살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

형광 간 상관 분광법은 살아있는 세포에서 G 단백질 결합 수용체의 동적 서명을 정확히 파악하기 위해 시간 결과 형광을 사용하는 통계적 방법입니다. 여기에서, 우리는 베타-2 부전 수용체에 특히 관심이 있습니다. 스핑크고립지 수용체는 주로 번역 확산 역학에 대한 정보를 제공하고 형광 성 이방성 또한 회전 확산의 도움으로.

추가 라벨을 도입함으로써, 우리는 또한 프로브로 라벨 사이의 공명 에너지 전송을 육성하는 경우 친 결합 또는 심지어 형성 변화를 할 수 있습니다. 정량적 시간 해결 형광은 설정 및 교정 측정의 신중한 정렬이 필요합니다. 다음 분에서, 우리는 클론 유동성 태그 및 합성 유동력을 사용하여 G 단백질 결합 수용체의 생명 세포 형광 상관 분광, 교차 상관 분광법 및 포스터 공명 에너지 전송에 대한 실험 가이드를 제공 할 것입니다.

세포 앉아서 전균은 멸균 조건하에서 수행될 필요가 있습니다. 깨끗한 커버 슬립 바벨을 6개의 웰 배양 판에 놓고 멸균 인산염 완충식 식염수로 씻어 내고, 페놀 레드가 10% 태아 소 세럼, 100 마이크로그램, 아민 페니실린 당 100 마이크로그램, ml 연쇄상 절제술당 100 마이크로그램을 첨가하여 멸균 인산완충소 식염수로 씻어 내세요. 페놀 레드가 37도에서 섭씨 37도에서 동일한 배지로 배양되는 CHO 세포를 5% CO2에서 5mL PBS로 세척하여 죽은 세포를 제거합니다.

트립신 2mL을 넣고 실온에서 2분간 배양합니다. 페놀 레드로 8mL의 매체로 데이터 셀을 희석하고 파이펫팅하여 조심스럽게 섞습니다. Neubauer 챔버에서 세포를 계산하고 커버 슬립을 포함하는 6 개의 잘 배양 판에서 잘 당 150, 000 세포의 밀도로 세포를 앉습니다.

세포가 대략 80%의 수렴성을 달성하기 위해 24시간 동안 인큐베이터에서 자랄 수 있도록 하십시오. 원하는 벡터 DNA의 2마이크로그램을 희석시. 예를 들어 CT SNAP 또는 NT SNAP 및 그 형질 산의 6 마이크로리터는 두 개의 별도의 튜브로 시약을 삽입합니다.

각각 500 마이크로리터를 함유하고 있는 각 우물에 대한 혈청 배지를 감소시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 두 솔루션을 함께 섞어 트랜스펙트 혼합물을 얻고 실온에서 20분 더 배양합니다. 그 동안, 멸균 PBS로 한 번 앉아 CHO 세포를 세척.

PBS를 페놀 레드 프리 배지 의 웰당 1ml로 대체하고, 10%의 태아 소 세럼과 항생제가 없는 것으로 보충됩니다. 1 ml 의 전체 건설 혼합물을 각 우물에 현명하게 넣고 5 % CO2에서 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 라벨링을 위해, 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 1mL 배지에서 적절한 SNAP 기판을 희석하여 1개의 마이크로몰러의 최종 농도를 얻습니다.

PBS로 감염된 세포를 한 번 세척하고 하나의 마이크로 몰러 SNAP 기판 용액의 웰 당 하나의 mL을 추가합니다. 5% CO2에서 37도에서 20 분 동안 세포를 배양하십시오. 페놀 레드 프리 배지로 세 번 씻어 내고, 페놀 레드 프리 배지당 2mL를 추가합니다.

5% CO2에서 섭씨 37도에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오. 이후 모든 샘플의 커버 슬립을 이미징 챔버로 옮기고 500 마이크로리터 이미징 버퍼로 세척합니다. FRED FCS 설정으로 이동하기 전에 500개의 마이크로리터 이미징 버퍼를 추가합니다.

FRED FCS 설정에는 공초점 현미경 물 목표, 두 개의 레이저 라인, 시간 퀼터 단일 외국 카운팅 시스템, 2개의 하이브리드 BMT 및 광자 수집 및 데이터 수집 소프트웨어를 위한 2개의 주식이 장착되어 있습니다. 라이브 셀에서 측정하기 전에 매번 설정을 정렬하는 것이 매우 중요합니다. 초점, 핀홀 및 착색 위치를 조정하기 위해 2개의 나노몰러 녹색 교정 용액을 유리 커버 슬립에 놓고 더미, 인터리브 된 여기 또는 PI 모드에서 작동하는 485 나노미터 및 560 나노 미터 레이저에 스위치를 놓습니다.

최대의 분자 밝기를 얻기 위해 가장 높은 카운트 속도와 가장 작은 공초점 볼륨을 얻을 수 있도록 용액에 초점을 맞추고 핀홀과 칼라 링 위치를 조정합니다. 10 나노 몰레드 교정 용액과 둘 다의 혼합물로 빨간색 채널에 대해이 프로세스를 반복하십시오. 유리 커버 슬립에 10 나노 몰러 DNA 용액을 배치하고, 녹색과 빨간색 검출 채널 사이의 교차 색상이 가장 높은 있도록 핀홀과 칼라 링 위치의 초점을 조정합니다.

즉, 소스가 가장 높은 진폭입니다. 살아있는 세포에서 측정을 위해 마커 램프로 제한하고 안구를 통해 관찰하여 적합한 셀을 찾습니다. PI 모드에서 레이저를 모두 켜고 초당 최대 카운트를 찾아 멤브레인에 집중하십시오.

셀 샘플의 경우 레이저 전력을 줄여야 할 수 있습니다. 바람직하게는 객관적으로 5 마이크로와트 미만. 이것은 사용되는 꽃과 설정에 매우 의존합니다.

데이터 수집 소프트웨어의 온라인 미리 보기에서 EGP에 바인딩된 베타-2 AR의 자동 및 크로스 콜 커브를 관찰하고 60~180초 사이의 획득 시간으로 여러 정렬 측정을 수집합니다. 상관 관계 과정과 대비를 모든 측정값과 내보냅니다. 프롬프트 및 지연 시간 창을 올바르게 정의하고 데이터 상관 소프트웨어에서 옵션을 얻는 몇 가지 마이크로 시간을 사용하십시오.

전체적으로 세 가지 상관 관계가 필요합니다. 녹색 채널 프롬프트 시간 창의 자동 상관 관계입니다. 빨간색 채널과 지연 시간 창의 자동 상관 관계입니다.

그리고 마지막으로 녹색 채널 신호의 교차 상관관계, 그리고 프롬프트 시간 창은 지연 시간 창에서 빨간색 채널 신호였다. 다음은 솔루션용 녹색 및 빨간색 FRED의 자동 상관 기능이며 B가 곡선의 기준선과 분자 및 초점 수인 두 개의 사용 색상 채널에 대한 공초점 검출 볼륨의 모양과 크기를 보정하는 데 필요한 추가 삼중 용어와 함께 3 DT 확산 모델에 적합합니다. 확산 시간 및 S, 오메가 0 이상 0은 공초점 볼륨 요소의 형상 계수를 TD합니다. 삼중 깜박임 및 사진 물리학은 진폭 AR 및 릴렉스 타임 TR으로 설명됩니다. 녹색 및 적색 교정에 대해 알려진 확산 계수를 사용하여 눈에 띄는 모양 요소를 사용하여 감염성 공초점 볼륨 요소의 치수 및 부피를 결정합니다.

IFR, 채널 제로에서 수집된 녹색 형광 신호, 오른쪽 감지 채널, 채널 1 및 3에 대한 스펙트럼을 배경 수집 신호의 비율로 계산합니다. 빨간 레이저에 의한 지연 시간 창 에서 바로 배경에 녹색 레이저에 의해 빨간색 교정 측정 및 프롬프트 타임 윈도우 여기의 눈금의 대조를 수집 배경의 비율에 의해 기증자 여기 파장에 의해 데이터의 수용자 흐름의 직접적인 기대를 결정한다. B의 분자 밝기를 모두 녹색과 적색 유동력으로 계산하여 대조를 수집한 배경을 기반으로 분자 수를 얻고 3DT 확산 적합성에 집중한다.

녹색 및 빨간색 채널에서 두 가지 극성 상관관계를 모두 맞출 뿐만 아니라 이중 레벨 DNA의 녹색 프롬프트 및 적색 지연에서 3 DT 확산 모델에 대한 상관 관계를 통해 자동 상관 관계 기능에 대해 획득 된 모양의 요소를 일정하게 유지합니다. 교차 상관 관계 함수의 셰이프 요소는 일반적으로 이러한 두 값 사이에 있습니다. 분자 및 초점 의 명백한 수의 글꼴 값에 따라 0 상관 시간에 진폭을 결정합니다.

시료의 진폭 비율을 계산하는 것은 녹색 및 빨간색 바닥력의 100% 공동 확산이었다. 셀 샘플을 적절한 모델에 맞춥시게 합니다. 그들은 이중 모달 방식으로 호기심이 없는 막 수용체 확산을 어떻게 보여주는지는 짧고 긴 확산 시간이 아니었습니다.

또한, 사진 물리학 및 바닥 힘 밖으로 깜박이는 고려되어야한다. TD1 및 TD2는 확산 시간을 위해 필요한 두 가지입니다. 그리고 하나의 첫 번째 확산 시간의 분획자유 주사위와 DNA 가닥 확산, 모든 방향, 멤브레인 수용체가 세포막을 따라 2D 확산만 표시되는 교정 측정과 는 대조적으로 분자 수와 초점의 관점에서 녹색 또는 적색 라벨 단백질의 농도를 계산한다.

그리고 바이어스 질량을 사용하여 공초점 볼륨 요소의 부피. 이중 표지된 샘플의 두 알토 상관관계에 는 이중 모달 확산 모델을 사용하여 단일 레벨 구조 및 교차 상관 함수와 동일한 모델을 사용하여 이중 표지된 샘플의 상관관계를 조정하여 시스템의 글로벌 설명을 참고한다. 세 가지 작물은 모두 공동으로 적합해야 합니다.

확산 기간은 세 작물 모두에 대해 동일합니다. 그리고 유일한 차이점은 평판 시간이 떨어지고, 교차 상관 관계 함수입니다. 각각의 분자 수와 초점 및 공초점 부피 원소의 부피로부터 녹색 또는 적색 노동 단백질의 농도를 계산합니다.

DNA 샘플로부터 얻은 교정 인자, 세포 샘플의 진폭 비 및 각각의 얻어진 농도를 사용하여 세포 샘플에서 상호 작용하는 녹색 및 빨간색 라벨 단백질의 분획 또는 농도를 추정한다. AF가 각각의 진폭 및 이완 시간을 전체 항 상관관계 및 AR 및 TR의 진폭을 반영하는 항 상관 용어를 포함하는 이중 모달 확산 모델에 대한 단일 표지된 샘플 및 전면 교차 상관관계로서 FRED 샘플의 두 가지 상호 상관관계를 맞춥시다. FRED 하나 또는 여러 개의 항 상관 관계 조건으로 인한 상관 관계가 방지된 형광 변경이 필요할 수 있으며, 이로 인해 두 개의 자동 상관 관계 함수의 상승과 일치하는 낮은 상관 시간에 프레드 교차 상관 관계 기능이 급락하게 됩니다.

녹색 과 빨간색 꽃 솔루션의 보정 측정은 6.5 및 녹색 채널의 요소를 면도하고 빨간색 채널에서 6.8을 면도합니다. 따라서, 공초점 부피는 이 측정일에 나중에 1.4 및 1.9 펨토의 크기를 가지며, 분자 밝기는 분자당 12.5 킬로헤르츠, 분자당 2.6 킬로헤르츠에 있다. 우리는 기증자 의 흥분 후 붉은 채널로 녹색 꽃에서 크로스 토크의 15 %를 가지고 있으며, 우리의 DNA 측정에서, 우리는 공초점 중첩 볼륨에 대한 교정 인자를 결정0.6 과 0.7 너무, 단일 라벨 구조로 전관 된 세포는 대략 반 분자의 확산에 이중 모달 차원 2 입헌을 보여줍니다. 50~100밀리초 의 시간 척도와 나머지 절반은 두 구문에서 약 2밀리초 정도 비교적 빠릅니다.

또한 삼중 깜박임이 존재합니다. 그러나, 빨간색 레벨 스냅 에서 또 다른 휴식 시간에 취득 180 마이크로 초, 이는 바로 언바운드 스냅에서 유래 할 수있다. 이중 라벨 자체에서, 세포막의 두 개의 서로 다른 측면에 두 개의 라벨이 있는 안티 스냅 구조로 대회하여, 2개의 적은 측정이 노이즈와 적색 코트를 상관관계에 수집하였다.

그리고 PI 교차 상관 관계는 여기에서 매우 높습니다. 여기서 분자의 70%는 백 밀리초 시간 척도에서 천천히 30% 빠르며, 이중 해방 분자의 분수는 낮고 CT 스냅에 대한 데이터가 더 잘 보이며 덜 시화됩니다. 그러나, 예상되는 전방 깊은 안티 상관관계는 높은 양의 크로스토크에 의해 질량이 가장 높고, 두 꽃의 직접 적인 외침과 삼중 깜박임, 수집된 형광 강도 DKS를 이용한 데이터 분석 방식이 모의 데이터 세트에 도시된 바와 같이 이를 구출하는 데 도움이 될 수 있다.

Fred FCS 기술의 장점은 이동성과 함께 GPCR의 컨퍼런스 역학을 조사 할 수 있다는 것입니다. 그러나 실험실에서 FRED FC를 수행하는 것은 어렵고 우수한 전세포, 효율적인 라벨링 및 완벽한 교정 설정을 요청합니다. 그냥 프레드 쌍 프로 힘도 매우 중요합니다.

중요한 실험 단계에는 경질 최적화, 배경 최소화 및 자동 형광이 포함됩니다. 또한 원자 분석 파이프 라인은 살아있는 세포에서 preceptors의 다양한 역학을 이해하는 데 도움이됩니다. 우리는이 프로토콜이 라이브 셀 실험에서 FRED FCS 접근 방식을 수행하는 데 유용 할 것으로 기대합니다.