재발성 유산에 있는 4개의 자궁내막 면역 세포 모형의 멀티플렉스 형광 면역히스토화학 염색
2021년 8월 4일
멀티플렉스 면역히스토케및 다스펙트럼 이미징의 발전에도 불구하고, 자궁내막에서 동시에 주요 면역 세포의 밀도와 군집을 특성화하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이 논문은 자궁 내막에서 4개의 면역 세포 모형의 동시 국소화를 위한 상세한 멀티플렉스 염색 프로토콜 및 화상 진찰을 기술합니다.
본 기술은 최대 7개의 마커를 검출하기 위한 동일 종에서 제기된 항체의 사용을 허용합니다. 절차를 시연하는 것은 실험실의 기술자 인 Loucia Chan이 될 것입니다. 먼저 조직 샘플과 함께 장착된 포르말린 고정 파라핀 임베디드 유리 슬라이드를 오븐에 평평하게 놓고, 위쪽으로 향하는 조직으로 섭씨 60도에서 굽는 것으로 시작합니다.
1시간 후, 원고에 설명된 바와 같이, 10분당 슬라이드를 분해하고 재수화합니다. 슬라이드를 트리스 버퍼식 식염수로 잠근 다음 메탄올에 희석된 포름알데히드혼합물로 채워진 플라스틱 슬라이드 상자에 잠수하여 샘플을 수정합니다. 다음으로, 슬라이드를 2분 동안 탈온된 물에 두 번 씻습니다.
pH 6.0에서 구연산 버퍼로 채워진 내열성 상자에 슬라이드 랙을 배치하여 에피토프 검색을 진행하십시오. 그런 다음 상자를 전자레인지에 넣고 슬라이드를 50초 동안 100%의 전력으로 먼저 가열한 다음 20%의 전력으로 20분 동안 동일한 온도를 유지합니다. 증류수에 슬라이드를 헹구고 TBST로 세척한 후 슬라이드를 과산화 차단 용액이 들어 있는 병에 10분 간 담급됩니다.
인큐베이션 후, 증류수로 슬라이드를 헹구고 TBST로 세척한 다음 소수성 장벽 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주변경계를 표시합니다. 그런 다음 TBST에서 슬라이드를 헹구고, 차단 버퍼로 조직 섹션을 덮고 15 분 동안 가습 챔버에서 슬라이드를 배양합니다. 차단 시약을 제거하기 위해 먼저 1 차 항체로 슬라이드를 배양 한 다음 TBST로 슬라이드를 세 번 세척한 다음 폴리머 고추냉이 과록시다제 라벨, 이차 항체로 배양하기 전에 1 차 항체를 제거합니다.
인큐베이션에 따라 TSA 작업 용용용오팔 식물군을 적용하기 전에 슬라이드를 세척한 다음 항원 검색 버퍼로 슬라이드를 헹구십시오. 마이크로파 안전 용기에서 20%의 전력을 100%로 전자레인지에 100%의 출력으로 가열한 다음 전자레인지 안전 용기에서 20%의 전력을 공급하여 마이크로파 기반 스트리핑을 수행합니다. 실온에서 15분 동안 샘플을 냉각한 후, 슬라이드를 증류수와 TBST로 헹구고 나중에 5분 동안 dappy 용액으로 배양합니다.
그런 다음 적절한 장착 매체로 장착하기 전에 슬라이드를 공기 건조시합니다. 슬라이드의 이미징 전에 워크스테이션에서 적절한 필터를 미리 설정합니다. 200배 배율 미만의 분석을 위해 최소 10개의 필드를 캡처합니다.
셀을 계산하려면 스텝 표시줄의 개수 오브젝트 버튼을 클릭하여 개체 계산 설정 패널을 표시합니다. 조직이 분할된 경우 개체를 찾을 수 있는 조직 범주를 선택합니다. 그런 다음 자동 스케일 또는 고정 축척에서 원하는 신호 배율 조정을 선택합니다.
개체 세분화의 경우 드롭다운 목록에서 기본 구성 요소를 선택합니다. 다른 객체를 결합하지 않고 결합된 객체로 만지는 객체를 감지하려면 최대 크기와 픽셀 상자를 확인한 다음 세련된 분할을 선택합니다. 다음으로, 면역 세포에 있는 모든 기질 세포를 개별적으로 계산하여, 각 캡처된 이미지에 대한 총 기질 세포 수에 비해 면역 세포의 백분율로 데이터를 표현한다.
나중에 최종 셀 수를 모든 필드의 평균으로 보고합니다. 뷰 편집기를 사용하여 결과 데이터 테이블을 사후 처리한 다음 카운트 데이터 테이블을 내보냅니다. 대표적인 분석에서, 우리가 분화하고 있는 내메트리엄 견본에 있는 4개의 면역 세포 모형.
처리된 이미지는 상피, 기질 구획으로 조직 분할을 보여줍니다. 멀티플렉스 면역스테인링은 비옥한 대조군 여성과 설명할 수 없는 재발성 유산을 가진 여성으로부터 자궁내막 생검에 수행되었으며, CD3, CD56, CD68 및 CD20을 대표하는 단일 층은 면역염색에서 밝혀졌다. 면역 소리가 확인되면, 사이토카인 의 밑에 더 염색하는 것은 이식 성공을 위한 그들의 상호 작용 그리고 기계장치를 해결하는 것을 도울 수 있습니다.
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개요
본 연구는 다중 면역 조직 화학 염색과 다분광 이미징을 이용하여 자궁내막 내 주요 면역 세포의 밀도와 클러스터링을 동시에 특성화하는 과정의 어려움을 해결합니다. 자궁내막 내 네 가지 면역 세포 유형을 동시에 국소화하기 위한 상세한 염색 프로토콜이 설명되어 있습니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 면역학
- 자궁내막 생물학
- 다중 이미징 기법
배경
- 생식 생물학에서 면역 세포 특성 분석의 중요성.
- 전통적인 염색 방법의 한계점.
- 이미징 기술의 발전.
사용된 방법
- 다중 면역조직화학 염색
- 포르말린 고정 파라핀 임베딩 조직 시료
- 다분광 이미징
주요 결과
- 자궁내막에서 네 가지 면역 세포 유형(CD3, CD56, CD68, CD20)을 성공적으로 분별하였습니다.
- 면역 세포의 분포 및 클러스터링을 시각화하였습니다.
- 추후 연구를 위한 프로토콜 개선 사항을 제공하였습니다.
결론
- 본 연구는 자궁내막 내 면역 세포 분석을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다.
- 이는 생식 건강 및 착상 성공률을 이해하는 데 중요한 의미를 갖습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
다중 형광 면역조직화학 염색은 단일 조직 절편 내에서 여러 면역 세포 집단을 동시에 정량화할 수 있게 하여, 생식 면역학 연구의 중대한 공백을 메워줍니다. 이 접근 방식은 환자 유래 샘플에서 직접 공간적으로 분해된 다중 면역 프로파일링 데이터를 제공함으로써, 자궁내막 미세환경 가설의 기전적 리스크 제거를 지원합니다. 이 방법은 가임 상태와 병리적 상태 간의 면역 세포 밀도 및 클러스터링을 직접 비교할 수 있게 하여, 착상 실패 및 반복 유산과 관련된 표적 검증 노력의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: CD3, CD56, CD68 및 CD20 마커의 동시 검출을 통해 자궁내막 내 면역 세포 상호작용과 관련된 치료 가설의 조사를 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 연속 절편 제작 및 염색의 필요성을 줄여 귀중한 임상 샘플을 보존하는 동시에 조직 절편당 데이터 밀도를 높입니다.
- 예측 신뢰도: 착상 중 자궁내막-면역 교차 반응에 관여하는 타겟의 생물학적 리스크 제거를 뒷받침하는 정량적이고 공간적으로 분해된 면역 세포 지표를 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 고함량 이미징 플랫폼 및 자동화된 이미지 분석 워크플로우에 적합한 표준화되고 재현 가능한 형광 판독값을 생성합니다.
- 확장성: 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE) 조직 바이오뱅크와 호환되어, 바이오마커 발굴을 위한 대규모 코호트의 회고적 분석이 가능합니다.
- 다중 분석 최적화: 순차적인 염색 및 스트리핑 사이클을 통해 형광체 간섭 문제를 해결하여, 각 면역 세포 마커에 대한 신호 특이성을 보장합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련 시스템: 인간 자궁내막 생검에 직접 적용 가능하며, 반복 유산의 면역 조절 장애 연구를 위한 임상적으로 유의미한 모델을 제공합니다.
- 중개 연구의 연속성: 샘플 유형 전반에 걸쳐 일관된 면역 표현형 분석을 가능하게 함으로써, 발견 단계의 면역 프로파일링과 전임상 검증 사이의 가교 역할을 합니다.
- 기전적 리스크 감소: 초기 세포 유형 식별 후 사이토카인 매개 면역 세포 상호작용 조사를 지원하여, 경로 수준의 타겟 검증을 용이하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 발견 생물학 단계에 적합하며, 특히 생식 면역학 프로그램의 면역 타겟 검증 및 표현형 스크리닝 작업을 지원합니다.
- 발견 생물학: 착상 시기 자궁내막의 면역 세포 구성 및 공간적 조직화에 관한 가설 검증을 가능하게 합니다.
- 스크리닝: 실험 조건 간의 면역 세포 밀도 및 클러스터링 패턴 비교가 가능한 정량적 면역형광 출력물을 생성합니다.
- 분석: 면역 세포 표현형 분석 및 기능적 상태 추론에 정보를 제공하는 다중 형광 강도 및 공동 국소화 데이터를 제공합니다.
- 중개 연구: 하위 기능 분석을 위한 검증된 면역 세포 마커를 제공함으로써 인간 샘플 분석에서 기전 후속 연구로의 연속성을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 자궁내막 및 기타 조직의 다양한 면역 프로파일링 연구에 적용 가능한 재사용 가능한 면역 염색 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 질환 조직과 대조군 조직 내 면역 세포 군집의 직접적인 다중 비교를 가능케 하여 표적 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 단일 슬라이드에서 최적화된 순차적 염색 및 스트리핑 프로토콜을 통해 시약 효율을 개선하고 변동성을 줄입니다.
- 전략적 가치: 착상 성공 또는 실패에 기여하는 면역 미세환경의 영향을 명확히 하여 생식 치료제의 진행 여부(go/no-go) 결정에 유용한 정보를 제공합니다.
- 포트폴리오 영향: 면역 세포의 밀도, 클러스터링 및 상피 또는 기질 구획과의 공간적 상관관계를 기반으로 표적의 위험 조정 우선순위 설정을 가능하게 합니다.
구현 시 고려사항
- 정확한 신호 검출 및 정량을 위해 면역조직화학, 형광 현미경 및 다분광 이미지 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 마이크로파 기반 항원 회복 시스템, 형광 지원 슬라이드 스캐너 및 멀티플렉스 사이클링을 위한 검증된 Opal 형광체 키트의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 멀티플렉스 결과의 재현성을 보장하기 위해 실험실 간의 블로킹, 항체 반응 및 스트리핑 조건의 표준화가 필요합니다.
- CD3, CD56, CD68 및 CD20 이외의 다른 조직 유형이나 면역 세포 마커에 이 방법을 적용할 때는 항체 패널 및 검증 단계의 최적화가 필요합니다.
- 실제적인 제한 사항으로는 잠재적인 형광체 블리드스루(bleed-through)와 이미징 중 세심한 스펙트럼 분리의 필요성이 있으며, 이는 순차적 스트리핑과 검증된 필터 설정을 통해 해결됩니다.
