Name: 체외에서 심장 허혈/재관류를 모방하기 위한 세포 공동 배양 모델 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 배우세요 심근세포와 내피세포의 공동 배양 모델을 활용한 심장 허혈/재관류 손상 연구 방법. 세포 간 거리 최적화를 통해 내피세포의 보호 효과를 평가하는 체외 실험 기법을 확인하세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 부분적으로 미국 재향 군인 사무국 생물 의학 실험실 R & D 서비스 (I01 BX003482)와 M.L.R.에 대한 기관 기금에 의해 지원되었습니다.

1. 실험 준비/도금
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 CM 및 EC를 유지 관리합니다.<ol>
<li>두 세포주가 공급 업체에서 도착하면 해동하십시오. 신선한 배지로 세척 한 후 T25 플라스크에 접시를 넣으십시오. 세포를 구입 한 동일한 공급 업체로부터 각 세포 배양 배지를 구입하는 것이 좋습니다. 다음날 배지로 세포를 새로 고치고 합류 할 때 사용하십시오.</li>
		<li>세포 배양 인큐베이터를 21% O2, 5% CO2, 74%N2로 37°C에서 유지하고 가습된 상태로 유지한다. 참고: 이 프로토콜에 사용된 마우스 일차 관상동맥 내피 세포는 C57BL/6 마우스의 관상동맥으로부터 분리되고, 성인 마우스 심근세포는 성인 C57BL/6J 마우스 심장으로부터 분리되고 상업적으로 수득된다( 표 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>멸균 조건 하에서 플레이트 CM을 24웰 플레이트(열등층)의 바닥에 놓습니다. 24시간 후, 플레이트 ECs를 공동배양 웰의 삽입물(또는 우수한 부분) 내로 넣는다. EC 도금 후 24시간 후, EC 삽입물을 CM 플레이트 베이스 상에 놓고, 공동 배양 기간을 시작한다. 사용 전에 세포를 적어도 12-24 시간 동안 공동 배양하도록 허용하십시오. 이러한 단계는 아래에 자세히 설명되어 있습니다.<ol>
<li>광학 현미경으로 CM 세포주 합류도를 추정한다. 세포가 배양 플라스크에서 90%-100% 합류하는 것으로 보이면, 실험 플레이팅을 진행한다.</li>
		<li>합류성 세포 배양물을 함유하는 플라스크에서 배지를 제거하고 T25 플라스크용 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 3-5 mL로 트립신화한다. 플라스크를 부드럽게 교반하고, 37°C에서 2-5분 동안 인큐베이션한 다음, 광학 현미경 하에서 효소 진행을 평가한다. 세포가 둥글기 시작하면 셀 스크레이퍼를 사용하여 표면에서 세포를 분리하십시오.</li>
		<li>분리 후, 트립신/세포 용액을 T25 플라스크용 배지 10mL가 들어있는 50mL 튜브에 첨가하여 트립신 용액을 불활성화시킨다. 세포 현탁액을 120 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 연질 세포 펠릿을 얻었다. 상청액을 제거하고 펠렛을 5 mL의 배지에 재현탁시켰다.</li>
		<li>세포 계수를 수행하고 세포 생존율을 확인하려면 재현탁 세포 10μL의 분취량과 10μL의 트리판 블루 염료를 혼합한다. 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포를 계산하십시오. 원하는 파종 밀도를 얻기 위해 세포를 신선한 일반 배지로 희석하십시오. 부피는 원하는 종자 밀도 및 원액의 세포 농도에 따라 계산됩니다. 모든 도금은 멸균 조건에서 수행되어야합니다.</li>
		<li>웰당 300,000의 시딩 밀도에서 세포외 매트릭스로 사전 코팅된 24웰 플레이트의 바닥에 플레이트 CM을 시딩합니다. 세포를21% O2 및 5%CO2로 하룻밤 동안 37°C에서 유지시킨다.</li>
		<li>24시간 후, EC를 인서트당 100,000의 최적 도금 밀도(배양 면적은 33.6mm2)로 인서트에 플레이트합니다(그림 1). EC 도금 24시간 후, EC 삽입물을 CM 웰 내부에 배치하여 공동 배양을 시작합니다. 실험을 수행하기 전에 세포를 12-24 h 동안 공동 배양하도록 허용하십시오.</li>
		<li>실험이 수행될 때까지 CM과 EC가 모두 80%-90%의 합류율에 도달했는지 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 저산소증/재산소화로 허혈/재관류 손상을 체외에서 시뮬레이션하기 위한
참고: 다음 단계는 설명된 대로 수행해야 하며 중간에 일시 중지하지 마십시오.
<ol><li>50 mL 원뿔형 튜브에 ~25 mL의 배지를 부어 저산소 배지를 제조하였다. 실리콘 멤브레인으로 상단을 공기 밀봉하고 멸균 된 피펫을 사용하여 구멍을 뚫습니다. 다른 구멍을 만들면 이번에는 피펫이 미디어에 약 2/3 정도 잠겨 있습니다.</li>
	<li>매체를 저산소 가스(0.0125% O2, 5%CO2, 94.99%N2)로 30L/min의 유속으로 5분 동안 플러시합니다. 이것은 저산소증이 시작될 때 매체에 용해된O2를 최소화한다(단계 2.5).</li>
	<li>부착된 세포를 함유하는 24-웰 플레이트 또는 배양 인서트의 배지를 버리고 10% 인산염 완충 식염수(PBS)의 100μL/웰로 매우 부드럽게 세척한다. 그 후, 새로 준비된 저산소 배지 500 μL를 플레이트 또는 인서트의 각 웰에 첨가한다. 참고: 배지의 저산소증은 2.5단계에서 세포와 배지에 대한 진정한 저산소증이 시작되기 전에 이 단계에서 가능한 한 잠깐 중단됩니다.<ol>
<li>normoxic 대조군에서는 원래의 배지를 포도당과 혈청을 함유 한 신선한 정상 배지로 교체하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>챔버 내에 멸균수로 채워진 페트리 접시를 배치하여 저산소증 챔버를 가습하십시오. 다음으로, 저산소 그룹을 포함하는 플레이트를 챔버 내로 놓는다.</li>
	<li>저산소증 챔버를 저산소 가스 (0.0125% O2, 5%CO2, 94.99%N2)로 30 L/min의 흐름에서 5분 동안 플러시하십시오. 챔버를 24시간 동안 37°C 인큐베이터에 놓는다.</li>
	<li>저산소증 후 정상적인 조건에서 CM과 EC를 배양하십시오. 이렇게하려면 플레이트 / 인서트의 오래된 배지를 버리고 일반 배지 (포도당 및 혈청 함유; 각 웰 / 인서트의 500 μL)로 교체하고 재관류를 모방하기 위해 2 시간 동안 정상 배양 조건 (21 % O2, 5 %CO2, 74 %N2, 37 °C)하에 인큐베이터에 보관하십시오.</li>
	<li>배지 대체의 효과를 조절하려면 저산소 배지가 변경되는 것과 동시에 노목산 세포의 배지를 변경하십시오. 참고: 그림 2 에서는 이 프로토콜에 대한 개략적인 개요를 제공합니다.</li>
</ol>3. 엔드포인트 평가
<ol><li>세포 배양 배지를 24-웰 플레이트로부터 96-웰 플레이트로 옮긴다. 24-웰 플레이트의 각 웰로부터 200 μL의 배지를 사용하고, 그에 따라 96-웰 플레이트의 네 웰에 균등하게 분배한다. 노목시아 대 저산소증 대 HR에 대해 각각 하나의 플레이트를 사용하십시오.</li>
	<li>세포 손상의 정도를 결정, 예를 들어, 제조자의 지시에 따라 세포독성 분석 키트를 사용하여 LDH에 대한 흡광도를 측정한다. 분석 프로토콜에 지시된 대로 96-웰 플레이트에서 검정을 수행한다.</li>
</ol>4. 통계
<ol><li>파라메트릭 데이터를 평균/표준 편차로 표시하고 비모수 데이터를 중앙값/사분위수 범위의 상자 플롯으로 표시합니다. 유형 1 오류의 가능성을 줄이기 위해 허용되는 사후 테스트를 사용하여 적절한 파라메트릭 대 비모수 다중 비교 테스트를 수행해야 합니다. 유의성은 일반적으로 0.05의 알파(두 꼬리)로 설정됩니다.</li>
	<li>현재 연구에서 수행 된 모든 실험에 대해 하나의 실험 내에서 적어도 세 번의 웰 반복실험을 수행하십시오. 통계 분석에 사용된 각 실험의 반복은 서너 번이었다.</li>
</ol>

<ol><li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury%3A+a+30+year+voyage+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).</li>
<li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+a+neglected+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+pathways+in+acute+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li>
<li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell-cell+communication+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li>
<li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Research+%26+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639(2020).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li>
<li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li>
<li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li>
<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711(2012).</li>
<li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+a+focus+on+compartmentalized+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li>
<li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

프로토콜의 중요한 단계 세포 공동 배양 모델은 심장 보호의 세포 메커니즘을 연구하기 위해 사용되어 왔습니다. 따라서 두 개의 서로 의미있는 거리를 가진 두 개의 개별 레이어를 만드는 방법은 적절한 공동 문화 모델을 개발하는 데 중요합니다. 시뮬레이션 된 IR, 즉 HR을 연구 할 때의 도전은 허혈 (저산소증) 자체뿐만 아니라 재관류 (재 산소화)가 세포 기능 장애를 악화시킨다는 것입니다. 따라서 현실적인 모델은 예를 들어 저산소증만과는 달리 저산소증에 따른 재산소화에 의한 부상이 충분히 증가했음을 입증함으로써 이러한 특성을 반영해야하지만 세포 보호 약물 또는 우리의 경우 EC의 존재와 같은 전략으로 부상의 감쇠를 허용해야합니다. 흥미롭게도, 두 세포층 사이의 거리는 적합한 공동배양 모델을 개발하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 우리는 EC와 CM 사이의 1.0mm와 2.0mm 거리가 예상되는 HR 손상 반응을 허용한다는 것을 입증 할 수 있었지만, 더 중요한 것은 2.0mm만이 저산소 ...

허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다 1,2. 그러나 재관류의 치료 과정 자체가 심근 허혈 / 재관류 (IR) 손상으로 알려진 심근 세포 사망을 유발할 수 있으며 여전히 효과적인 치료법이 없습니다3. 내피 세포 (ECs)는 파라크린 신호의 분비뿐만 아니라 세포 간 상호 작용을 통해 심근 세포 (CMs)를 보호하기 위해 제안되었습니다4.
세포 공동 배양 모델은 세포 기능 및 분화에 대한 자가분비 및/또는 파라크린 세포-세포 상호작용의 역할을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 공동 배양 모델 중에서, 혼합 공동 배양은 가장 간단하며, 여기서 두 가지 유형의 세포가 원하는 세포 비율5로 단일 배양 구획 내에서 직접 접촉합니다. 그러나, 세포 유형 사이의 분리된 처리와 단일 세포 유형의 하류 분석은 혼합 집단을 고려할 때 쉽게 실현 가능하지 않다.
이전의 연구에 따르면 저산소 및 허혈성 모욕은 젖산 탈수소 효소 (LDH)의 방출에 의해 측정 된 세포막의 완전성에 심각한 손상을 일으킨다. 이 부상은 재관류 손상6,7,8을 모방하여 재산소화시 악화됩니다. 현재 프로토콜의 목표는 EC의 존재가 저산소증 및 재산소화 (HR)로 인한 CM의 세포막 누출을 용량 의존적으로 감쇠시킬 수 있고 두 세포주 간의 접촉 거리를 변화시킴으로써 EC의 보호 효과를 최적화 할 수 있다는 가설을 테스트하는 것이 었습니다. 따라서 우리는 세 가지 유형의 세포 배양 삽입물과 마우스 일차 관상 동맥 내피 세포 및 성인 마우스 심근 세포를 사용했습니다. Corning, Merck Millipore 및 Greiner Bio-One이 브랜드 한 인서트를 통해 세포주 간 거리가 각각 0.5, 1.0 및 2.0mm인 세 가지 세포 배양 누화 조건을 만들 수있었습니다. 각 경우에 인서트당 100,000개의 EC를 도금하였다.
또한, 공동 배양에서 EC의 밀도가 이 모델에서 HR 손상 감쇠에 기여하는지 여부를 결정하기 위해, CMs에 의한 EC 농도와 LDH 방출 사이의 용량-반응 관계를 연구하였다. ECs는 2.0 mm 인서트에서 인서트당 각각 25,000, 50,000 및 100,000으로 플레이팅되었다.
이 보고서는 조사관이이 중요한 모델을 유리하게 사용할 수있는 단계별 접근 방식을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>성인 마우스 심근 세포 (CM)</td><td>Celprogen Inc</td><td>11041-14</td><td>성인 C57BL / 6J 마우스 심장 조직에서 분리</td></tr><tr><td>Automated Cell Counter Countess II</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td>세포 수 계산을위한 세포 계수</td></tr><tr><td>Bio-Safety Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>NU425400</td><td>Cell culture sterile hood</td></tr><tr><td>Cell Culture Freezing Medium</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6916</td><td>장기 세포주 저장을 위한 세포 동결에 사용</td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>Nuaire</td><td>Nu-5500</td><td>정상적인 세포 생활 조건(21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&deg; C, 가습)</td></tr> <tr><td>세포 배양 인큐베이터 가스 탱크</td><td>A-L 압축 가스</td><td>UN1013</td><td>세포 배양 인큐베이터에 필요한 가스&nbsp;</td></tr><tr><td>세포 배양 인서트 A(0.5mm)</td><td>Corning Inc</td><td>353095</td><td>EC-CM 공동 배양</td></tr><tr><td>세포 배양 인서트 B(1.0mm)</td><td>에 사용되는 밀리셀 밀리포어</td><td>PIHP01250</td><td>EC-CM 공동 배양</td></tr><tr><td>세포 배양 인서트 C(2.0mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662640</td><td>EC-CM 공동 배양</td></tr><tr><td>원심분리기</td>에 사용 <td>Anstel Enterprises Inc</td><td>4235</td><td>세포 배양 도금 및 파시징용</td></tr><tr><td>CMs 세포 배양 플라스크 T25</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14</td><td>CM 일반 배양에 사용, 제조업체 코팅</td></tr><tr><td>CMs 세포 배양 배지 Complete</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14S</td><td>CMs 배양</td></tr><tr><td>배지 완전한 페놀 프리</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14PN</td><td>LDH 측정 중 사용되는 페놀 레드가 없는 CM</td></tr> 배양 <tr><td>배지 CMs 세포 배양 플레이트 96 well</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14-96well</td><td>LDH 측정 실험에 사용되며 제조업체</td></tr><tr><td>CMs 저산소증 세포 배양 매체</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14GFPN</td><td>저산소 상태에서 CMs 세포 배양 (포도당 및 무혈청)</td></tr> <tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>세포 계수기에 사용되는</td></tr><tr><td>계수 슬라이드 Cyquant LDH 세포 독성 키트</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td>C20301</td><td>LDH 측정 키트</td></tr><tr><td>ECs 세포 배양 플라스크 T25</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB012935</td><td>ECs 일반 배양</td></tr><tr><td>ECs 세포 배양 배지</td>에 사용됨 Complete <td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168</td><td>ECs 배양 완료 배지</td></tr><tr><td>ECs 세포 배양 배지 완전한 페놀 프리</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168PF</td><td>LDH 측정 중에 사용되는 페놀이 없는 ECS</td></tr><tr><td>배양 배지 ECs 세포 배양 플레이트 96 well</td><td>Fisher Scientific (Costar)</td><td>3370</td><td>LDH 실험에 사용됨 측정</td></tr><tr><td>ECs 배양 젤라틴 기반 코팅 용액</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6950</td><td></td></tr><tr><td>ECs ECs 저산소증 세포 배양 매체</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>GPF1168</td><td>저산소 상태(포도당 및 무혈청)에서 ECs 세포 배양</td></tr> 플라스크 및 플레이트 코팅에 사용됨 소 <tr><td>태아 혈청(FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35011CV</td><td>FBS-HI USDA 세포 배양 및 유지 관리 승인</td></tr><tr><td>저산소증 챔버</td><td>StemCell Technologies</td><td>27310</td><td>0.01 % O 2 환경에서 저산소 상태를 만들려면</td></tr> 저<tr><td>산소증 챔버 유량계</td><td>StemCell Technologies</td><td>27311</td><td>일관된 가스 흐름 속도를 위해 저산소 가스 탱크와 연결</td></tr><tr><td>저산소 가스 탱크 (0.01 % O 2 실린더)</td> <td>AL 압축 가스</td><td>UN1956</td><td>저산소 매체 및 챔버 (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)를 플러시하는 데 사용됩니다</td></tr>. 현미경<tr><td>&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>세포 상태를 관찰하기 위해</td></tr><tr><td>마우스 원발성 관상 동맥 내피 세포(ECs)</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>C57-6093</td><td>C57BL/6 마우스의 관상 동맥에서 분리</td></tr><tr><td>NUNC 15ML CONICL 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td>세포 배양 공정, 실험, 용액 준비 등을 위해</td></tr><tr><td>NUNC 50ML CONICL 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td>세포 배양 공정, 실험, 용액 준비 등에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>배양 또는 실험 중 세포 세척에 사용</td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>BioTek 기기</td><td>11120533</td><td>색 또는 형광 플레이트 판독</td></tr><tr><td>반응 96 웰 팔테(뚜껑 없음)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565226</td><td>CMS</td></tr><tr><td>용 트립신/EDTA</td> LDH 측정 플레이트 판독에 사용 <td>Celprogen Inc</td><td>T1509-014</td><td>1 x 멸균 여과 및 조직 배양 테스트</td></tr><tr>ECs <td>Cell Biologics Inc</td><td>6914/0619</td><td>0.25%</td><td>에 대한 트립신/EDTA</td> 테스트</tr></tbody></table>

체외에서 심장 허혈/재관류를 모방하기 위한 세포 공동 배양 모델 개발

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 재관류는 허혈을 넘어 추가적인 부상을 일으킨다. 내피 세포 (ECs)는 세포 - 세포 상호 작용을 통해 재관류 손상으로부터 심근 세포 (CM)를 보호 할 수 있습니다. 공동 배양은 세포 - 세포 상호 작용의 역할을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 혼합 공동 배양은 가장 간단한 접근법이지만 단리 처리 및 단일 세포 유형의 하류 분석이 가능하지 않기 때문에 제한됩니다. ECs가 용량 의존적으로 CM 세포 손상을 감쇠시킬 수 있는지 여부와 두 세포주 사이의 접촉 거리를 변화시킴으로써 이러한 보호가 더욱 최적화될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 마우스 일차 관상동맥 내피 세포와 성인 마우스 심근세포를 사용하여 0.5에서 세포간 층간 거리가 변화한 세 가지 유형의 세포 배양 삽입물을 테스트했습니다. 각각 1.0 및 2.0 mm. CMs-전용에서, 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 방출에 의해 평가된 바와 같은 세포 손상은 저산소증 동안 그리고 거리가 0.5 및 1.0 mm에 비해 2.0 mm일 때 재산소화 시에 유의하게 증가하였다. EC와 CM이 거의 직접 접촉했을 때 (0.5mm), 저산소증에 따른 CM의 재 산소 부상의 경미한 감쇠 만있었습니다. 공간 거리가 1.0mm일 때 이러한 감쇠가 크게 증가하였다. 2.0mm 거리에서, ECs는 저산소증과 저산소증/재산소화 둘 동안 CM 손상을 감쇠시켰으며, 이는 EC가 CM과 교차하는 데 충분한 배양 거리두기가 필요함을 나타내므로, 분비된 신호 분자가 순환하고 보호 경로를 완전히 자극할 수 있다. 우리의 연구 결과는 시뮬레이션 된 허혈 / 재관류 손상에 대한 CM 보호에서 EC의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공하기 위해 EC / CM 공동 배양 공간 환경을 최적화하는 것이 필요하다는 것을 처음으로 시사합니다. 이 보고서의 목표는 조사관이이 중요한 모델을 유리하게 사용할 수있는 단계별 접근 방식을 제공하는 것입니다.

이 실험에 사용된 세 가지 유형의 삽입물(A, B, C)은 모두 0.4 μm의 동일한 기공 크기를 갖는다. 이들 사이의 유일한 차이점은 인서트-베이스 높이인데, 이는 두 공동 배양된 세포층 사이의 거리가 각각 0.5, 1.0 및 2.0mm가 되도록 허용하고(그림 3), 서로 다른 공급업체에서 온 것이라는 점입니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
IR 손상을 시뮬레이션하기 위해 HR을 겪는 두 세포주의 분리된 층과 함께 시험관내 공동 배양 모델을 확립하기 위해, ECs의 유무에 관계없이 공동 배양된 CMs의 세포막 무결성을 조사하였다. CM 층 위의 다양한 거리에 배치 할 수있는 EC에 대한 별도의 삽입물을 활용함으로써 CM의 막 손상의 심각성에 대한 세포층 거리의 차등 효과를 평가할 수있었습니다. 별도의 실험 세트에서 우리는 EC의 밀도와 EC와 CM의 비율을 다양화했습니다. 또한...

공간 거리는 별도의 내피 및 심근 세포 세포층의 공동 배양 모델에서 저산소증 / 재 산소화 손상을 평가하는 핵심 매개 변수이며, 처음으로 공동 배양 공간 환경을 최적화하여 심근 세포 보호에서 내피 세포의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공 할 필요가 있음을 시사합니다.

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

우리의 발견은 시뮬레이션 허혈 재증식 손상에 대한 심근 세포 보호에서 내피 세포의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공하기 위해 내피 세포 심근 세포 공동 배양 공간 환경을 최적화하는 것이 필요하다는 것을 시사한다. 세포 공동 배양 모델은 세포 기능 및 분화에 대한 세포-세포 상호작용의 역할을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 세포 유형 간의 분리된 처리와 단일 세포 유형의 하류 분석은 혼합 공동 배양에서 쉽게 실현가능하지 않다.현재의 연구는 저산소증 재증식 손상을 유발할 수있는 의미있는 거리를 가진 두 개의 분리 된 세포층을 만들고 단일 세포 유형에 대한 결과와 효과를 연구하는 것을 목표로했습니다. 두 세포주를 모두 해동시켜 준비를 시작한다. 세포를 T25 플라스크에 플레이트한 후 신선한 배지로 세척한다.다음 날에는 배지로 세포를 새로 고치고 합류 할 때 사용하십시오. 세포 배양 배양기를 섭씨 37도에서 21%산소, 5%이산화탄소 및 74%질소로 유지한다. 가습 상태로 유지하십시오.심근세포 세포주 컨플루언시를 광학 현미경으로 추정한다. 합류성 세포 배양물을 함유하는 플라스크로부터 배지를 제거하고, 플라스크 당 삼내지 오밀리리터의 트립신-EDTA로 트립신화한다. 플라스크를 부드럽게 교반하고 섭씨 37도에서 두 분에서 5 분 동안 배양하십시오.그 후, 효소 진행을 광학 현미경으로 평가한다. 분리 후, 트립신 또는 세포 용액을 T25 플라스크 당 10 밀리리터의 배지를 함유하는 50 밀리리터 튜브에 첨가하여 트립신 용액을 불활성화시킨다. 세포 현탁액을 120 x g에서 2분 동안 원심분리하여 연질 세포 펠렛을 얻었다.원심분리 후, 상청액을 제거하고 펠렛을 다섯 밀리리터의 배지에 재현탁시킨다. 다음으로, 세포 계수를 수행하고 세포 생존율을 확인하십시오. 재현탁된 세포 10 마이크로리터와 트리판 블루 염료 10 마이크로리터의 분취량을 혼합한 다음, 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포를 계수한다.원하는 파종 밀도를 얻기 위해 세포를 신선한 일반 배지로 희석하십시오. 24-웰 플레이트를 세포외 매트릭스로 프리코트하고 플레이트 심근세포를 플레이트 바닥에 웰 당 300, 000의 시딩 밀도로 취하십시오. 하룻밤 사이에 5 % 이산화탄소로 세포를 섭씨 37도에서 유지하십시오.24시간 후, 플레이트 내피 세포를 인서트 당 100, 000의 최적 도금 밀도로 인서트에 넣는다. 내피 세포 플레이팅의 24시간 후에, 심근세포 웰 내부에 내피 세포 삽입물을 놓고 공동 배양을 개시한다. 실험을 수행하기 전에 세포를 12 내지 24시간 동안 공동배양하도록 허용한다.50 밀리리터 원뿔형 튜브에 약 25 밀리리터의 매체를 부어 저산소 매체를 준비하십시오. 공기 밀봉은 실리콘 멤브레인으로 상단을 밀봉하고 멸균 된 피펫을 사용하여 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 다른 구멍을 만들고 피펫의 약 2/3을 미디어에 잠깁니다.배지를 분당 30리터의 유속으로 5분 동안 저산소 가스로 플러시한 다음, 부착된 세포가 포함된 24웰 플레이트 또는 배양 인서트의 배지를 버린다. 웰 당 10 % PBS의 100 마이크로 리터로 매우 부드럽게 씻고 새로 준비된 저산소 배지 500 마이크로 리터를 플레이트 또는 인서트의 각 웰에 추가하십시오. 원래의 배지를 노목산 대조군에서 포도당과 혈청을 함유하는 신선한 정상 배지로 대체하십시오.멸균 된 물로 채워진 페트리 접시를 저산소증 챔버에 넣어 챔버를 가습하십시오. 그런 다음 저산소 그룹을 포함하는 플레이트를 챔버에 넣으십시오. 저산소증 챔버를 저산소 가스로 분당 30 리터의 흐름으로 5 분 동안 플러시하십시오.그 후, 챔버를 섭씨 37도의 인큐베이터 안에 24 시간 동안 두십시오. 저산소증 후, 플레이트 또는 인서트의 오래된 배지를 버리고 포도당과 혈청이 포함 된 정상 배지 500 마이크로 리터를 플레이트의 각 벽에 첨가 한 다음 플레이트를 재관류를 모방하기 위해 두 시간 동안 정상 배양 조건 하에서 배양기 내부에 보관하십시오. 세포 배양 배지를 24-웰 플레이트에서 96-웰 플레이트로 옮긴 다음, 24-웰 플레이트의 각 웰에서 200 마이크로리터의 배지를 취하여 96-웰 플레이트의 네 웰에 균등하게 분배한다.96-웰 플레이트의 세포독성 분석 키트를 사용하여 LDH에 대한 흡광도를 측정하고 제조업체의 지침에 따라 세포 손상 정도를 확인합니다. 이 연구에서는 세 가지 유형의 삽입물을 평가했습니다. 세 인서트 모두 0.4 마이크로미터의 동일한 기공 크기를 가졌다.그들 사이의 유일한 차이점은 두 개의 공동 배양 된 세포층 사이의 거리가 0.5, 1.0 및 2.0 밀리미터가되도록 허용했다. 이 프로토콜을 사용하여, 세포를 정상 산소 조건 하에서 배양한 다음, 노목성 대조군과 저산소증 그룹의 두 그룹으로 나눴다. 24시간 후, 두 그룹 모두 배지로 상쾌하고 종점 분석을 수행하기 전에 또 다른 두 시간 동안 정상 산소 조건하에서 배양하였다.심근세포 단독, 내피 세포 단독, 심근세포와 내피 세포의 공동 배양에 대한 젖산 탈수소효소 방출을 평가하는 세 가지 유형의 배양 삽입물의 비교는 노르녹시, 저산소증만, 저산소증 재산소화 조건 하에서 여기에 제시된다. 세포층 사이의 0.5 밀리미터 거리에서, 저산소증은 심근 세포가 단독으로 배양되었을 때 노르 목시아에 비해 LDH 방출을 유의하게 증가시켰다. 그러나, LDH는 저산소증 전용 그룹에 비해 저산소화 그룹에서 단지 약간 증가하였다.내피 세포와 심근 세포가 함께 공동 배양되었을 때, 저산소증 전용 조건 하에서의 LDH 방출의 증가는 감쇠되지 않았다. 이는 내피 세포가 저산소증 전용 조건하에서 심근세포 단독군에 비해 어떠한 보호 효과도 갖지 않았음을 나타낸다. 그러나, 내피 세포는 HR 동안 심근세포에 경미하지만 유의한 보호를 발휘했다. 세포층 사이의 거리가 한 밀리미터였을 때, LDH 방출은 또한 저산소증 전용 조건 하에서만 심근세포에서 유의하게 증가하였다.그러나, 0.5 밀리미터 삽입물에서와 달리, 심근세포의 LDH 증가는 저산소증 전용 조건에 걸쳐 HR에 의해서만 강화되었다. 이 증가는 두 밀리미터 인서트로 더욱 두드러졌습니다. 2밀리미터 인서트에 플레이팅된 내피 세포의 농도를 인서트 당 각각 25, 000, 50, 000 및 100, 000 세포로 적정하였다.공동 배양물에서 내피 세포 강도의 증가가 HR에 의한 LDH 방출의 용량 의존적 감쇠를 유도한다는 것이 발견되었다. 그러나 규범 적 조건 하에서는 그러한 효과가 나타나지 않았습니다. 이러한 공동-배양 방법론은 내피 세포 및 심근세포에 한정되지 않는다. 이러한 방법은 관심의 여러 기관에 걸쳐 다양한 세포주 사이의 특정 세포 - 세포 상호 작용의 조사를 원조해야한다.

development-cell-co-culture-model-to-mimic-cardiac

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

이 프로토콜은 전임상 약물 검사를 위해 인간의 심장 조각을 단면화 및 배양하는 절차를 설명하고 이러한 조각에서 동시에 세포간 전압 및 세포내 칼슘 신호를 기록하기 위한 광학 매핑의 사용을 자세히 설명합니다.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

인간 유도만능 줄기세포로부터 유래된 심근세포를 이용한 허혈성 심장질환 모델을 제시하고, 허혈에 의한 조직 손상의 정량적 평가를 위한 방법을 제시한다. 이 모델은 약물 검진및 허혈성 심장 질환에 대한 추가 연구를위한 유용한 플랫폼을 제공 할 수 있습니다.

허혈성 심장 질환 및 심장 근막 수축의 비디오 기반 비교 모델

여기서, 우리는 높은 수율과 재현성을 가진 배아 피질에서 뉴런 및 성상세포 농축 배양, 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있는 특정 배양 매체를 사용하여 간단한 접근법을 제시합니다.

이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

심근 보호에 저체온증의 다른 정도의 뚜렷한 영향은 철저하게 평가되지 않았습니다. 본 연구의 목표는 인간 심근세포 기반 모델에서 다른 저체온증 치료에 따른 세포 사멸 의 수준을 정량화하여 미래의 심층 분자 연구의 토대를 마련하는 것이었습니다.

인간 심장 근세포 모델에서 저체온증-사전 조절 에 따른 심근 보호의 체외 평가

이 프로토콜은 매달려 방울에 세포를 공동 배양하여 3D 심장 스페로이드 (CSs)를 제조하는 것을 목표로합니다. 콜라겐 임베디드 CS는 심부전을 모델링하기 위해 생리적 농도에서 독소루비신(DOX, 심독성 제) 으로 치료됩니다. DOX 처리된 CS를 사용하여 시험에서 시험은 심부전 환자를 위한 새로운 치료를 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다.

인간 심장 병리학을 연구하기 위하여 체외 생체 공학심장 조직에서와 같이 심장 스페로이드

이 프로토콜의 목표는 심장 조직 공학, 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위해 심장 섬유아세포(CFs)와 공동 배양된 줄기 세포 유래 심근세포(CFs)로 구성된 고도로 정렬된 인간 심장 조직의 3차원(3D) 미세유체 모델의 개발을 설명하고 시연하는 것이다.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

이 논문은 I/R 개발 및 치료를 더 잘 이해하기 위해 척추 바늘 사용자 지정 후크를 사용하여 3 일 간의 병아리 배아에서 허혈 재관류 (I/R) 모델링을 설명합니다. 이 모델은 간단하고 빠르며 저렴합니다.

3일간의 병아리 배아를 이용한 후크 허혈-재관류 모델의 생성

줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 생체 공학적으로 설계된 3차원 심장 조직은 건강한 심근과 병든 인간 심근 을 체외 에서 연구하는 동시에 천연 심장 틈새 시장의 주요 측면을 요약하기 위한 유망한 모델로 부상했습니다. 이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포에서 생성된 high-content engineered 심장 조직을 제작하고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계

본 연구는 생존 사례의 경우 좌측 미니 흉곽 절개술 또는 비생존 사례의 경우 정중선 흉골 절개술을 사용하여 토끼의 급성 국소 심근 허혈 및 재관류 손상의 재현성이 높은 동물 모델을 보여줍니다.

토끼의 허혈 및 재관류 손상 모델

자가 조립식 인간 심장 오가노이드(hCOs)는 인간 심장 발달과 질병을 모델링하기 위한 신흥 시스템입니다. 여기서는 저산소 재산소화를 통한 hCO의 생성 및 손상 방법론과 손상 후 예상되는 조직학적 및 기능적 결과에 대한 세부 정보를 제공합니다.

자가 조립 인간 심장 세포에서의 저산소증-재산소화 손상 모델

배우세요 심근세포와 내피세포의 공동 배양 모델을 활용한 심장 허혈/재관류 손상 연구 방법. 세포 간 거리 최적화를 통해 내피세포의 보호 효과를 평가하는 체외 실험 기법을 확인하세요.

체외에서 심장 허혈/재관류를 모방하기 위한 세포 공동 배양 모델 개발

더 많은 동영상 탐색