Name: 얼룩말 물고기 애벌레의 척추 모터 뉴런에서 TDP-43의 광유전학 적 단계 전환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 배우세요 얼룩말 물고기 척추 운동 뉴런에서 광유전학 기법으로 TDP-43의 병리적 상 전이를 유도하는 방법입니다. 이 기법은 ALS 운동 뉴런 퇴행 메커니즘 연구와 치료제 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 세리카 펀드 (KA), KAKENHI 그랜트 번호 JP19K06933 (KA) 및 JP20H05345 (KA)에 의해 지원되었다.

모든 어류 작업은 국립보건원 동물복지실(NIH, NIH)의 동물복지실(보증번호 A5561-01)을 제출하는 국립유전학원(일본)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(일본 24-2)에 따라 진행되었습니다. 미국).
1. mnr2b 프로모터로부터 광유전학 TDP-43 유전자의 발현을 위한 BAC의 건설
<ol><li>BAC 준비<ol>
<li>제브라피쉬 mnr2b 궤적(CH211-172N16, BACPAC 유전체학)을 함유한 제브라피쉬 BAC 클론을 구입한다. 온난화 외 18에 기술된 바와 같이 CH211-172N16을 항구하는 DH10B 대장균(E. coli)의 5mL 하룻밤 LB 배양으로부터 BAC DNA를 정화한다.</li>
		<li>온난화 외 18에 설명된 바와 같이, 전기화에 의해 CH211-172N16을 전기기화로 변환한다. 참고: 전기기화 당일 대장균 으로부터 BAC DNA의 정제는 일반적으로 BAC transform18의 높은 성공률을 제공합니다. 그렇지 않으면, 정제된 BAC DNA는 사용전까지 -20°C로 유지된다.</li>
		<li>아사카와 등에서 설명한 바와 같이, 전기포공에 의한 CH211-172N16의 중추에 Tol2-amp-amp 카세트를 도입한다.<ol>
<li>E의 글리세롤 스톡을 만드십시오. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 상동성 재조합-통합을 확인한 후 iTol2-amp 카세트 통합(CH211-172N16-iTol2A)을 탑재한 콜라 세포 클론(Ex Taq) 프라이머 쌍 Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') 및 pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') 및 다음과 같은 조건을 사용하여: 1분 동안 98°C에서 의 하부절 단계, 10초 동안 95°C에서 25사이클의 내성, 15s에 대해 55°C의 프라이머 어닐링, 프라이머 연장은 72°C에서 1분 동안 72°C, 354개의 베이스 쌍(bp)의 PCR 생성을 증폭시켰다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:opTDP-43h 건설<ol>
<li>N-및 C-테르미니에서 mRFP1 및 CRY2olig로 태그되는 인간 야생형 TDP-43/TARDBP (TDP-43h)에 대한 발현 카세트를 운반하는 플라스미드를 각각(이하 opTDP-43h)14에 구성한다. 참고: opTDP-43h 단편은 제브라피쉬 hsp70l 유전자 프로모터 서열(650bp) 및 폴리아데닐립(polyA) 신호 서열과 측면으로, 카나마이신 저항 유전자(hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14와 함께 한다.</li>
		<li>hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트를 프롤러 hsp70l 및 칸을 음질하고 PCR(GXL DNA 폴리머라제)에 의한 mnr2b 유전자의 인니티에이터 코돈의 상류 및 하류의 45bp 서열을 함유하고 있습니다. b-hspGFF-Forward (5'tat cag cag caa ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AG CTT CCA GAA C-3') 및 Km-r (5'ggt tct tca gct aaa agg tcg tcg atcc atc cc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAG AA-3') 다음과 같은 조건: 98°C에서 1 분 동안 의 내포화 단계, 10에 대한 95 °C에서 30 사이클, 55 °C에서 55 ° C, 프라이머 앤날링 15 ° C ~5.7 bp의 PCR 제품을 증폭.</li>
		<li>PCR 제품을 아가로즈 젤 전기포고(100 V)로 분리하고 HSp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA 대역을 DNA 컬럼으로 정화한다. 10mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 1mM EDTA를 포함하는 트리스-EDTA 버퍼(TE)에서 정제된 hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트의 농도를 50 ng/μL로 조정한다.</li>
		<li>hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트를 CH211-172N16-iTol2A로 온난화 외.18에 설명한 바와 같이 전기포이션에 의해 도입하고 LB agar 플레이트에서 암피실린 및 가나마이신 내성 변혁제를 선택한다. HSp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트를 운반하는 CH211-172N16-iTol2A는 mnr2b-hs:opTDP-43h로 지정됩니다.</li>
		<li>bac 정화 키트를 사용하여 mnr2b-hs:opTDP-43h를 정화하고 페놀/클로로폼 추출 후 TE에서 250 ng/μL에서 용해합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z 건설<ol>
<li>opTDP 대신 N-종산 (EGFP-TDP-43z)에서 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)으로 태그된 제브라피시 야생 형 타드bp를 운반하는 또 다른 플라스미드를 구성하십시오. 43h하지만 그렇지 않으면 hsp70l-opTDP-43h-폴리아-칸 분과 동일합니다(hsp70l-EGFP-TDP-43z-폴리아-칸)14. EGFP-TDP-43z를 opTDP-43h의 광 자극을 위한 내부 제어로 사용합니다.</li>
		<li>1.2.1-1.2.5에 기재된 바와 같이 mnr2b 궤적에서 hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan 카세트를 수용하는 CH211-172N16-iTol2A를 구성한다. HSp70lp-EGFP-TDP-43z-폴리아-칸 카세트를 운반하는 CH211-172N16-iTol2A는 mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z로 지정된다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 제브라피시의 Tol2 트랜스포슨 매개 BAC 트랜스게네스
<ol><li>40mM KCl, 페놀 레드(10% v/v), mnr2b-hs:opTDP-43h DNA의 25 ng/μL, 25 ng/μ Tol2 트랜스포사스 mRNA19를 포함하는 사출 용액을 준비한다.</li>
	<li>1세포 단계에서 야생형 제브라피시 배아의 사이토솔에 1nL의 주입 용액(약 123 μm의 직경이 있는 액적)을 1세포 단계에서 야생형 제브라피시 배아의 사이토솔에 주입한다. 2-3일 후 수정(dpf)에서 형광 스테레오현미경으로 척추 운동 뉴런을 포함한 다양한 배아 조직에서 적색 형광 단백질(RFP)-양성 응집체의 형성을 위해 주입된 물고기를 선별한다. RFP 양성 어류를 성인기에 올립니다.</li>
	<li>2.1 및 2.2에 기술된 바와 같이 mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA를 주입한다. 성인기에 EGFP 양성 물고기를 올립니다.</li>
	<li>몇 달 후, F1 자손을 얻기 위해 표준 2 L 짝짓기 케이지에 쌍에 성적으로 성숙한 주입 물고기와 야생 형 물고기를 넣어. 플랑드르-네오플루아르 5x/0.15 목표 렌즈를 장착한 피형성 현미경을 사용하여 척추 모터 컬럼의 RFP(opTDP-43h) 또는 EGFP(EGFP-TDP-43z) 형광에 대한 3dpf의 스크린 F1 물고기. 전형적으로, 한 명의 창업자 물고기는 10-20 주입된 물고기에서 확인됩니다(생식선 전송률은 5%-10%)입니다.</li>
	<li>여러 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]와 Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 다른 창업자 물고기의 삽입물을 다른 창업자 물고기의 삽입을 다른 창업자 물고기의 강도를 분리하고 비교하되, opTDP-43h 또는 EGFP-TDP-43z 발현의 패턴은 어조로 인해 설립자 물고기마다 다를 수 있습니다.</li>
	<li>크로스 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] 및 Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 물고기 라인 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b</li>
	<li>E3 버퍼 30mL(5mM NaCl)가 들어 있는 플라스틱 접시에 생선을 올립니다. 0.17 mM KCl2, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 10-5% 메틸렌 블루) 및 멜라제닌증을 억제하기 위해 8-10 h포스트 수정(hpf)에서 N-phenylthiourea에서 0.003% (w/v) N-phenylthiourea를 추가합니다.</li>
	<li>30hpf 후 알루미늄 호일로 플라스틱 접시를 덮습니다.</li>
</ol>3. 청색광 조명LED 준비
<ol><li>태블릿/휴대폰에 설치된 관련 응용 프로그램을 사용하여 LED 패널을 켭니다. 분광기의 프로브를 6웰 접시의 빈 우물에 넣고 응용 프로그램을 통해 ~ 456 nm에서 피크파장에 LED 빛을 조정합니다. 광학 전력 계의 광학 센서를 빈 우물에 놓고 LED 라이트(~0.61mW/cm2)의 전력을 조정합니다. LED 조명 설정을 저장할 수 있으며 응용 프로그램에서 검색할 수 있습니다.</li>
	<li>28°C에서 인큐베이터에 접시/LED 패널 설정을 소개합니다. 물고기의 화상 진찰이 48 hpf에서 시작하기 전에이 단계를 완료하십시오.</li>
</ol>4. 광유전학 TDP-43을 표현하는 제브라피시 애벌레의 이미징
<ol><li>Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 적어도 47hpf 전에 이중 형질형 물고기를 선택하십시오. 전술한 상술한 피피플루오렌스 현미경 설정을 이용하여 척추모터컬럼내의 RFP(opTDP-43h) 또는 EGFP(EGFP-TDP-43z) 형광에 기초하여.</li>
	<li>Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 형질체 물고기.</li>
	<li>에틸 3-아미노벤조이트 메탄술포네이트 소금의 250 μg/mL을 함유한 1% 낮은 용융 온도 아가로즈를 42°C에서 예열한다.</li>
	<li>짧게 마취 Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] E3 버퍼에서 48 hpf에서 이중 형질식 물고기트리케인의 동일한 농도를 함유한다.</li>
	<li>예열된 1% 낮은 녹는 온도아가로즈를 실온에서 유리 베이스 접시에 떨어뜨립니다. 유리 접시에 돔 모양의 아가로즈 드롭의 직경은 8-10mm입니다.</li>
	<li>파스퇴르 파이펫을 사용하여 마취된 생선을 유리 베이스 접시에 녹는 낮은 온도에 추가한 다음 몇 번 파이펫팅하여 섞습니다. 물고기와 함께 아가로즈에 추가된 E3 버퍼의 양을 최소화합니다.</li>
	<li>척수가 적절한 수평 위치에 있는지 확인하기 위해 아가로즈 (일반적으로 ~ 1 분)의 고화 시 주사기 바늘을 사용하여 측면에 물고기를 유지합니다. 고화 후, 돔 모양의 아가로즈 장착 물고기에 E3 버퍼 몇 방울을 넣습니다.</li>
	<li>수분 조리개 1.00을 장착한 공초점 현미경으로 스캔하여 척수의 직렬 공초점 z 단면을 획득하고, 픽셀당 4.0 μs(픽셀당 12비트), 목표용 슬라이스당 1.0 μm의 스텝 크기, 배설/배기가스 의 조합 채널 1) EGFP 및 채널 2용 473/510 nm) mRFP1용 559/583 nm. 참고: 물고기의 복부 측에 있는 클로카는 관심 영역(ROI)에 참고 자료로 포함되며, 이는 시간 지점에서 척추 세그먼트(레벨 16-17)를 식별하고 비교하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>이미징이 완료되자마자 주사기 바늘로 아가로즈를 조심스럽게 부수어 아가로즈에서 물고기를 제거하십시오. 아가로즈가 <30분 동안 포함되는 것은 물고기의 생존가능성에 영향을 미치지 않지만, 물고기가 아가로즈에 내장되는 시간을 가능한 한 짧게 유지한다.</li>
</ol>5. 푸른 발광 다이오드 (LED) 빛의 필드 조명에 의해 opTDP-43h 표현 물고기의 빛 자극
<ol><li>7.5mL의 E3 버퍼를 우물에 넣고 이미지된 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 트랜스제닉 어류를 웰에 넣습니다. 접시와 LED 패널을 스페이서와 5mm 간격으로 유지하여 LED 패널에 6웰 접시를 놓습니다(예: 5개의 슬라이드 안경이 쌓여 있음).</li>
	<li>파란색 LED 표시등을 켭니다. Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 형질식 생선을 알루미늄 호일로 덮인 별도의 6웰 접시에 보관하십시오(즉, 어두운 조건에서).</li>
	<li>조명 후(예: 도 3에서 72hpf에서 24시간 동안) 4.3-4.9단계를 반복하여 조명된 물고기의 척수를 이미지화한다.</li>
</ol>6. 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43의 세포질 재배치 의 시각화
<ol><li>이미지 파일을 이미지 파일 인 ImageJ/Fiji21 (버전: 2.1.0/1.53c)에서 열어 NIH 이미지에서 개발한 오픈 소스 Java 이미지 프로세싱 프로그램으로 https://imagej.net/Fiji/Downloads 다운로드할 수 있습니다.</li>
	<li>Z 스크롤 모음을 사용하여 초점 평면을 통과합니다. 이미지 | 클릭하여 여러 조각의 최대 강도 투영을 만듭니다 . 스택 | Z 프로젝트 | 최대 강도 및 설정 시작 슬라이스 및 척추 모터 컬럼의 중간 세그먼트를 커버 슬라이스를 중지합니다.</li>
	<li>이미지 | 클릭하여 멀티채널 이미지를 두 개의 단일 채널 이미지로 분할 합니다. 색상 | 분할 채널.</li>
	<li>EGFP-TDP-43z 신호를 향상시켜 이미지를 클릭하여 세포질 EGFP-TDP-43z가 명확하게 표시되도록 | | 조정 밝기/대비 및 최소 조정
</li>
	<li>분석 | 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다. 도구 | ROI 매니저. 세포 체의 상대적 위치를 기준으로 48 hpf 및 72 hpf의 두 이미지에서 식별 가능한 세포를 찾습니다. Freehand 선택을 사용하여 EGFP-TDP-43z 신호에 의해 시각화된 단일 척추 운동 뉴런의 세포 몸의 윤곽을 요약한 다음 ROI 관리자에서 [t] 추가를 클릭하여 ROI를 설정합니다.</li>
	<li>직선을 사용하여 직선을 그리고 | 분석을 클릭하여 소마의 주요 축을 설정합니다. EGFP-TDP-43z(C1) 및 opTDP-43h(C2) 이미지에 대한 플롯 프로파일은 48 및 72hpf에서.</li>
	<li>각 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43h 신호에 대해 값을 가장 큰 값으로 나누어 플롯 프로파일을 정규화합니다. x와 y가 통계 소프트웨어에서 XY 그래프를 사용하여 각각 소마 및 상대 형광 강도의 주요 축을 나타내는 x-y 좌표로 정규화된 값을 플롯합니다.</li>
</ol>7. ImageJ/Fiji를 이용한 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z 신호 간의 비율 비교
<ol><li>ImageJ/Fiji에서 이미지 파일을 열고 6.1-6.5에서와 같이 EGFP-TDP-43z의 최대 강도 프로젝션 이미지를 사용하여 단일 mnr2b 양성 셀에 대한 ROI를 설정합니다. 배경 신호(배경 ROI)를 나타내기 위해 복부 척수(예: 노토코드) 외부에 ROI를 추가합니다.</li>
	<li>각 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43 이미지에 대해 이미지를 클릭하여 여러 슬라이스의 투영을 | 스택 | Z 프로젝트 | 중간 슬라이스를 합산 하고 중간 척추 모터 컬럼을 덮는 슬라이스 를 시작하고 중지합니다.</li>
	<li>최대 강도 프로젝션 이미지로 만든 ROI 관리자를 엽니다. EGFP-TDP-43z의 이미지 창을 선택한 다음 ROI 관리자에서 모두 표시 를 클릭하여 합계 슬라이스 이미지에 ROI를 표시합니다. ROI 관리자의 측정 값을 클릭하여 각 ROI에 대한 평균 값을 얻습니다.</li>
	<li>7.3에서 제공되는 동일한 절차에 따라 opTDP-43h의 평균 값을 획득합니다.</li>
	<li>각 ROI에 대해, 배경 ROI에 대한 평균을 빼낸 후, EGFP-TDP-43z에 대한 빼기 평균으로 opTDP-43h에 대한 빼기 된 평균을 분할하여 비율 값을 얻습니다. 비율 측정 값은 서로 다른 시간 점 간에 비교하고 프리즘 소프트웨어의 열 그래프를 사용하여 표시할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

KA와 KK는 이 원고에 기재된 지적 재산권의 발명가이며, 임시 특허는 국립유전학원에 의해 제출되었다.

mnr2b-BAC-매개 발현은 제브라피시의 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z의 발현을 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 위상 전이의 라이브 이미징을 위한 독특한 기회를 제공한다. 제브라피시 애벌레의 신체 조직의 광학적 투명성은 opTDP-43h의 간단하고 비침습적 광유전학적 자극을 허용합니다. 시간이 지남에 따라 단일 척추 운동 뉴런 사이의 비교는 opTDP-43h의 빛 의존 올리고머화가 ALS 병리학을 연상시키는 세포질 클러스터링을 일으킨다는 것을 보여주었습니다.
본질적으로 무질서한 단백질의 위상 거동을 정의하는 중요한 매개변수 중 하나는 세포내 농도입니다. 높은 수준의 opTDP-43h 식은 잠재적으로 빛 독립적 opTDP-43h 올리고머화, 위상 전환 및 집계로 이어질 수 있습니다. 따라서, 척추 운동 뉴런에서 opTDP-43h 발현의 안정적이고 무독성 수준의 유도는 척추 운동 뉴런에 대한 opTDP-43 상 전환의 생리학적 및 병리학적 결과의 성공...

리보뉴클레오단백질(RNP) 과립은 균질유체가 2개의 뚜렷한 액체 상1,2로 분해되는 현상인 액체 액체 상 분리(LLPS)를 통해 멤브레인 이없는 분할을 조립하여 핵 및 세포질에서 무수한 세포 활동을 제어합니다. RNP 과립 성분으로 일반적으로 작동하는 RNA 결합 단백질의 소화 불량 LLPS는 단백질 응집으로 이끌어 내는 이상한 상 전이를 촉진합니다. 이 과정은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환에 연루되었습니다3,4,5. RNA 결합 단백질과 질병 병인의 비정상적인 LLPS 사이의 인과 관계의 정확한 평가는 LLPS가 효과적인 치료 대상으로 악용 될 수있는 여부와 방법을 결정하기위해 중요합니다. RNA 결합 단백질의 LLPS는 시험관 내 및 단세포 모형에서 공부하기 쉽지만 다세포 유기체, 특히 척추동물에서는 어렵습니다. 조직 환경 내의 개별 세포에서 이러한 LLPS를 분석하기 위한 중요한 요구 사항은 질병에 취약한 세포 유형의 LLPS의 이미징 및 조작을 위한 프로브를 안정적으로 표현하는 것입니다.
근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 뇌와 척수의 운동 뉴런이 변성으로 인해 선택적으로 점진적으로 손실되는 궁극적으로 치명적인 신경 장애입니다. 현재까지 25개 이상의 유전자에 있는 돌연변이는 총 ALS 케이스의 5%-10%를 차지하는 유전성(또는 가족적인) 형태의 ALS와 연관되어 있으며, 이들 ALS 유발 유전자 중 일부는 hnRNPA1, TDP-43 및 FUS6,7과 같은 RNP로 구성된 RNA 결합 단백질을 인코딩합니다. 더욱이, 총 ALS 케이스의 90%-95%를 차지하는 ALS의 산발적인 양식은 퇴행성 운동 뉴런에 증착된 TDP-43의 세포질 집계를 특징으로 합니다. 이러한 ALS 관련 RNA 결합 단백질의 주요 특징은 본질적으로 무질서한 영역(IDRs) 또는 주문된 3차원 구조가 부족한 저복잡성 영역이며 LLPS7,8을 구동하는 많은 다른 단백질과 약한 단백질 단백질 상호 작용을 중재합니다. ALS 일으키는 돌연변이가 IDRs에서 수시로 생기는 다는 사실은 이 ALS 관련 단백질의 비정상적인 LLPS 및 위상 전이가 ALS 병인9,10의 기초가 될 수 있다는 생각으로 이끌어 냈습니다.
최근에는 광에 의한 단백질-단백질 상호작용을 조절할 수 있는 Cryptochrome 2기반 광유전학기인 OptoDroplet 방법이 IDRs11을 이용한 단백질의 위상 전이를 유도하기 위해 개발되었다. 이 기술은 TDP-43로 성공적으로 확장되었기 때문에 TDP-43의 병리학적 위상 전환과 그 관련 세포 독성12,13,14,15의 기전을 밝히기 시작했습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 ALS 취약 세포 모형, 즉, mnr2b/mnx2b 유전자를 위한 BAC를 사용하여 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 광유전학 TDP-43을 전달하는 유전 적 방법을 간략하게 설명합니다16,17. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 척추 운동 뉴런의 위상 전환을 유발하는 광유전학 TDP-43의 간단하고 비침습적인 빛 자극을 허용합니다. 우리는 또한 광 자극에 대한 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어를 사용하여 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징을위한 기본 워크플로우를 제시합니다. 이러한 방법은 ALS 취약 한 세포 환경에서 TDP-43 단계 전이의 조사를 허용 하 고 세포 및 행동 수준에서 그것의 병적인 결과 탐구 하는 데 도움이 되어야 한다.

<table><tbody><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>올림푸스</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>에피 형광 현미경</td><td>ZEISS</td><td>Axioimager Z1</td><td></td></tr><tr><td>형광 실체 현미경</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>유리 기본 접시</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>MEE</td><td>CN-25C</td><td></td></tr><tr><td>LED 패널</td><td>Nanoleaf Limited</td><td>Nanoleaf AURORA 스마트 키트</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-2plus</td><td>TAKARA</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond BAC100</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>LONZA</td><td>50181</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFL N 20&times;/1.00</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>ZEISS</td><td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td><td></td></tr><tr><td>광 파워 미터</td><td>HIOKI</td><td>3664</td><td></td></tr><tr><td>광학 센서</td><td>HIOKI</td><td>9742-10</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 용액 0.5%</td><td>Merck</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA 중합효소</td><td>TAKARA</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>6웰 접시</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>분광계 프로브 BLUE-Wave</td><td>StellerNet Inc.</td><td>VIS-50</td><td></td></tr><tr><td>주사기 바늘</td><td>TERUMO</td><td>NN-2725R</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>TAKARA</td><td>RR001A</td><td></td></tr><tr><td>Tricane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>얼룩물고기 BAC 클론 CH211-172N16</td><td>BACPAC Genomics</td><td>CH211-172N16</td><td></td></tr></tbody></table>

얼룩말 물고기 애벌레의 척추 모터 뉴런에서 tdp-43의 광유전학 적 단계 전환

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

비정상적인 단백질 집계 및 선택적 뉴런 취약성은 신경 퇴행성 질환의 두 가지 주요 특징입니다. 이러한 특징 들 사이의 인과 관계는 취약한 세포 유형에서 질병 관련 단백질의 위상 전이를 제어함으로써 심문 될 수 있지만, 이러한 실험적 접근방식은 지금까지 제한되었습니다. 여기서, 근위축성 측삭 경화증(ALS)에서 퇴행성 모터 뉴런에서 발생하는 TDP-43의 세포질 응집 모델링을 위한 제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에서 RNA/DNA 결합 단백질 TDP-43의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 선택적으로 광유전학 TDP-43 변종을 전달하는 세균성 인공 염색체 (BAC)기지를 둔 유전 방법을 기술합니다. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 억제되지 않은 물고기에 대한 발광 다이오드(LED)를 사용하여 간단한 외부 조명에 의해 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43의 위상 전환을 허용합니다. 우리는 또한 광 조명에 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어와 함께 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징의 기본 워크플로우를 제시한다. 이 프로토콜은 ALS 취약 세포 환경에서 TDP-43 위상 전환 및 집계 형성의 특성화를 가능하게 하며, 이는 세포 및 행동 결과에 대한 조사를 용이하게 해야 합니다.

제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에 있는 광유전학 및 비 광유전학 TDP-43 단백질의 살아있는 화상 진찰 제브라피시의 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 상 전이를 유도하기 위해, N-및 C-테르미니에서 mRFP1 및 CRY2olig22로 태그되는 인간 TDP-43h는 각각 opTDP-43h14(도 1A)로 구성및 지정되었다. opTDP-43h 유전자 단편은 mnr2b 궤적(도 1B)을 포함하는 BAC로 도입되었다. mnr2b-hs:opTDP-43h로 지정된 결과 BAC는 Tol2 트랜스포슨 매개 BAC 트랜스게네시스19에 의해 제브라피시 게놈으로 도입...

우리는 제브라피시를 모델로 사용하여 척추 운동 뉴런의 빛에 의한 TAR DNA 결합 단백질(43)의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다.

얼룩말 물고기 애벌레의 척추 모터 뉴런에서 TDP-43의 광유전학 적 단계 전환

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

따라서 이 프로토콜을 통해 TDP-43의 병리학적 위상 전환을 유도하고 생체 내 척추 운동 뉴런의 세포 적 결과를 해결할 수 있으며, 이는 운동 뉴런이 ALS에서 퇴화하는 이유를 이해하는 데 관련이 있습니다. 제브라피시 애벌레의 높은 투명성으로 인해 척수의 운동 뉴런이 직접 보입니다. 따라서 단일 척추 운동 뉴런에서 단계 전이를 겪고 있는 TDP-43의 동적 동작을 시각화할 수 있습니다.이 방법은 ALS의 새로운 동물 모델을 제공합니다. 우리는 이 ALS 모형에 있는 빛 유도한 TDP-43 상 전이 및 응집을 방지할 수 있는 어떤 방법든지 ALS 치료를 위한 잠재적인 후보가 될 수 있다는 것을 믿습니다. 본질적으로 무질서한 지구를 가진 그밖 ALS 관련 단백질은 이상한 단계 전이와 관련되었던 신경 독성을 탐구하기 위하여 표현될 수 있습니다.이 접근법에서 성공의 열쇠는 무독성 수준에서 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43을 표현하는 것입니다. BAC 전생은 시간이 많이 걸리는 단계이지만 적절한 형질전환 물고기를 만들면 다음 단계는 비교적 쉽고 간단합니다. 먼저 태블릿이나 휴대폰에 설치된 관련 응용 프로그램을 사용하여 발광 다이오드 또는 LED 패널을 켭니다.다음으로 분광계 프로브를 6웰 접시의 빈 우물에 놓습니다. 그런 다음 응용 프로그램을 사용하여 LED 라이트를 456 nm에서 파장 피크로 조정합니다. 광학 전력 계의 광학 센서를 빈 우물에 놓고 LED 조명의 힘을 조절합니다.그런 다음 28 C.에서 인큐베이터에 LED 패널 설정으로 접시를 배치하여 광유전학 TDP-43을 표현하는 얼룩말 물고기 애벌레의 이미징을 위해 이중 트랜스제닉 물고기를 데코를 선명하게 하고 트라이케인 250 g/mL를 함유한 E3 버퍼로 마취합니다. 다음으로, 에틸 3-아미노벤조이트 메탄술포네이트250g/mL를 함유한 1% 낮은 용융 온도 아가로즈를 예열한 다음 유리 베이스 디쉬에 아가로즈 한 방울을 놓습니다. 유리 접시에 돔 모양의 아가로즈 드롭의 직경은 8 ~ 10mm해야합니다.다음으로 파스퇴르 파이펫을 사용하여 마취된 생선을 유리 기반 접시에 아가로즈에 추가합니다. 물고기와 함께 아가로즈에 추가된 E3 버퍼의 양을 최소화합니다. 그런 다음, 몇 번 파이펫으로 혼합.아가로즈의 고화 시 척수가 적절한 수평 위치에 있도록 주사기 바늘을 사용하여 측면에 물고기를 유지합니다. 아가로즈가 고화된 후, 돔 모양의 아가로즈 장착 물고기에 E3 버퍼 몇 방울을 추가합니다. 20배의 물 침수 목표 렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 척수의 연속 공초점 z 단면을 획득합니다.관심 지역의 물고기의 복부 쪽에 클로카를 포함하고 시간 지점에 걸쳐 척추 세그먼트를 식별하고 비교하는 참조로. 이미징이 완료되자마자 주사기 바늘을 사용하여 아가로즈를 조심스럽게 부수고 아가로즈에서 물고기를 제거하십시오. 아가로즈가 30분 미만이 포함되어 있지만 물고기의 생존가능성에 영향을 미치지 않지만, 물고기가 아가로즈에 내장되는 시간을 가능한 한 짧게 유지합니다.7.5mL의 E3 버퍼를 6웰 접시에 넣고 이미지된 이중 트랜스제닉 생선을 잘 넣습니다. 그런 다음 접시를 LED 패널에 놓고 접시와 LED 패널을 스페이서와 5mm 떨어져 놓고 파란색 LED 조명을 켭니다. 알루미늄 호일로 덮인 별도의 6웰 요리에 이중 트랜스제닉 생선을 보관하여 비조명되지 않은 컨트롤 피쉬를 만듭니다.원하는 조명 시간 후, 이전에 설명한 대로 조명된 물고기의 척수를 이미지했습니다. 단일 척추 운동 뉴런에서 opTDP-43h의 세포질 재배치는 48에서 획득한 z 시리즈 이미지를 분리하여 시각화되었다. 및 72시간 각 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43h 채널로 수정 후.EGFP-TDP-43z의 최대 강도 프로젝션 이미지에서, 둘 다에서 식별 할 수있는 단일 고립 된 척추 뉴런 48. 및 72시간 후 수정이 선택되었다. 모터 뉴런의 소마를 덮는 관심 영역은 48에서 EGFP 신호의 가장자리를 추적하여 설정되었다.및 72 시간 후 수정. 소마의 주요 축을 따라 정규화된 형광 강도가 플롯되었다. 그리고 48 시간 후 수정, 두 신호의 패턴은 크게 서로 겹쳤다.대조적으로, 72시간, OPTDP-43h 신호의 피크는 EGFP-TDP-43z 신호가 낮았던 지역에서 발견되었으며, 이는 opTDP-43h의 세포질 재배치를 나타낸다. 청색광 자극 전후의 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z 신호를 정량화하기 위해 동일한 z 시리즈 이미지의 각 채널에 대한 일부 슬라이스 프로젝션 이미지가 48에서 생성되었다. 및 72 시간 후 수정.조사된 4개의 mnr2b+셀 중, 셀 1은 특히 포화 된 EGFP-TDP-43z 신호를 표시하였다. EGFP-TDP-43z에 대한 opTDP-43h의 상대적 양은 RFP 값을 GFP 값으로 나누어 계산되었다. 세포 2 ~ 4는 청색광 조명 후 opTDP-43h 수준이 감소하는 것을 나타냈다.물고기를 건강하게 유지하기 위해 아가로즈에 내장된 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. LED 조명의 강도와 지속 시간을 조정함으로써, 우리는 모터 뉴런에서 병리학 적 TDP-43 위상 전이의 진행을 해부 하는 데 도움이 될 수 있는 임시 규제 방식으로 TDP-43 위상 전이를 제어 합니다.

optogenetic-phase-transition-tdp-43-spinal-motor-neurons-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 유전적으로 변형된 체성 감각 뉴런을 활성화하고 유도된 행동 반응을 고속 비디오 카메라로 기록하여 광유전학 기술을 설명합니다.

제브라피시 광유전학: 유충 행동 반응을 연구하기 위해 유전자 변형 체성 감각 뉴런 활성화

이 비디오에서는 감광성 올리고머화 도메인에 융합된 본질적으로 무질서한 영역을 구성하는 세포 내 단백질이 청색광 노출을 통해 유도되어 멤브레인이 없는 액체와 같은 응축물로 자가 결합하는 상 분리 분석에 대해 설명합니다.

단백질 상 분리 분석: 제브라피시 유충의 척추 운동 뉴런에서 돌연변이 RNA 결합 단백질 상 분리를 위한 광유전학적 방법

이 비디오는 제브라피시 배아에서 운동 뉴런의 전기생리학을 연구하기 위한 비침습적 분석을 보여줍니다. 척수 운동 뉴런의 자발적인 탈분극의 결과로 배아에서 꼬리 코일링을 측정하면 코일링 빈도를 줄이기 위해 나트륨 채널 차단제가 적용됩니다. 다음으로, 배아를 아가로스에 고정시키고 형광 현미경 아래에 놓습니다. 유전자 조작 운동 뉴런은 공여체와 수용체 형광단이 있는 전압 감지 바이오센서를 발현합니다. 수용체 형광단 방출의 감소는 나트륨 채널 차단제로 인한 운동 뉴런의 자발적 탈분극(droppolarization)이 감소했음을 나타냅니다.

제브라피시 배아에서 운동 뉴런의 전기생리학을 연구하기 위한 비침습적 접근 방식

Optogenetic 기법은 가능한 행동에 특정 뉴런의 공헌을 공부 만들었습니다. 우리는 다이오드 펌핑 고체 상태 (DPSS) 레이저 channelrhodopsin 변형 (요리사)를 표현하고 고속 비디오 카메라로 elicited 행동을 녹화 한 somatosensory 뉴런을 활성화하기위한 애벌레의 zebrafish의 방법을 설명합니다.

요리사 tdTomato를 사용하여 Zebrafish Somatosensory의 뉴런의 Optogenetic 활성화

여기에 설명된 프로토콜은 관심 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 유전자 인코딩 전압 지시기(GEVI)와 함께 생체 내 시스템에서 제브라피시 배아를 사용하여 가장 비침습적인 생리학적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구할 수 있도록 합니다.

살아있는 Zebrafish 배아에서의 바이오 센스 모터 뉴런 멤브레인 잠재력

이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

여기, 우리가 어떻게 셀 photoconversion 형광 단백질, Eos, 살아있는 동물을 표현 하는 특정 영역에 자외선 노출을 통해 이루어집니다 보여 프로토콜 제시.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

광유전학은 광범위한 응용 프로그램을 가진 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 청색 광 반응 TAEL/C120 시스템을 사용하여 제브라피시 배아에서 빛을 유도할 수 없는 유전자 발현을 달성하는 방법을 보여줍니다.

광유전학 적 TAEL/C120 시스템을 사용하여 제브라피시 배아에서 빛 유발 GFP 발현

신호 전달 경로의 광유전학적 조작은 발달, 재생, 항상성 및 질병에서 신호전달이 어떻게 해독되는지 조사하는 강력한 전략이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 제브라피시 배아에서 광-산소-전압 감지 도메인 기반 결절 및 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 신호 활성제를 사용하기 위한 실용적인 지침을 제공합니다.

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

이 프로토콜은 MPTP 처리된 제브라피시 유충에서 파킨슨병 유사 운동 및 비운동 결손을 평가하기 위한 행동 표현형 패러다임을 확립합니다.

행동 실험을 기반으로 한 제브라피시 유충에서 MPTP 유도 파킨슨 유사 행동 표현형의 표현형 프로파일링

배우세요 얼룩말 물고기 척추 운동 뉴런에서 광유전학 기법으로 TDP-43의 병리적 상 전이를 유도하는 방법입니다. 이 기법은 ALS 운동 뉴런 퇴행 메커니즘 연구와 치료제 개발에 활용됩니다.

얼룩말 물고기 애벌레의 척추 모터 뉴런에서 TDP-43의 광유전학 적 단계 전환

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