포 이물질을 펠렛으로 옮긴다.</li>
	<li>상체를 고속 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 원심분리기를 전달하여 조잡한 미토콘드리아 분획을 펠렛합니다.</li>
	<li>P1000 팁을 사용하여 부드러운 파이펫팅을 통해 상체를 버리고 소량(일반적으로 1000 μL)의 얼음-차가운 SEM 버퍼로 원유 미토콘드리아 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. SEM 버퍼 컴포지션의 표 1 을 참조하십시오. 참고: 이 조미토콘드리아 분획 은 organello 단백질 수입 분석과 같은 일부 응용 분야에서 직접 사용할 수 있지만, 그것은 다른 세포 성분의 상당한 양을 포함. 이러한 오염은 단백질의 제출 국소화를 결정할 때 결과의 오해로 이어질 수 있습니다. 따라서, 아래에 설명된 바와 같이, 고도로 정제된 미토콘드리아 제제를 얻기 위해서는 추가 정화 단계가 요구된다.</li>
	<li>60%, 32%, 23%, 15%(w/v)의 농도로 EM 버퍼에서 자당 솔루션을 준비합니다. 이러한 용액은 4°C에서 최대 1개월 동안 안정적입니다. EM 버퍼 컴포지션의 표 1 을 참조하십시오.</li>
	<li>다음과 같이 초원심분리기 튜브에 4단계 자당 그라데이션을 준비하십시오: 원심분리기 튜브의 바닥에 60%(w/v)의 1.5mL을 놓습니다. 다음으로, 파이펫은 조심스럽게 단계별로: 32%, 1.5mL의 32%, 1.5mL, 15% 자당(w/v)의 1.5mL. 단계를 방해하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>자당 그라데이션 위에 조잡한 미토콘드리아 분획을 조심스럽게 적재합니다.</li>
	<li>스윙 버킷 로터에서 4 °C에서 134,000 x g 에서 1 h의 원심 분리기.</li>
	<li>60%/32% 자당 인터페이스에서 갈색 밴드로 표현되는 고도로 정제된 미토콘드리아 분획에 도달할 때까지 자당 용액을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>P1000 컷 팁을 사용하여 정제 된 미토콘드리아를 복구하고 미리 냉각 된 고속 원심 분리 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>복구된 미토콘드리아를 5-10부의 얼음-차가운 SEM 버퍼로 희석시 희석시.</li>
	<li>4°C에서 12,000 x g 에서 30분 동안 원심분리기.</li>
	<li>P1000 컷 팁을 사용하여 부드러운 파이펫팅으로 얼음 차가운 SEM 버퍼의 500 μL에서 순수한 미토콘드리아를 다시 중단합니다.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 브래드포드 절차를 사용하여 고도로 정제된 미토콘드리아 제제의 단백질 농도를 결정합니다. 단백질 농도를 10 mg의 단백질/mL로 조정하여 얼음-차가운 SEM 버퍼로 조정합니다. 참고: 아래에 설명된 제출된 분별 프로토콜의 경우, 갓 준비된 미토콘드리아를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, Vögtle 및 협력자는 미토콘드리아 의 손상성에 대한 상세한 품질 관리 분석을 수행하고 냉동 세포기관이 이 프로토콜13에도 사용될 수 있음을 보여주었다. 이를 위해, 40 μL의 알리쿼트를 만들고 액체 질소로 동결하십시오. -80 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>3. 제출[]
참고: 본 프로토콜은 reference18 로부터 조정되며 단백질제 K의 존재 또는 부재시 (1) 저혈압 부종, (2) 초음파 처리 후 탄산염 추출의 두 단계로 구성됩니다. 단백질 분해를 피하기 위해 얼음 또는 4°C에서 두 프로토콜의 모든 단계를 수행합니다.
<ol><li>단백질Ae K의 존재에 저혈압 붓기
	<ol>
<li>고도로 정제된 미토콘드리아 40μL을 10 mg/mL(400 μg)에서 4개의 1.5mL 사전 냉각 라벨마이크로센티리슈지 튜브로 옮춥니다.</li>
		<li>튜브 1과 2에 SEM 버퍼 360 μL을 추가합니다.</li>
		<li>튜브 3및 4에 EM 버퍼 360 μL을 추가합니다.</li>
		<li>튜브 2와 4에 단백질라제 K(10 mg/mL)의 4 μL을 추가합니다. 실수방지를 위해 표 2 에 나열된 파이펫팅 스키마를 사용합니다. 참고: 사용하기 직전에 10 mg/mL 의 단백질 제 K 용액을 물에 담근다. 실험에서 단백질Ae K의 최종 농도는 약 50-100 μg/mL이어야 한다. 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.</li>
		<li>모든 튜브를 부드럽게 섞고 얼음에 30분 간 배양하고 가끔 섞어 주세요.</li>
		<li>단백질Ae K 활동을 중지하는 모든 네 개의 튜브에 200 mM PMSF의 4 μL을 추가합니다. 주의: PMSF는 매우 독성이 있습니다. PMSF가 포함된 솔루션으로 작업할 때 장갑을 착용하십시오.</li>
		<li>4°C에서 30분 동안 20,000 x g 의 원심분리기.</li>
		<li>상체를 수집하고 새로운 1.5 mL 미리 냉각 된 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 참고: 펠릿은 추가 SDS-PAGE 및 서부 블롯 분석을 위해 샘플 버퍼에서 직접 재장매할 수 있습니다. 그러나, 단백질제 K의 흔적은 PMSF 치료 후에도 활성 상태로 유지될 수 있으며, 결국 펠릿이 SDS 함유 시료 완충액에 용해된 후 일부 단백질을 소화할 수 있다. 이러한 문제를 피하기 위해, 단백질Ae K는 아래에 설명된 바와 같이 트리클로로아세트산(TCA)을 가진 시료의 처리에 의해 완전히 비활성화될 수 있었다. 주의: TCA는 매우 독성이 있습니다. TCA가 포함된 솔루션으로 작업할 때 장갑을 착용하십시오.</li>
		<li>얼음-차가운 SEM 버퍼의 400 μL에서 3.1.8 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
		<li>상체(3.1.8단계로부터)와 TCA를 사용하여 재중단된 펠릿(3.1.9단계)을 10%(w/v)의 최종 농도로 침전시한다.</li>
		<li>얼음에 있는 모든 튜브를 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>4°C에서 12,000 x g 에서 10분 동안 TCA 처리 된 샘플을 원심 분리합니다.</li>
		<li>상체를 제거하고 200μL의 샘플 버퍼에서 펠릿을 다시 분리합니다. 참고: 브로모페놀 블루 pH 표시등이 산성 처리로 인해 노란색으로 변할 수 있습니다. 이 경우 파란색으로 변할 때까지 1 M Tris 베이스의 작은 알리쿼트(1-5 μL)를 추가합니다.</li>
		<li>모든 튜브에 200mM PMSF의 4 μL을 추가합니다.</li>
		<li>SDS-PAGE 및 서부 블롯에 의해 추가 분석될 때까지 모든 샘플을 -80°C에 저장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>초음파 처리 및 탄산염 추출 참고 : 이 프로토콜에서 초음파 처리가 미토콘드리아 막의 파열을 일으키면 갓 준비된 미토콘드리아를 사용할 필요가 없습니다.<ol>
<li>10 mg/mL (2 mg 단백질)에서 고도로 정제 된 미토콘드리아 200 μL을 1.5 mL 미리 냉각 된 미세 센심 분리 튜브로 옮춥니다.</li>
		<li>미토콘드리아를 얼음으로 차가운 SEM 버퍼로 1배 희석합니다.</li>
		<li>얼음 에 3 x 30 초 동안 소닉 미토콘드리아. 작은 볼륨에 호환되는 초음파 처리기를 사용합니다.</li>
		<li>원심분리기는 4°C에서 100,000 x g 에서 30분 동안 시료를 분리합니다.</li>
		<li>상체를 수집하고 새로운 1.5 mL 사전 냉각 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 얼음 위에 보관하십시오. 이 샘플은 수용성 단백질 분수(S)라는 이름으로 명명됩니다.</li>
		<li>얼음-차가운 SEM 버퍼의 400 μL에서 3.2.4 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
		<li>3.2.6 단계에서 재부유 된 펠릿의 100 μL을 가져 와서 새로운 1.5 mL 미리 냉각 된 미세 원심 분리기 튜브로 옮춥니다. 얼음 위에 보관하십시오. 이 샘플은 제출입자 분수(SMP)로 명명됩니다.</li>
		<li>나머지 300 μL을 3.2.6 단계에서 1배 에서 신선하게 준비된 탄산나트륨으로 희석시.</li>
		<li>30분 동안 얼음 위에서 3.2.8단계에서 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>원심분리기는 4°C에서 100,000 x g 에서 30분 동안 시료를 분리합니다.</li>
		<li>상체를 수집하고 새로운 1.5 mL 사전 냉각 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 얼음 위에 보관하십시오. 이 샘플은 탄산염 상수 분획(CS)으로 명명됩니다.</li>
		<li>얼음-차가운 SEM 버퍼의 400 μL에서 3.2.10 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다. 이 샘플은 탄산침분획(CP)으로 명명됩니다.</li>
		<li>TCA를 사용하여 모든 샘플(S, SMP, CS 및 CP)을 10%(w/v)의 최종 농도로 침전시합니다.</li>
		<li>얼음에 있는 모든 튜브를 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>4°C에서 12,000 x g 에서 10분 동안 TCA 처리 된 샘플을 원심 분리합니다.</li>
		<li>상체를 제거하고 샘플 버퍼의 각 펠릿을 다시 분리합니다. 샘플 버퍼가 노란색이 되면 1 M Tris 베이스의 작은 알리쿼트(1-5 μL)를 추가하여 파란색으로 바뀝니다.</li>
		<li>모든 튜브에 200mM PMSF의 1 μL을 추가합니다.</li>
		<li>SDS-PAGE 및 서부 블롯에 의해 추가 분석될 때까지 모든 샘플을 -80°C에 저장합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 성공적으로 사용되고 지속적으로 제출된 본래의 단백질 국소화를 결정하기 위해 장기간 에 최적화되어 있다13,14,18,21,22,23. 이 프로토콜의 신뢰성과 재현성은 미토콘드리아 제제의 순도와 무결성에 크게 의존한다18. 이 두 가지 요구 사항은 원유 미토콘드리아 제제13,24,25(도 1)에 추가 정화 단계(자당 밀도 그라데이<sup ...

미토콘드리아는 생체 에너지, 세포 대사 및 신호 경로1에서 중요한 역할을 하는 진핵 세포의 필수 세포입니다. 이러한 작업을 제대로 실행하기 위해 미토콘드리아는 구조와 기능을 담당하는 독특한 단백질과 지질 세트에 의존합니다. 신진 효모 사카로미세스 cerevisiae 널리 미토콘드리아 프로세스에 대한 조사를위한 모델 시스템으로 사용되었습니다, 뿐만 아니라 다른 세포기관2. 효모에 있는 단지 8개의 단백질을 위한 미토콘드리아 게놈 코드; 미토콘드리아 단백질의 대다수 (~99%)는 세포성 리보솜에서 번역되는 핵 유전자에 의해 인코딩되고, 그 후에 정교한 단백질 수입 기계에 의해 그들의 정확한 제출된 제출으로 수입됩니다3,4,5. 따라서, 미토콘드리아 생물발생은 핵과 미토콘드리아 게놈 6,7의 조정된 발현에 의존한다6,7. 미토콘드리아 생물 발생에 결함을 일으키는 유전 돌연변이는 인간 질병8,9,10과 연관됩니다.
지난 2년간 고정화 미토콘드리아를 대상으로 한 고처리량 프로테오믹 연구는 효모 미토콘드리아 프로테오메의 포괄적인 특성화를 초래했으며, 이는 적어도 900단백질11,12,13,14로 구성된 것으로 추정되고 있다. 이러한 연구는 귀중한 정보를 제공했지만, 4개의 미토콘드리아 하위 구획, 즉 외부 막(OM), 막 간 공간(IMS), 내부 막(IM) 및 매트릭스에서 각 단백질의 소구체화가 여전히 요구된다. 이 질문은 부분적으로 두 개의 작은 미토콘드리아 하위 구획의 프로테오믹 전체 연구로 해결되었다 (OM 및 IMS)15,16. 최근에는 Vögtle과 협력자들은 효모에서 고품질의 글로벌 프로포톤드 단백질 분포지도를 생성하여 큰 진전을 이루었습니다. 저자는 SILAC 기반 정량 질량 분광법, 상이한 제출 분별 프로토콜 및 OM 및 IMS 프로테옴의 데이터 세트를 결합한 통합 된 접근 방식을 사용하여 818 단백질을 4 개의 미토콘드리아 하위 구획13에 할당했습니다.
이러한 높은 처리량 프로테오믹 연구에 의해 달성 된 진보에도 불구하고, 제출 프로테오메 조성에 대한 우리의 지식은 완료되지 않습니다. 실제로, Vögtle및 협력자가 효모 미토콘드리아로 국소화되는 것으로 보고된 986개의 단백질 중, 168개는 4개의 제출된 제출된 구획13에서 할당될 수 없었습니다. 더욱이, 저자는 미토콘드리아 막의 주변에 말초로 부착될 것으로 예상되었던 단백질의 막 토폴로지에 관하여 정보를 제공하지 않았다. 예를 들어, 내막에 말초로 부착된 단백질이 매트릭스 또는 막 간 공간을 향하고 있는지 알 수 없다. 프로테오메 전체 연구에서 이러한 누락 된 데이터 외에도, 미토콘드리아 단백질의 상당수의 suborganellar 국소화에 대 한 충돌 하는 정보가 있다. 한 가지 예는 Saccharomyces 게놈 데이터베이스 (SGD) 및 Uniprot와 같은 일반적인 데이터베이스에 있는 막 간 공간 단백질로 할당된 protease Prd1입니다. 놀랍게도, 여기에 설명된 것과 유사한 과절 프로토콜을 사용하여 Vögtle 및 협력자들은 Prd1이 정품 매트릭스 protein13임을 분명히 보여주었습니다. 위에서 언급했듯이, 많은 미토콘드리아 단백질의 제출국국화는 해명되거나 재평가될 필요가 있다. 여기서, 우리는 효모 미토콘드리아 단백질의 소독제 국소화를 결정하기 위하여 간단하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 연구 그룹에 의해 개발되고 최적화되었으며 많은 미토콘드리아 단백질의 막 토폴로지뿐만 아니라 제출국소화를 결정하는 데 일상적으로 사용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA 지방산 무함유)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>균질화 완충액 구성 요소</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td>DDT 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>D-소르비톨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>갈락토</td><td>오스 시그마-알드리치</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 불소(PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>proteinase K</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid (TCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr> Trizma Base <tr><td>Arthrobacter luteus</td><td>MP Biomedicals의</td><td></td> Sigma-Aldrich T1503 Zymolyase-20T 320921 <td>살아있는 효모 세포벽을 용해하여 스페로플라스트를 생산하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>.<td></td></tr></tbody></table>

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

효모 미토콘드리아 프로테오메의 특성화에 있는 최근 어드밴스에 있는 진보에도 불구하고, 단백질의 상당수의 제출국국화는 애매하게 남아 있습니다. 여기서, 우리는 미토콘드리아 단백질 기능 용해화 동안 근본적인 단계로 간주되는 효모 미토콘드리아 단백질의 소구체국화를 결정하는 강력하고 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 고도로 순수한 그대로미토콘드리아를 얻는 것으로 구성된 초기 단계를 포함한다. 이러한 미토콘드리아 제제는 단백질제 K(protease)를 사용하여 저혈압(swelling) 및 배양으로 구성된 서브배율 프로토콜을 받게 된다. 붓기 동안, 외부 미토콘드리아 막은 선택적으로 중단되어 단백질Ae K가 막 간 공간 구획의 단백질을 소화할 수 있게 합니다. 병행하여 막 단백질의 토폴로지에 대한 정보를 얻기 위해 미토콘드리아 제제는 처음에는 초음파 처리된 다음 탄산나트륨을 사용하여 알칼리성 추출을 실시한다. 마지막으로, 원심 분리 후, 이러한 다른 치료법에서 펠릿과 상피 분획은 SDS-PAGE 및 서부 블롯에 의해 분석됩니다. 관심 있는 단백질의 막 토폴로지뿐만 아니라 제출된 국소화는 서양 블롯 프로파일을 알려진 표준과 비교하여 얻어진다.

제출의 성공은 고도로 정제된 미토콘드리아를 얻는 것에 달려 있습니다. 이를 위해 효모 세포 용해 중에 세포세포의 손상성이 거의 완전히 보존되어 있는 것이 필수적입니다. 이는 세포벽의 효소 소화를 결합한 세포 용해 프로토콜을 이용하여 두스호균제를 사용하여 플라즈마 멤브레인의 물리적 중단을 통해 달성된다. 미토콘드리아 내용은 차동 원심분리에 의해 수집됩니다. 이러한 세포전 분획은 미토콘드리아 마커 단백질(도 1, 레인 2)의 높은 수준의 포르린(Por1)의 존재에 의해 확인된 바와 같이 농축된 미토콘드리아 분획을 산출한다. 그러나, 이것은 폐질 망상, 바쿨올, 사이토솔 및 내시경을 포함하여 그밖 세포 구획의 상당한 양을 포함하는 조잡한 미토콘드리아 분획입니다 (그림 1, 레인 2). 이러한 오염은 제출 단백질 국소화 실험과 같은 일부 응용 분야에서 유물을 도입할 수 있습니다. 이러한 오염의 양을 줄이기 위해, 조미토콘드리아 분...

최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

이 프로토콜은 미토콘드리아 단백질 기능 용해화 중 근본적인 단계로 간주되는 효모 미토콘드리아 단백질의 제출된 국소화를 결정하도록 설계되었습니다. 프로토콜은 다른 성장 조건에서 유지되는 효모 균주에 적합합니다. 미토콘드리아를 연구하는 것으로 연구를 위한 강력한 도구를 대표합니다.우선, 80C에 저장된 글리세롤 스톡의 줄무늬 세포가 YPD 한천 판에 들어가서 단일 콜로니를 관심있는 변형으로부터 분리합니다. 그리고 2 ~ 3 일 동안 30 C에서 플레이트를 배양하십시오. YPGal 배지 10~30ml를 함유한 100ml 에렌마이어 플라스크에서 YPD 사마접시에서 2~3개의 개별 콜로니를 접종하여 스타터 컬쳐를 준비합니다.플라스크를 30C에서 24시간 동안 인큐베이팅하여 180~200rpm에서 격렬한 흔들림을 합니다. 스타터 배양을 신선한 YPGal 배지 의 1L로 희석하여 600 nm에서 0.1 미만의 광학 밀도로 희석합니다. 광학 밀도가 1 에서 1.5에 도달할 때까지 약 180 에서 200 rpm에서 약 12 시간 동안 활발한 흔들림으로 30 C에서 세포를 재배하십시오.텍스트에 설명된 바와 같이 고도로 정제된 미토콘드리아의 분리를 수행한다. 그리고 제조 업체의 지시에 따라 브래드포드 분석기를 사용하여 고도로 정제 된 미토콘드리아 제제의 단백질 농도를 결정합니다. 얼음 차가운 SEM 버퍼로 단백질 농도를 10 mg/ml로 조정합니다.고도로 정제된 미토콘드리아 40l을 1.5ml의 사전 냉장 및 표지된 미세원심분리기 튜브 4개로 옮춥니다. 첫 번째 및 두 번째 튜브에 360 l의 SEM 버퍼를 추가합니다. 그리고 제 3 및 네 번째 튜브에서 EM 버퍼의 360 l.텍스트에 따라 파이펫팅 방식을 사용하여 두 번째 및 네 번째 튜브에 갓 준비된 단백질 Ase K 4 L을 추가합니다. 모든 튜브를 부드럽게 혼합한 후, 가끔 섞어 30분 동안 얼음에 배양합니다. 단백질Ae K 활성을 중지하려면 4개의 튜브모두에 200mM PMSF의 4L을 추가합니다.4C.에서 30 분 동안 20, 000 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않고 새로운 1.5 ml 미리 차가운 라벨 마이크로 센시드 퍼지 튜브로 슈퍼 네티컬을 수집합니다. 다음으로, 얼음 차가운 SEM 버퍼 400l에서 펠릿을 다시 놓습니다. 단백질제 K의 가능한 흔적을 비활성화하려면 수집된 수퍼나탈을 침전시키고 트리클로로아세트산으로 펠릿을 10%의 최종 농도로 10분간 얼음에 튜브를 배양한다.원심분리제 는 4C.에서 12, 000 x g에서 10 분 동안 처리 된 트리클로로아세트산 샘플을 원심 분리하고 상퍼를 제거 한 후 200 l의 샘플 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다. 브로모페놀 블루가 노란색으로 변하면 1M Tris 베이스의 1~5l을 추가하여 파란색으로 바뀝니다. 모든 튜브에 200mM PMSF 4l을 추가합니다.SDS PAGE 및 서부 블롯에 의해 추가 분석될 때까지 샘플을 80C로 저장합니다. 고도로 정제된 미토콘드리아 200l을 1.5ml의 미리 차가운 미세 원심분리기 튜브로 옮춥니다. 미토콘드리아를 얼음으로 차가운 SEM 버퍼로 1배 희석합니다.소량과 호환되는 초음파 처리기를 사용하여 미토콘드리아를 얼음에서 30초 동안 3번 초음파 처리합니다. 원심분리기 는 4C.에서 100, 000 x g에서 30 분 동안 샘플을 원심 분리하고 새로운 1.5 ml 미리 냉각 된 미세 센심 분리기 튜브에서 상체를 수집합니다. 튜브를 용해성 단백질 분획에 대한 S"로 표시한 후 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.얼음 차가운 SEM 버퍼400 l에서 이전 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다. 재중단 된 펠릿 100 l을 새로운 1.5 ml 미리 냉각 된 미세 원심 분리 튜브로 옮춥니다. 튜브를 SMP로 라벨을 부착하여 입자 분획을 제출하고 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.나머지 300l의 재질펠릿을 1배, 갓 준비한 200mMM 나트륨 탄산나트륨으로 희석시키십시오. 그리고 30 분 동안 얼음에 희석 된 샘플을 배양. 그런 다음, 원심 분리는 4C.에서 100, 000 x g에서 30 분 동안 샘플을 새로운 1.5 ml 미리 냉각 된 미세 원심 분리기 튜브로 수집합니다.탄산염 상수 분획에 대한 CS"로 샘플을 라벨, 얼음에 튜브를 유지. 얼음 차가운 SEM 버퍼400 l에서 이전 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 탄산염 침전 분획에 대한 CP"로 샘플을 이름.삼중염산으로 모든 샘플을 10%의 최종 농도로 침전시키고 10분 동안 얼음에 튜브를 배양합니다. 이어서, 4C.에서 12, 000 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리한 후, 샘플 버퍼의 각 펠릿을 재연한다. 샘플 버퍼가 노란색이 되면 파란색으로 바뀔 때까지 1~5l의 M Tris 베이스를 추가합니다.SDS-PAGE와 웨스턴 블롯에 의해 추가 분석될 때까지 모든 튜브에 200mM PMSF 1l을 추가하고 80C에 저장합니다. 조미토콘드리아 분획은 자당 밀도 그라데이션 원심분리에 정제되었고, 다른 세포 오염물질의 감소가 관찰되었다. 미토콘드리아는 골레에서 막간 공간 단백질 사이토크롬 b2의 실종에 의해 미토콘드리아를 모니터링하였다.상수에 수반되는 모습. 상기 단백질Ae K는 막 간 단백질 Sco1의 분해를 삼투성 쇼크에 의한 외부 막 중단으로 인해 관찰하였다. 외부 미토콘드리아 멤브레인 무결성은 펠릿 분획에서 단백질Ae K 분해에 대한 시토크롬 b2 및 스코1의 보호에 의해 확인되었다.유사하게, 매트릭스 수용성 단백질 KGD의 보호는 내부 미토콘드리아 막 무결성을 확인하였다. Prx1 웨스턴 블롯 프로파일은 막 간 공간과 매트릭스에서 이중 미토콘드리아 국소화를 제안했습니다. 미토콘드리아는 막 단백질의 토폴로지를 조사하기 위해 초음파 처리 및 탄산염 추출을 실시하였다.부어 지는 일체형 멤브레인 단백질은 펠릿 분획에 남아 있었다. KGD는 상류분획에서 검출되었다. 펠릿에서 KGD 단백질의 검출은 중소기업의 형성에 영향을 미치는 초음파 처리 파라미터 변이 때문이었다.탄산나트륨 처리 후, KGD및 SMP 분획은 용해화되어 상류분획에서 발견되었다. Prx1 웨스턴 블롯 프로파일은 막 주변과의 연관성을 제안했습니다. 제출된 분별 프로토콜의 성공을 위해, 샘플에 PMSF를 추가하여 저근증 부종 후 단백질활성을 중지하는 것이 중요하다.사이트는 제출 단백질 현지화에 대한 정보를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 미토콘드리아 서브구획의 proteomic 연구 도중 근본적인 미토콘드리아 준비의 무결성을 확인하는 것을 이용될 수 있습니다.

assessment-submitochondrial-protein-localization-budding-yeast

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

GFP - 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle - GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

이 기사는 단백질 분해에 대한 유전적 요구 사항을 결정하기 위한 효모 성장 기반 분석에 대해 설명합니다. 또한 효모 단백질을 신속하게 추출하는 방법을 보여주며, 이는 분해 요구 사항을 생화학적으로 확인하기 위한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 적합합니다. 이러한 기술은 다양한 단백질의 분해를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

미토콘드리아 접촉 부위는 미토콘드리아 내막 및 외막 단백질과 상호 작용하는 단백질 복합체입니다. 이 부위는 미토콘드리아 막과 세포질과 미토콘드리아 기질 사이의 통신에 필수적입니다. 여기에서는 이 특정 종류의 단백질에 적합한 후보를 식별하는 방법을 설명합니다.

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

분열 효모인 Schizosaccharomyces pombe 는 미토콘드리아를 연구하기 위한 매력적인 모델로 부상하고 있습니다. 여기에서는 S. pombe에서 미토콘드리아 호흡 복합체의 풍부함과 조립을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 미토콘드리아 호흡 사슬에서 보존된 유전자의 새로운 기능을 특성화할 수 있습니다.

핵분열 효모 schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리 분석

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

배우세요 효소 단백질의 미토콘드리아 내 위치를 결정하는 방법을 Saccharomyces cerevisiae에서. 이 프로토콜은 단백질 기능 연구에 필수적인 도구입니다.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

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