Name: 재발성 유산에 있는 4개의 자궁내막 면역 세포 모형의 멀티플렉스 형광 면역히스토화학 염색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: 학습하세요 재발성 유산 연구를 위한 자궁내막 면역 세포 다중 형광 면역조직화학 염색법을. CD3, CD56, CD68, CD20 세포 동시 검출로 생식 건강 메커니즘을 규명합니다.

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이 연구는 2018년 홍콩 산부인과 신탁 기금과 홍콩 보건 의료 연구 기금(06170186, 07180226)에 의해 지원되었습니다.

연구 결과는 홍콩-새로운 영토 동쪽 클러스터 임상 연구 윤리 위원회의 합동 중국 대학에 의해 승인되었습니다. 자궁내막생검을 수집하기 전에 참가자들로부터 통보된 동의를 얻었다. 컨트롤 및 RM 그룹의 포함 기준에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.
1. 샘플 준비
<ol><li>이 연구의 모든 여성이 월경 주기의 9일째부터 매일 소변 딥스틱 검사를 받아야 배란을 검출하기 위해 황체화 호르몬(LH) 서지를 식별하고, LH 서지(LH+7) 다음7일째에 자궁내막생검을 정확하게 검사합니다.</li>
	<li>비옥한 여성과 여성의 Pipelle 샘플러 또는 파이프 큐레를 사용하여 자궁내막 생검의 0.5cm2 단편을 획득하십시오. 참고: 고정의 부피는 조직의 5-10 배여야 합니다.</li>
	<li>용융 파라핀 왁스에 내장하기 전에 조직 처리 기계에 탈수카트리지에 조직을 배치합니다. 58-60°C에서 파라핀에 조직을 포함.</li>
	<li>파라핀 블록을 실온에서 밤새 식힙니다. 마이크로토메를 사용하여 파라핀 블록을 3 μm 두께로 다듬습니다. 참고: 멀티플렉스 염색 을 통해 적절한 조직 마운팅 및 준수에 증류수 보조기구를 사용합니다.</li>
	<li>파라핀 리본을 40-45°C의 수조에 30s에 놓습니다.</li>
	<li>폴리 L-리신 (0.1 % w / v)코팅 현미경 유리 슬라이드에 섹션을 마운트합니다. 조직을 위쪽으로 향하게 하여 슬라이드를 놓고 밤새 37°C에서 건조시합니다. 슬라이드를 극한의 온도에서 멀리 떨어진 슬라이드 상자에 보관하여 추가 사용까지 보관합니다.</li>
</ol>2. 기존의 IHC를 사용하여 멀티플렉스 IHC에 대한 항체의 이상적인 농도를 결정한다.
참고: 이것은 내메트리엄 샘플에서 각 면역 마커의 발현 수준 및 패턴을 식별하고, 각 마커의 염색 서열뿐만 아니라 그들의 관련 티라미드 신호 증폭(TSA) 불소호레 페어링을 결정하는 데 중요하다.
<ol><li>수동 종래의 IHC13을사용하여 멀티플렉스 IHC에 대한 적합성에 대한 항체를 테스트한다.</li>
	<li>단일 항체 테스트를 위해 내측 조직을 사용합니다.</li>
	<li>각 항체의 염색 상태를 최적화하기 위한 양성 제어(예를 들어, 비장) 및 음의 제어(isotype control)를 포함한다.</li>
	<li>항체의 데이터 시트에 의해 권장되는 희석을 사용하여 염색을 수행합니다.</li>
	<li>2.3 단계에서 사용되는 권장 희석 위 및 아래 농도를 사용하여 추가 염색을 수행합니다. 참고: 임상 병리학자는 항체 프로빙 및 세포 무결성의 국소화를 확인하기 위해 얼룩진 슬라이드를 맹목적으로 평가해야합니다.</li>
</ol>3. 멀티플렉스 염색 방법
<ol><li>슬라이드 준비 및 고정<ol>
<li>오븐에서 위쪽으로 향하는 조직을 평평하게 놓고 60°C에서 적어도 1시간 동안 굽습니다.</li>
		<li>오븐에서 슬라이드를 제거하고 수직 슬라이드 랙에 배치하기 전에 실온에서 적어도 20 분 동안 냉각 할 수 있습니다.</li>
		<li>자일렌(2배), 100% 에탄올(2배), 95% 에탄올(1배), 에탄올(70% 에탄올(2배), 증류수(2배) 등 각 단계에 10분 할당된 포름린 고정 파라핀 임베디드 슬라이드를 탈밀하고 재수화한다.</li>
		<li>슬라이드 랙을 플라스틱 슬라이드 상자에 놓고 트리스 버퍼식식라인(TBS, pH 7.6)에 담급니다. 참고: 슬라이드는 이 재수화 단계에서 마지막 단계에서 장착할 때까지 촉촉하게 유지되어야 합니다.</li>
		<li>미탄올(1:9)에 희석된 포름알데히드혼합물로 채워진 플라스틱 슬라이드 상자에 슬라이드를 잠수하여 샘플을 30분 동안 수정합니다.</li>
		<li>슬라이드를 2분 동안 탈온된 물에 두 번 씻은 다음 항원 회수로 진행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>에피토프 검색<ol>
<li>슬라이드 랙을 내열 성 상자에 넣고 구연산 버퍼 (pH 6.0)로 채우면 슬라이드를 덮습니다.</li>
		<li>상자를 전자레인지에 넣고 슬라이드를 100% 전원으로 가열한 다음 20분 동안 20분간 가열하여 동일한 온도를 유지합니다.</li>
		<li>실온에서 약 15분 동안 슬라이드를 식힙니다.</li>
		<li>2분 동안 물에 있는 슬라이드를 헹구고 TBS-Tween 20(TBST)이 2분 동안 헹구십시오. 참고: TBST는 25m Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 0.05% Tween 20(v/v)으로 구성됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>블로킹<ol>
<li>10분 동안 과산화제 차단용을 함유한 항아리에 슬라이드를 침수하여 조직 내 내인성 과산화증활성을 차단한다(재료의 표참조).</li>
		<li>TBST로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다.</li>
		<li>소수성 장벽 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주변경계를 표시합니다.</li>
		<li>블로킹 버퍼(재료 표참조) 또는 소 세럼 알부민(5%, w/v)으로 조직 섹션을 덮고 15분 동안 가습된 챔버에서 슬라이드를 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>항체 및 신호 응용 프로그램<ol>
<li>차단 시약을 제거합니다.</li>
		<li>1차 적시 항체(예를 들어, CD3, 1:100 희석항체 희석제, 표 1참조)를 30분 동안 실온에서 가습챔버에서 배양한다.</li>
		<li>1 차적인 항체를 제거합니다. TBST로 3x를 매번 5분 동안 씻으시면 됩니다.</li>
		<li>고분자 고추냉이 과산화효소(HRP)-표지된 이차 항체(표1)를실온에서 가습챔버에서 15분 동안 배양한다. TBST로 3x를 매번 5분 동안 씻으시면 됩니다.</li>
		<li>오팔 플루오로포레 TSA 작업 용액(증폭 희석제 1:100)을 적용하고 1차 항체 결합 부위의 조직 샘플에 형광소 균주를 허용하도록 10분 동안 실온에서 배양한다. TBST로 트리플리케이트로 매번 5분 동안 씻으세요.</li>
	</ol></li>
	<li>전자레인지 기반 스트리핑<ol>
<li>항원 회수 버퍼(구연산 완충액, pH 6.0)로 헹구는다.</li>
		<li>마이크로파 기반 스트리핑을 수행하여 1차 이차-HRP 복합체를 제거하여 다음 1차 항체(예를 들어, CD20)를 소개합니다.</li>
		<li>슬라이드를 항원 검색 버퍼에 넣고 50초 동안 100% 전원으로 전자레인지에 전자레인지를 넣고 전자레인지에서 20분 동안 20%의 전력을 공급하고 실온에서 15분 동안 식힙니다.</li>
		<li>조직 샘플이 모든 1 차 항체로 조사 될 때까지 3.2.4 ~ 3.5.2 단계를 반복하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>카운터스테인 및 마운팅<ol>
<li>항원 검색 버퍼의 전자 레인지 기반 스트리핑 및 냉각 후, 증류수 와 TBST에서 슬라이드를 헹구십시오.</li>
		<li>4', 6-diamidino-2-페닐린돌(DAPI) 용액(1.0 μg/mL)을 실온에서 가습챔버에서 5분 동안 배양한다.</li>
		<li>TBST로 3x를 매번 5분 동안 씻으시면 됩니다. 물로 5분 동안 한 번 씻으시면 됩니다.</li>
		<li>슬라이드를 공기 건조시키고 적절한 장착 매체로 장착합니다(재료 표참조). 참고: 모노플렉스 슬라이드를 스펙트럼 라이브러리 개발에 사용할 때는 카운터스테인링이 필요하지 않습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 이미지 및 분석
<ol><li>스펙트럼 라이브러리 슬라이드 준비<ol>
<li>다중 스펙트럼 이미지 분석을 위해 동일한 제어 조직으로 각 형광, DAPI 및 자동 형광에 대한 라이브러리 슬라이드(단일 얼룩 기준 이미지)를 만듭니다.</li>
		<li>RM 및 비옥한 여성을 가진 여자에게서 자궁내막 생검 견본의 슬라이드를 사용하여, 단계 1.1 에서 3.6.4 각 슬라이드에 대한 단 하나 항체 검출을 위한 단계 1.1 3.6.4를 수행합니다 (추가 항체 또는 불소 호퍼 추가 없이).</li>
		<li>각 항체 검출에 대해, DAPI를 가진 슬라이드 중 하나를 염색하고 (단계 3.6.2에서와 같이) 스펙트럼에서 가능한 조직 자동 형광의 검출을 위해 하나의 슬라이드를 염색하지 않은 상태로 둡니다.</li>
		<li>워크스테이션에서 적절한 필터를 사용하여 각 항체에 대한 이 슬라이드 세트에 대한 이미지를 얻고 이미지 분석 라이브러리에 업로드합니다(4.2단계에서 설명된 대로).</li>
		<li>이미지가 캡처되면 inForm을 스펙트럼 라이브러리 소스로 선택하고 스펙트럼 라이브러리를 작성합니다.</li>
		<li>형광을 사용하되 메뉴에서 얼룩/플루어를 선택합니다.</li>
		<li>얼룩이나 형광을 선택하는 동안 하나 이상의 그룹을 선택하여 선택을 좁히게합니다. 모두를 선택하여 이미지와 호환되는 모든 스펙트럼을 표시합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스펙트럼 이미징 참고: 이미지는 인폼 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 설정된 스펙트럼 라이브러리와 함께 만트라 워크스테이션을 사용하여 캡처되었습니다.<ol>
<li>워크스테이션을 사용하여 표 2(예: DAPI, 형광동체[FITC], CY3, 텍사스 레드 및 CY5)에 제안된 적절한 에피 형광 필터를 사용하여 단일 항체 염색 슬라이드의 이미지를 캡처합니다. 참고: 이 프로토콜에 사용되는 특정 형광에 대한 권장 필터는 표 2에표시됩니다.</li>
		<li>해당 형광 채널의 각 마커를 검사하여 최적의 신호에 적합한 노출 시간을 식별합니다. 참고: 최적 신호는 단일 항체 염색에서 얻은 양성 및 국소화에 대한 참조에 따라 결정된다.</li>
		<li>각 단량제(항체-플루오로포어 조합)에 대한 고정 된 노출 시간을 결정하여 교차 시료 비교를 표준화합니다. 참고: 고정 된 노출의 결정은 관심있는 샘플의 강도에 따라 달라집니다.</li>
		<li>임베디드 자동 초점 알고리즘을 통해 적절한 스캐닝 모드에서 멀티플렉스 스테인드 슬라이드를 스캔합니다. 참고: 설정된 스펙트럼 라이브러리는 다중 스펙트럼 이미지 큐브를 단일 개별 구성 요소(스펙트럼 언믹싱)로 구분하는 데 사용됩니다. 이렇게 하면 관심 있는 모든 마커에 대한 색상 기반 식별이 교육 세션 및 이미지 분석 세션의 다음 두 가지 주요 단계를 사용하여 처리할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미지 분석<ol>
<li>내메트리엄에서 선택된 면역 세포 모형의 세포 계산</li>
		<li>200배 배율 하에서 분석을 위해 최소 10개의 필드를 캡처합니다. 참고: 필드는 선택 없이 전체 섹션을 스캔하여 캡처되었습니다. 이것은 심노메트리움의 모든 세포 성분, 예를 들면, 발광 상피 테두리, 스트로마 및 땀샘의 동시 포획을 보장할 수 있습니다.</li>
		<li>셀을 계산하려면 단계 표시줄의 개체 수 단추를 클릭하여 개체 계산 설정 패널을 표시합니다.</li>
		<li>이미지, 프로세스 영역 또는 조직 영역의 가장자리를 터치하는 개체를 제외하려면 Edge 상자를 터치하는 경우 개체 삭제를 확인합니다.</li>
		<li>조직이 분할된 경우 개체를 찾을 수 있는 조직 범주를 선택합니다. 선택한 조직 범주 외부의 개체를 계산하지 마십시오.</li>
		<li>객체를 식별하려면 원하는 접근 방식을 선택합니다: 개체 기반 또는 픽셀 기반(임계값). 참고: 간단한 임계값의 응용 프로그램이 개체 픽셀을 산출하는 신뢰할 수 있거나 일관된 얼룩의 경우 픽셀 기반(임계값) 접근 방식을 선택해야 합니다. 개체 기반 접근 방식은 일관성이 부족하고 개체 염색의 특이성이 없는 경우 고급 morphometry 기반 접근 방식이 필요한 경우에 권장됩니다.</li>
		<li>원하는 신호 크기 조정선택 : 자동 배율 또는 고정 축척. 참고: 자동 배율을 선택하면 개체 세분화를 수행하기 전에 각 구성 요소 평면이 자동으로 배율을 조정합니다. 고정 스케일 옵션은 더 나은 세분화 성능이 필요하며 얼룩 신호가 일관되고 신뢰할 수 있는 경우에 권장됩니다.</li>
		<li>드롭다운 목록에서 개체 세분화에 대한 기본 구성 요소를 선택합니다.</li>
		<li>기본 구성 요소에 대한 최소 신호 값을 원하는 임계값으로 조정합니다.</li>
		<li>개체의 구멍을 자동으로 채우려면 구멍 채우기를선택합니다.</li>
		<li>다른 객체를 개별 객체로 터치하는 개체를 한 개체대신 개별 개체로 감지하려면 최대 크기(픽셀) 확인란을 선택한 후 분할 분할 확인란을 선택합니다.</li>
		<li>오브젝트의 둥글림에 따라 객체를 제외하려면 둥글림 상자를 확인하고 원하는 최소 원형을 지정합니다.</li>
		<li>혈관을 둘러싼 세포를 포함하여 모든 기질 세포 (CD3-/ CD20-/ CD68-/ CD56−및 DAPI+)를계산합니다.</li>
		<li>T 세포(CD3+와 DAPI+),B 세포(CD20+ 및 DAPI+),대식세포(CD68+ 및 DAPI+),uNK 세포(CD56 + 및 DAPI+)를 포함하여 면역 세포를 별도로 계산합니다.</li>
		<li>각 캡처된 이미지에 대한 총 기질 세포 수에 비해 면역 세포의 백분율로 데이터를 표현하고 최종 세포 수를 모든 필드의 평균으로 보고합니다.</li>
		<li>보기 편집기를 사용하여 결과 데이터 테이블 사후 처리를 볼 수 있습니다. 데이터 카운트 테이블을내보냅니다.</li>
		<li>자궁내막 면역 세포 공간 분포의 정량화</li>
		<li>200x 배율 하에서, 세포-세포 접촉 최대거리(14)로간주되는 0-20 μm 범위에 대한 R-프로그램을 사용하여 L 기능을 추정한다. 참고: R 언어 도구 상자 '스패츠스타트'는 L 기능을 측정하는 데 사용되었습니다.<ol>
<li>L 기능의 곡선 (AUC) 아래 영역에 따라 면역 세포의 다른 쌍의 클러스터링 수준을 나타냅니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없다고 선언합니다.

프로토콜 내의 중요한 단계 멀티플렉스 염색에는 부지런한 최적화가 필요합니다. 구연산 완충및 마이크로파 기술을 사용하여 항원 회수는 완전한 항체 제거를 보장하고 조직의 생존가능성을 유지하기 위해 최적화가 필요합니다. TSA 시약이 항원을 둘러싼 부위에 공유적으로 결합함에 따라, 그들은 잠재적으로 스테릭 방해를 통해 후속 1 차 항체의 결합을 억제 할 수 있습니다 (또한 "우산 효과"라고도 함). 이것은 다중 면역 마커가 단 하나 세포 구획에 거주하고 불소 로피홀 간섭을 일으키는 원인이 될 때 생기는 경향이 있습니다. 효과가 있을지 여부를 확인하기 위해 면역 세포의 국소화에 중복되는 것을 확인하기 위해 모노플렉스 IHC/IF를 사전에 수행하는 것이 중요합니다. 스펙트럼 라이브러리를 생성하기 위해 단일 샘플 염색이 필요하므로 검증된 스펙트럼 라이브러리는 개별 신호의 차별을 용이하게 하여 형광간섭을 더욱 방지할 수 있습니다. 필요한 경우, 1차 항체 농도 및 배양 시간, 불소-항체 페어링, TSA 플...

재발성 유산(RM)은 임신1의24주 전에 2개 이상의 임신을 상실하는 것으로 정의될 수 있다. 이 빈번한 생식 상태는전세계2,3의부부의 1%까지 영향을 미칩니다. 병리학은 다인성이며 배아 중심의 원인 (주로 비정상적인 배아 karyotype으로 인한) 및 내측 및 / 또는 태반 발달에 영향을 미치는 모계 구동 원인으로 나눌 수 있습니다. 이 증상은 부모의 유전적 이상, 자궁 이상, 보혈증 조건, 내분비학 요인 및 면역 장애4에서발생할 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 면역 이펙터 세포 기능 장애는 조기 임신손실5의병인에 연루되어 있다. 이것은 생리 주기 도중 자궁 내막에 있는 면역 세포의 특정 인구를 해명하는 많은 조사를 영감을 주었습니다, 이식, 및 초기 임신, 초기 임신에 있는 특정 역할. 이러한 면역 세포 중, 자궁 자연 살인자 (uNK) 세포는 특히 열대 성 침략 및 혈관 신생 의 과정에서, 배아 이식 및 임신 동안 중요한역할을한다 6. 연구 결과는 RM7,8을가진 여자의 내분담관에 있는 증가한 uNK 세포 조밀도를 보여주었습니다, 그러나 이 사실 인정은 유산9의증가한 리스크와 연관되지 않았습니다. 그러나, 이러한 자극 연구는 RM10,11을가진 여성의 내막에서 다른 면역 세포 유형(대식세포, 자궁 수지상 세포 등)의밀도를평가하였다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 RM을 가진 여자에 있는 peri 이식 내막에 있는 면역 세포 조밀도에 있는 중요한 변경이 있는지 불확실합니다.
불확실성에 대한 한 가지 가능한 설명은 이식 기간 동안 자궁 내막 면역 세포 밀도의 평가가 어려울 수 있다는 것입니다. 24시간 동안, 내메트리움의 중요한 변화는 면역 세포 밀도와 사이토카인 분비를 변화시키고, 이러한결과(12)에변이의 근원을 소개한다. 또한, 대부분의 보고서는 주로 동일한 조직 섹션에서 여러 마커를 검사할 수 없는 단일 세포 염색(예를 들어, 전통적인 IHC 방법)의 사용에 의존한다. 유동 세포측정은 단일 샘플에서 다중 세포 집단을 검출하는 데 사용될 수 있지만, 필요한 많은 양의 세포와 시간이 많이 소요되는 최적화는 이 방법의 인기와 효율성을 저해한다. 따라서, 멀티플렉스 IHC 염색의 최근 발전은 개별 면역 하위 집단의 세포 계보 및 조직학적 국소화를 포함하여 다중 파라미터를 평가하기 위하여 동일한 슬라이드에 다중 마커를 면역염색하여 이 문제를 해결할 수 있었습니다. 또한, 이러한 기술은 조직 가용성이 제한된 경우 얻은 정보를 극대화할 수 있다. 궁극적으로, 이 기술은 비옥한 여자와 RM를 가진 여자 사이 내메트리움에 있는 면역 세포 상호 작용에 있는 다름을 해명하는 것을 도울 수 있습니다.
비옥한 통제 여자 (FC)와 설명할 수 없는 재발성 유산을 가진 여자를 포함하여 여자의 2개의 단은 웨일즈 병원의 왕자에서 모집되었습니다 (RM). 비옥한 통제는 자발적인 유산의 역사 없이 적어도 1개의 살아있는 출생이 있던 여자로 정의되고, RM 여자는 임신 20 주 전에 ≥2 연속 유산의 역사를 가진 사람들로 정의되었습니다. 두 그룹에서 피험자는 다음과 같은 포함 기준을 충족: (a) 나이 사이 20 받는 사람 42 세, (b) 비 흡연자, (c) 일반 생리 주기 (25-35 일) 및 정상적인 자궁 구조, (d) 자궁 내막 생검 전에 적어도 3 개월 동안 호르몬 처방의 사용, (e) 수산화 증에 의해 수산화 증에 의해 수산화 증. 또한, 모집된 모든 피험자는 정상적인 카요티핑, 정상 3차원 초음파 초음파 초음파 검사 히스테리살핀고그램, 2일째 여포 자극 호르몬 < 10 IU/L, 미드 루테알 프로게스테론 > 30nmol/L, 정상 갑상선 기능, 루푸스 항응고제 및 항심방지및 이그GM 항체에 대한 음의 검사를 받았습니다.
RM의 면역 학적 기초를 더 잘 이해하기 위해 이식 시 내메트란에 존재하는 주요 면역 세포 유형을 동시에 정량화하고 국소화하는 것이 가장 바람직할 것입니다. 이 논문은 샘플 제제, 면역 세포 아류형에 대한 마커를 가진 멀티플렉스 최적화, 슬라이드의 스캔, 자궁내막 면역 세포를 검출하는 특정 참조를 가진 데이터 분석을 설명합니다. 더욱이, 이 논문은 내분담관에서 면역 세포 모형의 조밀도 그리고 군집을 결정하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>증폭 희석제</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1498</td><td>형광단 희석</td></tr><tr><td>제 완충액</td><td>Perkin Elmer</td><td>ARD1001EA</td><td>항체 희석</td></tr><tr><td>CD3</td><td>Spring Bioscience</td><td>M3072</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>CD20</td><td>Biocare Medical</td><td>CM004B</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Leica</td><td>NCL-CD56-504</td><td>1차 항체 항체</td></tr><tr><td>CD68</td><td>Spring Bioscience</td><td>M5510</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>구연산염 완충 용액, pH 6.0 (10x)</td><td>Abcam</td><td>AB64214</td><td>항원 회수 용액</td></tr><tr><td>EMSURE Xylene (이성질체 혼합물)</td><td>Merck</td><td>108297</td><td>탈왁싱</td></tr><tr><td>에탄올 절대</td><td>Merck</td><td>107017</td><td>수분 보충용 에틸 알코올</td></tr><tr><td>HistoCore BIOCUT 수동 로터리 라이카 Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2125RTS</td><td>파라핀 포매 조직 절편</td></tr><tr><td>inForm 고급 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td>inForm&reg; Tissue Finder Software 2.2.1 (버전 14.0)</td><td>데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Mantra&reg; 워크스테이션</td><td>Akoya Biosciences</td><td>CLS140089</td><td>분광 이미징</td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>파나소닉</td><td>인버터</td><td>마이크로파 스트리핑</td></tr><tr><td>오팔 520</td><td>퍼킨 엘머</td><td>FP1487A</td><td>적절한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>오팔 620</td><td>퍼킨 엘머</td><td>FP1495A</td><td>적절한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>오팔 650</td><td>퍼킨 엘머</td><td>FP1496A</td><td>적절한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>Opal 690</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1497A</td><td>적절한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>오븐</td><td>Memmert</td><td>U10</td><td>탈랍싱</td></tr><tr><td>과산화효소 차단 용액</td><td>DAKO</td><td>S2023</td><td>조직 과산화효소 활성 제거</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 코팅 슬라이드</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>120-550-15</td><td>일상적인 조직학적 사용을 위한 슬라이드</td></tr><tr><td>PolyHRP Broad Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>ARH1001EA</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>ProLong&trade; Gold Antifade Mountant</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>P36930</td><td>마운팅</td></tr><tr><td>Spatstat</td><td>/</td><td>Version 2.1-0</td><td>공간 포인트 패턴 분석</td></tr><tr><td>Spectral DAPI</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1490A</td><td>핵산 염색</td></tr><tr><td>조직 처리기</td><td>Thermo Fischer</td><td>Excelsior ES</td><td>탈수 및 파라핀화를 위한 조직 처리</td></tr><tr><td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>12498S</td><td>세척 용액</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1370-1L</td><td>비이온성 세제</td></tr></tbody></table>

재발성 유산에 있는 4개의 자궁내막 면역 세포 모형의 멀티플렉스 형광 면역히스토화학 염색

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

면역 조직 화학은 생물학적 연구 및 임상 진단에서 조직 항원의 식별 및 시각화를 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 상처 치유, 면역 반응, 조직 거부 및 조직-생체 물질 상호 작용과 같은 다양한 생물학적 과정 이나 병리를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 종래의 면역조직화학(IHC)을 이용한 단일 조직 섹션에서 다중 항원(특히 면역세포용)의 시각화 및 정량화는 만족스럽지 못한 남아 있다. 따라서, 멀티플렉스 기술은 단일 조직 샘플 또는 상이한 조직 샘플의 앙상블에서 다중 생물학적 마커를 식별하기 위해 최근 몇 년 동안 도입되었다. 
이러한 기술은 이식 중 재발성 유산을 가진 비옥한 여자와 여자 사이 내측 내의 면역 세포 세포-세포 상호 작용에 있는 변경을 분화에 특히 유용할 수 있습니다. 이 논문은 배아 이식 중 정확하게 시간조정된 자궁내막 표본에서 4가지 주요 면역 세포 유형의 밀도와 클러스터링을 동시에 조사하기 위해 멀티플렉스 형광 IHC 염색을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 심료 제제, 면역 세포 아류형을 위한 마커를 이용한 멀티플렉스 최적화, 슬라이드의 스캔, 데이터 분석, 자궁내막 면역 세포 검출에 대한 구체적인 참조등이 포함된다. 
이 방법을 이용하여, 내측에서 4가지 주요 면역세포 유형의 밀도 및 군집은 단일 조직 섹션에서 동시에 분석될 수 있다. 또한, 이 논문에서는 적용중인 형광 프로브 사이의 가능한 형광 간섭을 극복하기 위한 중요한 요인과 문제 해결에 대해 논의할 것입니다. 중요한 것은, 이 멀티플렉스 염색 기술의 결과는 배아 이식 도중 면역학적 상호 작용 및 조절의 심층적인 이해를 제공하는 것을 도울 수 있습니다.

4개의 자궁내막 면역 세포 모형의 검출을 위한 4색 멀티플렉스 분석능력을 수행하는 전반적인 회로도 과정은 도 1에도시된다. 간단히 말해서, 이 멀티플렉스 면역형광 염색에 대한 프로토콜은 8가지 주요 단계를 필요로 했습니다: 1. 슬라이드 제제, 2. Epitope 검색, 3. 차단, 4. 1 차 항체 응용 프로그램, 5. 이차 항체 응용 프로그램, 6. 신호 증폭, 항체 제거, 및 8. 카운터스테인 및 마운트. 영상 렌더링 및 분석은 인폼 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 생성된 스펙트럼 라이브러리를 이용한 만트라 워크스테이션을 사용하여 실시하여 4가지 면역세포 유형을 내메트리엄샘플(그림 2)에서분화하였다.
4개의 자궁내막 면역 세포 모형은 이 멀티플렉스 염색 기술을 사용하여 인간 내막심 견본에서 규명될 수 있습니다: CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD68+ 대식...

멀티플렉스 면역히스토케및 다스펙트럼 이미징의 발전에도 불구하고, 자궁내막에서 동시에 주요 면역 세포의 밀도와 군집을 특성화하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이 논문은 자궁 내막에서 4개의 면역 세포 모형의 동시 국소화를 위한 상세한 멀티플렉스 염색 프로토콜 및 화상 진찰을 기술합니다.

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

본 기술은 최대 7개의 마커를 검출하기 위한 동일 종에서 제기된 항체의 사용을 허용합니다. 절차를 시연하는 것은 실험실의 기술자 인 Loucia Chan이 될 것입니다. 먼저 조직 샘플과 함께 장착된 포르말린 고정 파라핀 임베디드 유리 슬라이드를 오븐에 평평하게 놓고, 위쪽으로 향하는 조직으로 섭씨 60도에서 굽는 것으로 시작합니다.1시간 후, 원고에 설명된 바와 같이, 10분당 슬라이드를 분해하고 재수화합니다. 슬라이드를 트리스 버퍼식 식염수로 잠근 다음 메탄올에 희석된 포름알데히드혼합물로 채워진 플라스틱 슬라이드 상자에 잠수하여 샘플을 수정합니다. 다음으로, 슬라이드를 2분 동안 탈온된 물에 두 번 씻습니다.pH 6.0에서 구연산 버퍼로 채워진 내열성 상자에 슬라이드 랙을 배치하여 에피토프 검색을 진행하십시오. 그런 다음 상자를 전자레인지에 넣고 슬라이드를 50초 동안 100%의 전력으로 먼저 가열한 다음 20%의 전력으로 20분 동안 동일한 온도를 유지합니다. 증류수에 슬라이드를 헹구고 TBST로 세척한 후 슬라이드를 과산화 차단 용액이 들어 있는 병에 10분 간 담급됩니다.인큐베이션 후, 증류수로 슬라이드를 헹구고 TBST로 세척한 다음 소수성 장벽 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주변경계를 표시합니다. 그런 다음 TBST에서 슬라이드를 헹구고, 차단 버퍼로 조직 섹션을 덮고 15 분 동안 가습 챔버에서 슬라이드를 배양합니다. 차단 시약을 제거하기 위해 먼저 1 차 항체로 슬라이드를 배양 한 다음 TBST로 슬라이드를 세 번 세척한 다음 폴리머 고추냉이 과록시다제 라벨, 이차 항체로 배양하기 전에 1 차 항체를 제거합니다.인큐베이션에 따라 TSA 작업 용용용오팔 식물군을 적용하기 전에 슬라이드를 세척한 다음 항원 검색 버퍼로 슬라이드를 헹구십시오. 마이크로파 안전 용기에서 20%의 전력을 100%로 전자레인지에 100%의 출력으로 가열한 다음 전자레인지 안전 용기에서 20%의 전력을 공급하여 마이크로파 기반 스트리핑을 수행합니다. 실온에서 15분 동안 샘플을 냉각한 후, 슬라이드를 증류수와 TBST로 헹구고 나중에 5분 동안 dappy 용액으로 배양합니다.그런 다음 적절한 장착 매체로 장착하기 전에 슬라이드를 공기 건조시합니다. 슬라이드의 이미징 전에 워크스테이션에서 적절한 필터를 미리 설정합니다. 200배 배율 미만의 분석을 위해 최소 10개의 필드를 캡처합니다.셀을 계산하려면 스텝 표시줄의 개수 오브젝트 버튼을 클릭하여 개체 계산 설정 패널을 표시합니다. 조직이 분할된 경우 개체를 찾을 수 있는 조직 범주를 선택합니다. 그런 다음 자동 스케일 또는 고정 축척에서 원하는 신호 배율 조정을 선택합니다.개체 세분화의 경우 드롭다운 목록에서 기본 구성 요소를 선택합니다. 다른 객체를 결합하지 않고 결합된 객체로 만지는 객체를 감지하려면 최대 크기와 픽셀 상자를 확인한 다음 세련된 분할을 선택합니다. 다음으로, 면역 세포에 있는 모든 기질 세포를 개별적으로 계산하여, 각 캡처된 이미지에 대한 총 기질 세포 수에 비해 면역 세포의 백분율로 데이터를 표현한다.나중에 최종 셀 수를 모든 필드의 평균으로 보고합니다. 뷰 편집기를 사용하여 결과 데이터 테이블을 사후 처리한 다음 카운트 데이터 테이블을 내보냅니다. 대표적인 분석에서, 우리가 분화하고 있는 내메트리엄 견본에 있는 4개의 면역 세포 모형.처리된 이미지는 상피, 기질 구획으로 조직 분할을 보여줍니다. 멀티플렉스 면역스테인링은 비옥한 대조군 여성과 설명할 수 없는 재발성 유산을 가진 여성으로부터 자궁내막 생검에 수행되었으며, CD3, CD56, CD68 및 CD20을 대표하는 단일 층은 면역염색에서 밝혀졌다. 면역 소리가 확인되면, 사이토카인 의 밑에 더 염색하는 것은 이식 성공을 위한 그들의 상호 작용 그리고 기계장치를 해결하는 것을 도울 수 있습니다.

multiplexed-fluorescent-immunohistochemical-staining-four-endometrial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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