Name: 꼬리 정맥 transection 출혈 모델 완전 마취 혈우병 A 마우스에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 학습하세요 혈우병 A 마우스에서 꼬리 정맥 절단 출혈 모델을 이용한 생체 내 약리학적 평가 방법을. 이 최적화된 기술은 출혈 시간과 혈액 손실을 측정하여 혈우병 치료제 개발에 활용됩니다.

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Esther Bloem과 Thomas Nygaard는 혈장에서 FVIII의 측정에 대한 지원을 인정 받았습니다. Bo Alsted는 템플릿 드로잉 및 가공 및 절단 블록으로 인정 받고 있습니다.

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 Novo Nordisk A / S의 동물 복지 기관과 덴마크 동물 실험 검사원, 덴마크 식품, 농수산부의 승인을 받았습니다. 최적화된 40분 방법은 설계에 마취 및 투약 시간을 포함한다(그림 1). 이 절차를 위해서는 10-16 주 사이의 두 성별의 혈우병 마우스가 필요합니다.
1. 연구 전 준비
<ol><li>투약 용액을 올바른 농도로 준비하십시오.</li>
	<li>수조를 시작하고 37°C로 가열한다. 혈액 수집을 위해 15 mL 원심분리 튜브를 식염수 (0.9% NaCl)로 채운다.</li>
	<li>15 mL 식염수 튜브를 실험 시작 최소 15분 전에 가온된 베이스 플레이트의 구멍에 놓는다.</li>
	<li>마우스를 확인하고 체중을 기록하십시오. 이것이 스트레스를 유발하고 연구에 영향을 줄 수 있으므로 필요한 것보다 더 많은 마우스를 다루지 마십시오.</li>
	<li>진행하기 전에 흄 후드에 워크 스테이션을 준비하여 냅킨, 꼬리 홀더, 거즈, 주사기, 메스, 스톱워치 및 혈류 표기법 용지와 같은 모든 것이 도달 할 수 있도록하십시오.</li>
	<li>가열판에 꼬리 표시와 절단 블록을 놓으십시오 - 차가운 블록은 정맥을 수축시켜 출혈에 영향을 미칩니다.</li>
</ol>2. 마취
<ol><li>흄 후드 내부에서 이소플루란 마취 절차를 수행하십시오.</li>
	<li>가스 기화기를 1 L/min 유량의 마취 챔버의 30%O2/70%N2O에서 초기에 5% 이소플루란으로 설정하십시오. 마취 챔버가 채워지도록 충분한 시간을 허용하십시오 (챔버 부피 및 가스 유량에 따라 약 5 분). 빠른 유도를 보장하십시오 (1 분 미만).</li>
	<li>마우스가 의식을 잃을 때까지 마취실에 두십시오. 참고: 챔버가 충분히 채워진 경우 분 이내에 이 문제가 발생해야 합니다.</li>
	<li>페달 반사 (단단한 발가락 꼬집음)에 대한 고통스러운 반응이없는 상태에서 적절한 마취를 보장하십시오.</li>
	<li>마우스를 가열 플레이트에 놓고 코가 코 콘에 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>마취를 30% O2/70% N2O에서2% 이소플루란의 유지 수준으로 감소시키고 열 손실을 줄이기 위해 마우스 위에 플라스틱 덮개를 놓는다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 적절한 눈 연고를 바르십시오.</li>
	<li>꼬리 마크 블록을 사용하여 직경 2.5mm로 꼬리를 표시하십시오. 꼬리를 블록의 슬릿에 강제로 넣지 마십시오 - 꼭 맞아야합니다 (보충 그림 1)</li>
	<li>정맥 내 (즉) 투여에 최적 인 따뜻한 꼬리 정맥을 보장하기 위해 적어도 5 분 동안 식염수 튜브에 꼬리를 넣으십시오.</li>
</ol>3. 시험액의 투약
<ol><li>마취 마스크에 코가있는 꼬리 홀더에 마우스 하나를 놓습니다.</li>
	<li>동물에게 관심있는 화합물 (이 경우, rFVIII)을 투여하고 즉시 스톱워치 (t = 0)를 시작하십시오.</li>
	<li>마우스를 식염수 튜브의 꼬리가있는 가열 플레이트 위에 다시 놓습니다. 다른 마우스와 함께 절차를 반복하십시오.</li>
</ol>4. 꼬리 정맥 횡단 수행
<ol><li>투여 후 정확히 5 분 후에 꼬리 정맥 transection을 수행하십시오. 꼬리를 절단 블록에 놓고 90° 회전하여 정맥을 노출시킵니다(보충 그림 2).</li>
	<li>시험 용액이 투여 된 곳에서 반대쪽 / 정맥에서 절단을 수행하십시오.</li>
	<li>꼬리를 잡고있는 절단 블록의 슬릿을 통해 # 11 메스 블레이드를 그려 출혈을 일으 킵니다. 스톱워치를 재설정하고 꼬리를 즉시 식염수로 되돌립니다.</li>
</ol>5. 관찰 시간과 도전 과제
<ol><li>출혈을 관찰하고 40 분 동안 출혈의 시작과 중지에 주석을 달으십시오. 혈류 표기법 용지에 주석을 달으십시오. 참고 : 출혈에 대한이 시각적 평가는 주관성으로 인해 약간 다를 수 있습니다.</li>
	<li>일차 출혈은 절단이 이루어진 후 3 분 이내에 중단되어야합니다. 그렇지 않은 경우, 마우스를 실격시키고, 안락사시키고, 교체한다(원발성 출혈을 중단하지 않으면 vWF KO 마우스에서와 같이 너무 심한 손상 또는 원발성 지혈 결여를 나타낼 수 있다).</li>
	<li>부상 후 10 분, 20 분 및 30 분에 출혈이 없으면 4-5 단계에 설명 된대로 꼬리 절단에 도전하십시오.</li>
	<li>수조에 보관 된 별도의 튜브에서 따뜻한 식염수에 담근 거즈 면봉을 사용하십시오. 식염수에서 꼬리를 들어 올리고 젖은 거즈로 꼬리 컷 위의 원위 방향으로 부드럽게 두 번 닦으십시오.</li>
	<li>각 도전 후, 즉시 꼬리를 식염수 튜브에 다시 잠급니다.</li>
	<li>t = 40 분에, 식염수 튜브에서 꼬리를 제거하여 혈액 수집을 중지하십시오.</li>
</ol>6. 혈액 샘플링
<ol><li>t = 40 분 후, 상기 상궤도 정맥으로부터 혈액 샘플을 수득한다.</li>
</ol>7. 안락사
<ol><li>자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시키는 동안 여전히 완전한 마취하에 있습니다.</li>
</ol>8. 샘플의 처리
<ol><li>15 mL 혈액 수집 튜브를 식염수로 실온에서 5분 동안 4000 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>15 mL 튜브에서 상층액을 버리고 펠렛을 적혈구 (RBC) 용해 용액 2-14 mL에 재현탁 한 다음 가벼운 커피 색상에 도달 할 때까지 희석하십시오.</li>
	<li>총 부피 (혈액의 부피 + 적혈구의 부피 (RBC) 용해 용액은 튜브의 졸업 마크를 사용하여 추가됨)에 유의하십시오.</li>
	<li>희석액 2 mL를 헤모글로빈 튜브로 옮기고 헤모글로빈 분석이 이루어질 때까지 냉장 보관한다.</li>
	<li>식염수 중의 헤모글로빈 농도를 측정하여 혈액 손실을 결정한다. 마이크로플레이트 리더 상에서 550 nm에서의 흡광도를 측정하였다(표 재료).</li>
	<li>인간 헤모글로빈으로부터 제조된 표준 곡선 (표 물질)을 사용하여 흡광도를 nmol 헤모글로빈 으로 변환하고 RBC 용해 용액으로 희석을 보정한다.</li>
</ol>9. 통계 분석
<ol><li>적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 여기에 그래프 패드 프리즘 소프트웨어가 사용되었습니다. 다양한 연구를 통해 다음과 같은 통계 방법이 잘 수행되는 것으로 나타났습니다. 참고: 혈액 손실, 출혈 시간, 노출, 혈소판 수 및 헤마토크릿을 분석하려면; Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 검정을 사용하여 (데이터는 연속적이지만 잔차의 분산 균질성이 없었기 때문에) Dunnett의 검정을 적용하여 다중 비교를 조정했습니다. Pearson의 검사는 출혈 시간, 혈액 손실 및 복용량 간의 상관 관계를 테스트하는 데 사용되었습니다. ED50 값을 결정하기 위해, 네 개의 파라미터 역로그(dose) 반응 방정식을 출혈 및 혈액 손실 데이터에 적합시켰다. 성별 효과를 분석하기 위해 양방향 ANOVA 테스트를 사용하여 Bonferroni 보정을 적용하여 다중 비교를 조정했습니다. 유의 수준은 P < 0.05로 정의되었다. 데이터는 SEM± 수단으로 표시됩니다.</li>
</ol>

저자는이 연구가 수행 된 당시 Novo Nordisk A / S의 직원 및 / 또는 주주이거나 주주였습니다.

꼬리 정맥 횡단 (TVT)의이 최적화 된 방법은 TVT 생존 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 동물은 전체 연구 기간 동안 완전히 마취되어 마우스 취급이 쉬워지고 동물 복지가 향상됩니다. 또한, TVT 생존 모델과 달리 야간 관찰이 필요하지 않으며,이 최적화 된 모델은 혈액 손실을 측정하고 40 분 동안 정확한 출혈 시간을 관찰 할 수있는 가능성을 제공합니다. 또한, 의식이있는 동물에서 출혈의 더 긴 기간은 exsanguination에 의해 사망을 야기 할 수 있으며, 동물의 고통과 고통과 아마도 스트레스로 이어질 수 있으며, 잠재적으로 증가 된 변이를 초래할 수 있습니다14. 혈액 손실과 출혈 시간은 종점으로 성공적으로 특성화되고 검증되어 사망 또는 죽음에 가까운 시간을 대체합니다. 실제 꼬리 부상은 절단 블록 가이드를 사용하여 TVT를 수행하고 재현 가능한 절단을 확보하고 절차의 어려움과 기술적 변동성을 줄이기 때문에 잘 정의되고 표준화됩니다. 따라서 더 높은 모델 견고성을 달...

동물 모델은 혈우병의 발병 기전을 이해하고 치료 요법 및 치료법을 개발하고 테스트하는 데 필수적입니다. 인자 VIII 녹아웃 마우스 (F8-KO)는 혈우병 A 1,2의 연구에 널리 사용되는 모델이다. 이들 마우스는 질병의 주요 특징을 재분석 하고, 재조합 FVIII 제품 3,4,5 및 유전자 치료 전략 6,7과 같은 치료법의 개발에 널리 사용되어 왔다.
생체내에서 상이한 지혈성 화합물의 약리학적 효과를 평가하기 위한 다양한 출혈 손상 모델이 있다. 이러한 응고 모델 중 하나는 마우스 8,9,10,11,12,13,14에서 꼬리 정맥 횡단 생존 모델이며, 꼬리 횡단 후 삼출에서 생존하는 혈우병 마우스의 능력을 측정합니다. 이 방법은 40 년 전에도입 된 15 세 이상이며 여전히 9,16,17 명이 사용됩니다. 그러나이 모델은 생존을 종점으로 활용하고 최대 24 시간 동안 동물을 관찰해야하며, 그 동안 동물은 의식이 있으므로 통증과 고통을 경험할 수 있습니다.
꼬리 클립 모델 (꼬리 끝이라고도 함)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28과 같은 더 짧은 지속 시간 및 완전 마취하의 출혈 모델은 이전에 기술되었습니다. . 그럼에도 불구하고, 출혈 챌린지 후 혈액 손실의 완전한 정상화를 위해, 이들 모델은 임상적으로 투여된 것보다 훨씬 더 높은 전구응고 화합물 (예를 들어, FVIII)의 투여량을 필요로 한다29. 마취 하의 다른 손상 모델인 베나 사페나 출혈 방법은 낮은 용량의 프로응고제 화합물30에 민감하지만 혈전이 자주 중단되어야 하기 때문에 높은 수준의 실험자 개입이 필요합니다(제시된 모델에서 3회와 반대).
새로운 프로응고제 화합물을 시험하기 위한 공통 프로토콜로의 표준화는 실험실(31,32,33) 간의 데이터 비교를 크게 촉진할 것이다. TVT 모델에서, 연구 종점 (혈액 손실7,26, 출혈 시간9,34 및 생존율35,36)에 대한 공통된 합의는 아직 없으며, 실험 길이는 연구13에 따라 다릅니다.
우리의 주요 목표는 높은 재현성, 주문형 연구 가능성, 예방 적 치료, 생존 모델과 동등한 약리학 적 개입에 대한 민감성, 그러나 죽음이나 죽음에 가까운 죽음을 종점으로 사용하지 않는 최적화 된 모델을 설명하고 특성화하는 것입니다. 고통과 고통을 줄이기 위해, 동물들은 출혈 중에 의식해서는 안되며,보다 윤리적 인 종점이 구현되어야합니다37.
꼬리 클립 모델은 일반적으로 꼬리의 끝을 절단하거나, 예를 들어, 1-5 mm 18,19,20,21,23,24의 절단 또는 더 심한 변형에서, 꼬리 직경 약 1-3 mm 8,22,25에서 횡단하는 두 가지 변형 중 하나로 수행됩니다. . 이것은 측면 및 등쪽 정맥과 복부 동맥이 일반적으로 절단되기 때문에 결합 된 동맥 출혈을 일으키며, 일반적으로 절단이 클수록 procoagulant 화합물에 대한 민감도가 낮아집니다. 또한, 꼬리 끝이 절단되기 때문에, 동정맥 손상은 반대 조직없이 노출됩니다. 따라서, 적어도 이론적으로는, 가장 흔한 혈우병 출혈과 다르다.
이름에서 알 수 있듯이,이 논문에 설명 된 것과 같은 꼬리 정맥 횡단 모델에서 정맥 만 손상되어 독점적으로 정맥 출혈이 발생합니다. 혈관이 완전히 절단되지 않았기 때문에, 손상은 절단 모델에서보다 작을 것으로 예상되며, 혈전이 부착 될 수있는 절단 주위의 조직은 유지됩니다. 또한, 동맥과 반대로 정맥에 낮은 혈압이 있습니다. 이러한 요인들은 절단 모델에 비해 증가된 민감성에 기여하여, 출혈의 정상화가 임상적으로 관련된 대체 요법의 투여량, 예를 들어, 혈우병 A의 rFVIII를 사용하여 달성될 수 있도록 하며, 이는 전구응고제 치료 26,38,39의 효과의 크기 및 내구성을 평가하는데 유용하다.

<table><tbody><tr><td>#11 메스 블레이드</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심 분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-One, 오스트리아</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro에 연결된 30 G 바늘; 투여용 L 정밀도(인슐린) 주사기</td><td>BD Micro-Fine + U-100 인슐린 주사기</td><td>320830</td><td></td></tr><tr><td>Advate</td><td>Takeda, 일본</td><td></td><td>재조합 인자 VIII 대체 요법(rFVIII)</td></tr><tr><td>알코올 패드 70% 에탄올</td><td>Hartmann, Soft-Zellin</td><td>999 979</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>절단 템플릿(스테인리스강)</td><td>자체 제작, 정확한 도면에 대한 저자에게 문의를 환영합니다</td> 보충 그림 2 : 크기 사양 : 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H).<td></td><td> 홈: 깊이 3mm 및 너비 3mm; 반경 1.5mm</td></tr><tr><td>적혈구(RBC) 용해 용액</td><td>Lysebio, ABX 진단</td><td>906012</td><td></td></tr><tr><td>거즈</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈액 분석기</td><td>Sysmex</td><td>CT-2000iv</td><td></td></tr><tr><td>스탠드에 가열 램프</td><td>Phillips</td><td>IR250</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절기가 있는 가열 패드</td><td>CMA</td><td>모델 150</td><td></td></tr><tr><td>헤모글로빈 표준 및 제어 - 8.81mmol/l 배치 종속</td><td>HemoCue, 덴마크</td><td>HemoCue 교정기, 707037</td><td>표준 및 제어는 HemoCue 교정기의 2가지 다른 유리로 만들어집니다. 이 값은 ICSH(International Reference Method for Hemoglobin)에 따라 결정됩니다.</td></tr><tr><td>튜브, 마스크 및 인덕션 박스가 완비된 이소플루오란 마취 시스템</td><td>시그마 델타 다메카</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>박스터</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>조명이 있는 돋보기</td><td>Eschenbach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>측정 템플릿(알루미늄)</td><td>자체 제작, 정확한 도면</td><td></td><td>에 대한 저자에게 문의할 수 있습니다.보충 그림 1: 크기 사양: 20mm x 40mm x 10mm(L x B x H). 홈: 깊이 2.5mm 및 너비 2.5mm; 반경 1.25 mm</td></tr><tr><td>마이크로 피펫 + 팁</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광도계</td><td>Molecular Devices Corporation, CA, USA</td><td>SpectraMax 340 광도계</td><td></td></tr><tr><td>프리즘 소프트웨어</td><td>GraphPad, San Diego, CA, USA</td><td>버전 9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>식염수 0.9 % NaCl</td><td>Fresenius Kabi, Sweden</td><td>883264</td><td></td></tr><tr><td>TVT 테일 컷</td><td></td><td>을위한 특수 테일 마커 블록</td><td></td></tr><tr><td>테일 홀더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 액체 흡입</td><td>Vacusafe comfort, IBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조 및 온도 조절기</td><td>TYP 3/8 Julabo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

꼬리 정맥 transection 출혈 모델 완전 마취 혈우병 a 마우스에서

Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice

꼬리 출혈 모델은 혈우병 연구에서 중요한 도구이며, 특히 procoagulant 효과의 평가를위한 것입니다. 꼬리 정맥 transection (TVT) 생존 모델은 FVIII의 임상 관련 용량에 대한 민감성으로 인해 많은 설정에서 선호되는 반면, 꼬리 클립 모델과 같은 다른 확립 된 모델은 더 높은 수준의 프로응고제 화합물을 필요로합니다. 생존을 종점으로 사용하지 않기 위해, 우리는 전체 실험 동안 혈액 손실과 출혈 시간을 종점 및 완전 마취로 확립하는 TVT 모델을 개발했습니다. 간단히 말해서, 마취 된 마우스는 꼬리가 온대 식염수 (37 ° C)에 잠겨있는 채로 위치되고 오른쪽 측면 꼬리 정맥에 시험 화합물과 함께 투여됩니다. 5 분 후, 왼쪽 측면 꼬리 정맥은 템플릿 가이드를 사용하여 횡단되고, 꼬리는 식염수로 되돌아 가며, 혈액을 수집하는 동안 모든 출혈 에피소드를 모니터링하고 40 분 동안 기록합니다. 부상 후 10 분, 20 분 또는 30 분에 출혈이 발생하지 않으면 젖은 거즈 면봉으로 절단을 두 번 닦아 혈전을 부드럽게 도전합니다. 40분 후, 혈액 손실은 식염수로 피흘린 헤모글로빈의 양에 의해 정량화된다. 이 빠르고 비교적 간단한 절차는 일관되고 재현 가능한 출혈을 초래합니다. TVT 생존 모델과 비교할 때, 약리학 적 개입에 대한 민감성을 손상시키지 않고보다 인간적인 절차를 사용합니다. 또한 두 성별을 모두 사용하여 3R의 원칙을 준수하여 사육해야하는 동물의 총 수를 줄일 수 있습니다. 출혈 모델의 잠재적 한계는 지혈의 확률적 특성이며, 이는 모델의 재현성을 감소시킬 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 수동 혈전 파괴는 모니터링 중에 혈전이 도전 받도록 보장하여 원발성 (혈소판) 지혈이 출혈을 멈추게합니다. 출혈 손상 모델의 카탈로그에 추가된이 추가는 표준화되고 인도적인 방식으로 procoagulant 효과를 특성화하는 옵션을 제공합니다.

최적화된 모델의 적용가능성을 평가하기 위해, 시판되는 재조합 인자 VIII 대체 요법 (rFVIII)을 투여한 F8-KO (C57BL 유전적 배경) 마우스에서 연구를 수행하였다; 네 가지 다른 복용량이 테스트되었습니다 : 1 IU / kg, 5 IU / kg, 10 IU / kg 및 20 IU / kg. 또한, C57BL 마우스를 양성 대조군으로 사용하여 F8-KO 마우스 및 야생형(WT) 그룹에서 상응하는 비히클(음성) 대조군을 시험하여 모델에서의 반응 범위를 평가하였다.
최적화된 프로토콜에 이어서, 비히클 그룹에 비해 rFVIII 치료군에 대한 혈액 손실의 현저한 감소가 있었다. 또한, 비히클 그룹에 비해 5 IU/kg, 10 IU/kg 및 20 IU/kg 치료 그룹에서 출혈 시간의 감소가 관찰되었다(그림 2). WT 마우스에서 총 혈액 손실은 201.8-841.9 nmol Hgb (95 % CI)이고 비히클 마우스의 범위는 5335 ~ 7148...

마취된 마우스에서의 정제된 꼬리 정맥 횡단절(TVT) 출혈 모델은 혈우병성 출혈의 평가를 위한 민감한 생체내 방법이다. 이 최적화 된 TVT 출혈 모델은 혈액 손실과 출혈 시간을 종점으로 사용하여 다른 모델을 정제하고 사망을 종점으로 피합니다.

꼬리 정맥 transection 출혈 모델 완전 마취 혈우병 A 마우스에서

Tail bleeding models are important tools in hemophilia research, specifically for the assessment of procoagulant effects. The tail vein transection (TVT) ...

꼬리 출혈 모델은 실험 간의 재현성을 보장하기 위해 생체 내에서 지혈 화합물의 약리학 적 효과를 평가하는 중요한 도구가 될 수 있습니다. 다른 민감한 출혈 모델과 비교할 때, 우리 모델은 생존 대신 혈액 손실과 출혈 시간을 종점으로 사용합니다. 또한이 모델은 마취하에 수행되므로 동물의 통증과 고통을 줄입니다.이 기술은 혈우병 및 기타 응고 장애에 대한 전임상 연구에 특히 유용한데, 이는 손상 후 혈액이 응고되고 출혈을 멈추는 능력을 측정하기 때문입니다. 우리는이 모델을 광범위하게 사용하여 혈우병 A 마우스를 사용하여 새로운 혈우병 치료법을 개발하기 위해 procoagulant 화합물을 테스트했습니다. 그러나, 혈우병이 항-인자 VIII 항체로 유도되는 다른 혈우병 마우스 균주, 또는 마우스가 또한 사용될 수 있다.실험을 시연하는 것은 내 실험실의 전문 기술자 인 Sarah와 Dennis가 될 것입니다. 마우스를 마취 한 후 가열 플레이트에 놓고 코가 코 원뿔에 있는지 확인하십시오. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 적절한 눈 연고를 바르십시오.꼬리 마크 블록을 사용하여 꼬리를 직경 2.5mm로 표시하고 꼬리를 슬릿에 밀어 넣지 않도록주의하고 꼭 맞는지 확인하십시오. 그런 다음 꼬리를 적어도 다섯 분 동안 식염수 튜브에 넣어 정맥 내 투여에 최적 인 따뜻한 꼬리 정맥을 확보하십시오. 필요한 경우, IV 투약은 다섯 분 후에 수행 할 수 있습니다.그런 다음 열 손실을 줄이기 위해 마우스 위에 플라스틱 덮개를 놓습니다. 시험액 투약 후 5분 동안 꼬리를 잠근 상태로 두고, 꼬리를 절단 블록에 놓고 90도 돌려 정맥을 노출시켜 꼬리 정맥 횡단을 수행한다. 시험 용액이 투여 된 곳에서 반대쪽으로 절단하십시오.꼬리를 잡고 절단 블록의 슬릿을 통해 숫자 11 메스 블레이드를 그려 출혈을 일으 킵니다. 그런 다음 즉시 꼬리를 식염수로 되돌리고 스톱워치를 재설정하십시오. 출혈은 즉시 볼 수 있어야합니다.꼬리를 식염수에 담그는 것은 자유 공기에서 빨리 멈출 수 있기 때문에 지속적인 출혈에 중요합니다. 출혈을 관찰하고 혈류 표기법에 40 분 동안 출혈의 시작과 중지에 주석을 달으십시오. 절단이 이루어진 후 삼 분 이내에 원발성 출혈이 멈추지 않으면 마우스를 실격시키고 교체하십시오.이 출혈은 절단이 너무 깊거나 마우스가 원발성 지혈이 부족하다는 것을 나타낼 수 있습니다.출혈이 없으면 꼬리 절단에 도전하십시오, 부상 후 10, 20, 30 분. 젖은 거즈 면봉을 사용하고 따뜻한 식염수를 사용하여 꼬리를 식염수에서 들어 올리고 젖은 거즈로 꼬리 컷 위의 원위 방향으로 부드럽지만 단단히 두 번 닦으십시오. 각 도전 후에 꼬리를 식염수 튜브에 즉시 다시 잠급니다.실험이 끝나면 식염수에서 꼬리를 제거하고 원하는 경우 혈액 샘플을 수집하며 완전 마취 상태에있는 동안 마우스를 안락사시킵니다. 15-밀리리터 혈액 수집 튜브를 실온에서 5분 동안 4, 000배 G에서 식염수로 원심분리한다. 튜브에서 상청액을 버리십시오.펠렛을 두 밀리리터의 적혈구 용해 용액에 재현탁하십시오. 그런 다음 밝은 커피 색상에 도달 할 때까지 최대 12 밀리리터의 용해 용액으로 희석하십시오. 총 부피를 주목하고 희석액의 두 밀리리터를 헤모글로빈 튜브로 옮깁니다.헤모글로빈 분석이 이루어질 때까지 냉장 보관하십시오. 재조합 응고 인자 VIII 처리군에 대한 혈액 손실의 현저한 감소가 최적화된 프로토콜을 사용하여 관찰되었다. 킬로그램 당 20 국제 단위는 출혈을 완전히 정상화했으며, 킬로그램 당 10 IU는 상당한 효과를 일으켜 혈액 손실을 야생형 범위의 상한까지 거의 줄였습니다.출혈 시간에 대해 유사한 결과가 관찰되었다. 킬로그램 그룹당 5, 10 및 20 IU에서 감소가 관찰되었으며, 킬로그램 그룹당 20 IU에서 완전히 정상화되었다. 야생형 마우스에서, 총 혈액 손실은 헤모글로빈의 200 내지 840 나노몰 범위였고, 비히클 마우스에서는 헤모글로빈의 5, 300 내지 7, 100 나노몰이었다.평균 출혈은 비히클 처리된 마우스에서 5, 200 나노몰, 및 킬로그램 그룹당 20 IU에서 720 나노몰이었다. 야생형 마우스의 출혈 시간은 1분에서 9분 사이였으며 킬로그램당 10 및 20IU의 투여량 수준은 출혈 시간을 이 범위 내로 줄였습니다. 혈액 손실과 출혈 시간 사이의 강한 상관 관계가 결합 된 데이터에서 관찰되었습니다.기록된 모든 출혈 에피소드는 각각의 개별 마우스에 대해 경험된 출혈의 길이와 수의 시각화를 제공하기 위해 플롯팅되었다. 비히클 그룹에서, 두 번째 도전 후에, 대부분의 동물들은 실험이 끝날 때까지 출혈을 계속한다. 혈장 인자 VIII 농도의 측정은 혈액 손실 및 출혈 시간을 감소시키는데 관찰된 효과가 재조합 인자 VIII 농도 의존적임을 확인하였다.혈소판 수는 눈에 띄게 영향을 받지 않았으며 헤마토크릿 수치는 중간 및 더 높은 재조합 인자 VIII 투여량을 투여받은 동물에서는 정상 범위 내에 있었지만, 비히클 및 킬로그램 그룹당 하나의 IU와 같이 광범위하게 피를 흘린 동물에서는 상당히 낮았다. 심한 출혈을 경험하는 동물에서는 혈액 수, 특히 총 헤모글로빈 또는 헤마토크릿에 미치는 영향이 경미하게 발생할 수 있습니다. 이 최적화 된 모델에서 성별의 효과를 평가하기 위해 혈액 손실 및 출혈 시간 결과 모두 성별 및 복용량을 요인으로 사용하여 양방향 ANOVA 분석을 실시했습니다.이 결과는 치료에 대한 반응이 성별마다 다르지 않다는 것을 나타냅니다. 꼬리의 올바른 마킹과 절단을 만드는 것은 출혈이없는 경우 도전과 마찬가지로 기술에서 신뢰성과 재현성을 보장하는 데 필수적인 단계입니다. 또한, 동물의 체온의 양호한 마취 유도 및 유지는 특히 적절하다.우리는 또한이 모델을 사용하여 출혈을 유도 한 후 10 분 후에 인자 VIIA로 치료하여보다 주문형과 유사한 환경에서 확립 된 출혈의 중지를 조사했습니다.

tail-vein-transection-bleeding-model-fully-anesthetized-hemophilia

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출혈성 쇼크 모델은 외상 후 염증 및 최종 장기 손상과 관련된 신호 폭포의 식별 및 이해를 용이하게 안정적이고 재현성 자원을했습니다. 이 문서는 생쥐의 출혈성 쇼크 실험 절차와 관련된 수술 및 기계적 측면의 단계별 설명을 제공합니다.

고정 볼륨 또는 고정 압력 : 출혈성 쇼크의 Murine 모델

이 프로토콜에서 설명하는 생쥐에서 했습니다만 출혈의 autologous 혈액 주입 모델은 바늘 트랙까지 혈액 역류, 펌핑 시스템에서 anticoagulants의 위험을 최소화하기 위해 이중 사출 기술을 사용하고, 시스템의 모든 죽은 공간 및 확장 튜브를 제거합니다.

마우스에서 자연 했습니다만 출혈을 모델로 Autologous 혈액 주입

intracerebral 출혈 (ICH)의 임상 관련 동물 모델은 출혈성 뇌졸중에 대한 지식을 확장하고 새로운 치료 전략을 검토 필요합니다. 본 연구에서는, 우리는 설명과 쥐의 기저 신경절 (코퍼스 striatum)에 autologous 전체 혈액이나 세균 collagenase 하나의 일방적 주사를 구현하는 두 ICH 모델을 평가합니다.

마우스의 모델링 Intracerebral 출혈 : Autologous 혈액이나 세균 Collagenase의 주입

윌리스 천공의 관내 서클 지주막 하 출혈의 표준화 된 마우스 모델을 설명한다. 선박 천공 및 지주막 하 출혈은 두개 내 압력 모니터링에 의해 모니터링된다. 또 각종 중요한 파라미터는 기록 및 생리적 조건을 유지하도록 제어된다.

지주막 하 출혈의 생쥐 모델

우리는 혈전 형성을 폐쇄하는 시간을 모니터링하는 생체 내에 현미경을 사용하여 효율적 특징으로하는 정제 된 철 클로라이드 (50ml을) 경동맥 및 장간막 동맥에 유도 된 혈전증 모델의 절차뿐만 아니라 정맥을보고한다.

철 염화물에 의한 쥐 혈전증 모델

외상 환자 중 사망의 중요한 원인 인 통제되지 않는 출혈은 쥐 모델에서 표준 간 열화를 사용하여 모델링 할 수 있습니다. 이 모델은 일관된 혈액 손실, 생존을 가져오고 지혈제를 검사 할 수있게합니다. 이 기사에서는이 중요한 모델을 수행하기위한 단계별 프로세스를 제공합니다.

실시간 혈류 역학 모니터링을 이용한 마우스의 간경화로 모델링 된 통제 할 수없는 출혈성 쇼크

우리가 설명 여기에 열 등 한 베 나 정 맥 협 착 증 깊은 정 맥 혈전 증의 murine 모델. 이 모델이 혈액 흐름 제한, 인 간에 있는 정 맥 혈전 증의 주요 트리거 중 하나.

열 등 한 베 나 정 맥의 협 착 증: 깊은 정 맥 혈전 증의 Murine 모델

우리는 이 프로토콜에서 시스테나 마그나에 자가 전혈을 이중 으로 주입하여 표준화된 지주막 출혈(SAH) 마우스 모델을 기술하였다. 이중 주사 절차의 높은 수준의 표준화는 사망률에 관한 상대적 안전과 SAH의 중간-급성 모델을 나타낸다.

수브라크누드 출혈의 모델로 시스테나 마그나에 혈액을 이중 직접 주입

이 논문은 정맥 결찰을 달성하기 위해 혈관 클립을 사용하여 마우스 암 모델에서 정맥 혈전증을 평가하기 위한 최적화된 방법을 제시하는 것을 목표로 합니다. 최적화는 혈전증 관련 측정의 변동성을 최소화하고 인간 암 관련 정맥 혈전증과의 관련성을 향상시킵니다.

암의 마우스 모델에서 정맥 혈전증 분석

이 연구는 돼지의 겨드랑이 접합 출혈에 대한 하이브리드 정량적 모델을 제시하여 병원 전 지혈 중재 평가를 강화합니다.

돼지의 겨드랑이 접합 출혈에 대한 새로운 하이브리드 정량 평가 모델

본 연구는 쥐 동맥에서 효과적인 지혈 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다.

마우스 동맥 내 지혈을 위한 간단하고 효과적인 절차

학습하세요 혈우병 A 마우스에서 꼬리 정맥 절단 출혈 모델을 이용한 생체 내 약리학적 평가 방법을. 이 최적화된 기술은 출혈 시간과 혈액 손실을 측정하여 혈우병 치료제 개발에 활용됩니다.

꼬리 정맥 transection 출혈 모델 완전 마취 혈우병 A 마우스에서

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