Name: 살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: 학습하세요 살아있는 세포에서 이중 색 형광 교차 상관 분광법(FCCS)과 FRET를 결합하여 G단백질 연결 수용체의 역학과 상호작용을 정량 분석하는 방법을. CHO 세포를 이용한 이 프로토콜은 수용체 확산 동역학 연구에 강력한 프레임워크를 제공합니다.

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이 프로젝트는 도이치 포르충스게마인샤프트(SFB/TR 240, 프로젝트 번호 374031971, 프로젝트 INF)에서 J.B. 및 K.G.H.에 의해 지원되었다.
루돌프 버차우 센터의 재무 지원 및 기술 지원을 위한 핵심 유닛 형광 이미징에 감사드립니다. 또한, 우리는 철저한 증거 독서애쉬윈 발라크리슈난감사합니다.

1. 실험 프로토콜
<ol><li>샘플 준비 참고: 멸균 조건하에서 세포 종착 및 트랜스페션을 수행합니다.<ol>
<li>6웰 배양판에 잘 조리된 커버슬립을 넣고 멸균 인산염 완충식식염(PBS)으로 세 번 세척합니다. 참고: 커버슬립 클리닝 프로토콜은 보충 참고 1에자세히 설명되어 있습니다.</li>
		<li>각 우물에 페놀 레드(10% 태아소 혈청),100 μg/mL 페니실린 및 100 μg/mL 연쇄절제술을 함유한 완전한 세포 배양 배지의 2mL를 추가하고 플레이트를 제쳐두십시오.</li>
		<li>37°C 및 5% CO 2에서 페놀 레드를 함유하는 동일한 배지에서 CHO 세포를배양한다. 죽은 세포를 제거하기 위해 PBS의 5 mL로 세포를 씻어.</li>
		<li>트립신 2mL을 추가하고 실온 (RT)에서 2 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>페놀 레드를 함유한 8mL의 배지로 분리된 세포를 희석시키고 파이펫팅으로 조심스럽게 섞는다.</li>
		<li>노이바우어 챔버에서 세포를 카운트하고 커버립을 포함하는 6웰 세포 배양판에서1.5 x 10 5 세포의 밀도/잘 종자(1.1.1-1.1.2 단계에서 준비).</li>
		<li>세포가 약 80%의 인플루언서(37°C, 5%CO2)에서24시간 동안 성장하게 한다.</li>
		<li>원하는 벡터 DNA(예를 들어, CT-SNAP 또는 NT-SNAP)의 2 μg를 희석시키고 2개의 개별 튜브에서 형질 검사 시약의 6 μL을 희석하고, 각각 각 우물에 대해 500 μL의 감소된 혈청 배지를 포함하고 RT에서 5분 동안 배양한다.</li>
		<li>두 솔루션을 함께 섞어 트랜스펙트 혼합물을 얻고 RT에서 20분 동안 배양합니다.</li>
		<li>그 동안, 멸균 PBS로 한 번 시드 CHO 세포를 세척.</li>
		<li>PBS를 항생제 없이 10% FBS로 보충한 페놀 무자유 배지의 1mL/웰로 교체하십시오.</li>
		<li>전체 1mL의 형질 혼합물을 각 우물에 드롭와이즈로 추가하고 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 5% CO2로한다.</li>
		<li>SNAP 시공물의 라벨링에 대해, 1μM의 최종 농도를 얻기 위해 10% FBS로 보충된 매체의 1mL에 적절한 SNAP 기판 스톡 솔루션을 희석한다.</li>
		<li>PBS로 감염된 세포를 한 번 세척하고 1 μM SNAP 기판 용액의 웰 당 1 mL을 추가합니다. 5% CO2에서37°C에서 20분 동안 세포를 배양한다.</li>
		<li>페놀 무적 배지로 세 번 씻어 내고 페놀 무첨가 배지당 2mL를 추가합니다. 5% CO2에서37°C에서 30분 동안 세포를 배양한다.</li>
		<li>이후 모든 샘플의 커버립을 이미징 챔버로 옮기고 500 μL 이미징 버퍼로 세척합니다. FRET-FCS 설정으로 이동하기 전에 500 μL 이미징 버퍼를 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>교정 측정 참고: FRET-FCS 설정에는 공초점 현미경 수문 목표, 두 개의 레이저 라인, 시간 상관 단일 광자 카운팅(TCSPC) 시스템, 2개의 하이브리드 광증 튜브(PMT) 및 광자 수집 및 데이터 수집 소프트웨어를 위한 2개의 눈사태 포토다이오드(APD)가 장착되어 있습니다. 라이브 셀 측정 전에 매번 설정을 정렬하는 것이 매우 중요합니다. 자세한 설정 설명은 보충 참고 2에서찾을 수 있습니다. 모든 측정은 동일한 조건에서 수행해야 하므로 레이저와 모든 검출기(PMT 2개와 APD 2개)는 항상 ON입니다. 교정 측정의 경우, 셀이 시드된 것과 동일한 로트에서 커버슬립을 사용하면 칼라 링 보정의 변동이 감소합니다.<ol>
<li>초점, 핀홀 및 칼라 링 위치를 조정하기 위해 유리 커버슬립에 2nM 그린 교정 솔루션을 배치하고 485 nm 및 560 nm 레이저를 켭니다. 펄스 인터리브 엑시션(PIE)모드(16)에서레이저를 작동시한다.</li>
		<li>최대의 분자 밝기를 얻기 위해 가장 높은 카운트 속도와 가장 작은 공초점 볼륨을 얻을 수 있도록 용액에 초점을 맞추고 핀홀과 칼라 링 위치를 조정합니다.</li>
		<li>10nM 적색 보정 솔루션과 녹색 및 빨간색 교정 솔루션의 혼합물로 빨간색 채널에 대해 이 프로세스를 반복합니다.</li>
		<li>10nM DNA 용액을 유리 커버슬립에 놓고 녹색과 적색 검출 채널 간의 상관관계가 가장 높은 초점, 핀홀 및 칼라 링 위치를 조정하여 가장 높은 진폭을 나타낸다. 참고: 1.2.1 단계와 1.2.4 단계는 최적의 정렬을 찾기 위해 앞뒤로 반복해야 할 수 있습니다. 초점, 핀홀 및 칼라 링 위치가 녹색 및 빨간색 감지 채널 및 공초점 중첩 볼륨에 대해 최적으로 정렬된 후 30-120s의 각 교정 솔루션에서 3-5측정을 수행합니다.</li>
		<li>ddH2O, 이미징 배지 및 비-전지 30-120s에 대해 각각 3-5회 씩 드롭을 측정하여 배경 수 비율을 결정합니다.</li>
		<li>30-120s에 대해 3-5 측정으로 계측기 응답 기능을 수집합니다. 이것은 선택 사항이지만 매우 권장됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>라이브 셀 측정<ol>
<li>수은 램프를 비추고 안구를 통해 관찰하여 적합한 셀을 찾습니다. 참고: 적합한 세포는 각각의 부착 세포주의 전형적인 형태를 보여주는 살아 있다. 관심 있는 단백질의 형광, 여기서 표면 수용체는 표면 전체에 걸쳐 볼 수 있다. 덜 밝은 세포는 낮은 수의 분자가 초점을 맞출 때 FCS에서 더 나은 대조때문에 밝은 세포보다 더 적합합니다.</li>
		<li>PIE 모드에서 두 레이저를 모두 켜고 초당 최대 카운트를 보고 멤브레인에 집중하십시오. 참고: 셀 샘플의 경우 레이저 전력을 줄여야 할 수 있습니다(객관적으로 5 μW 미만). 이는 사용된 형광및 설정에 따라 다릅니다.</li>
		<li>데이터 수집 소프트웨어의 온라인 미리 보기에서 β2AR에 부착된 eGFP 또는 레이블이 지정된 SNAP 태그의 자동 및 상호 상관 곡선을 관찰하고 60-180s 사이의 획득 시간으로 몇 가지 짧은 측정(~2-10)을 수집합니다. 참고: 형광이 표백될 수 있기 때문에 세포를 장기간 흥분시키지 마십시오. 그러나 각 셀의 밝기, 측정 횟수 및 총 측정 횟수에 따라 달라집니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 데이터 분석
<ol><li>데이터 내보내기<ol>
<li>모든 측정에서 상관 관계 곡선,G(tc)및 카운트 비율, CR을 내보냅니다.</li>
		<li>"프롬프트" 및 "지연" 시간 창을 올바르게 정의하고 데이터 상관 소프트웨어에서 "마이크로타임 게이팅" 옵션을 사용합니다. 참고: 총 3개의 상이한 상관관계가 필요합니다: (1) 프롬프트 타임윈도우(ACFgp)에서그린 채널의 자동 상관관계( 2) 지연 시간 창(ACF rd)에서 적색 채널의 자기 상관관계(ACFrd),그리고 마지막으로 (3) 지연 시간 창(CCFPIE)에서적색 채널 신호와 함께 프롬프트 창에서 녹색 채널 신호의 상호 상관관계가 필요하다. 데이터 내보내기는 보충 참고 3에서다른 소프트웨어에 대해 단계별로 표시됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>교정 측정<ol><li>녹색(ACFgp)및빨간색(ACFrd)플루오로포어 용액의 자가상관 기능을 사용하고, 필요한 경우 추가 삼중용어(eq. 1)를 사용하여 두 개의 사용된 컬러 채널에 대한 공초점 검출 볼륨의 모양과 크기를 보정하는 3D 확산 모델에 적합합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> eq. 1 여기서, b는 곡선의 기준선, N초점 분자의 수, t D확산 시간(ms), 및 s =z0/w0의 형태 인자 공초점 체량 원소의 형태 인자이다. 삼중 깜박임 또는 기타 광물리학은 진폭에 의해 R 및 휴식 시간 tR에의해 설명된다. 참고: 프로토콜 내에서 사용되는 모든 변수와 기호가 표 1에 나열됩니다.</li>
		<li>공지된 확산 계수 D를 녹색(26) 및 적색 보정표준(27)과 얻어진 형상 인자 s녹색 및 s레드를 사용하여 공초점 볼륨 요소(eq. 2a-c)의 치수(너비 w0 및 높이 z0)및 부피 Veff를 결정한다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg">eq. 2a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg">eq. 2b <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg">eq. 2c 참고: 교정 매개 변수를 계산하기 위한 템플릿은 보충 파일(S7)으로 제공됩니다.</li>
		<li>녹색 형광 신호의 스펙트럼 크로스토크 α(채널 0 및 2에서 수집)을 적색 검출 채널(채널 번호 1 및 3)에 백그라운드 보정(BG) 신호(eq. 3)의 비율로 계산한다. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> eq. 3</li>
		<li>"프롬프트" 시간 창(녹색 레이저에 의한 여기)에서 적색 교정 측정의 배경 보정 카운트 비율의 비율에 의해 기증자 의 δ 동의어 형광의 직접 여기를 "지연" 시간 창(eq 4)에서 백그라운드 보정 카운트 비율로 결정한다. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> eq. 4</li>
		<li>3D 확산 적합성(eq. 1)에서 배경 보정 수율과 획득한 분자 수에 기초하여 녹색 및 빨간색 형광(eq. 5a-b)의 분자 밝기 B를 계산합니다( eq. 1): <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg">eq. 5a <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg">eq. 5b</li>
		<li>ACFgp와 ACFrd뿐만 아니라 이중 표지 된 DNA의 CCFPIE를 3D 확산 모델 (eq. 1)에 모두 맞춥니다. 획득한 모양 계수, 녹색 및빨간색, ACFgp 및 ACFrd의상수를 각각 유지합니다. CCFPIE,sPIE의 셰이프 요소는 일반적으로 이 두 값 사이에 있습니다. 참고: 이상적인 설정에서 Veff,녹색 및 V eff 모두 빨간색은 동일한 크기와 완벽하게 겹칩니다.</li>
		<li>0 상관 시간, G0(tc)에서진폭을 결정하며, 초점에서 분자의 명백한 수의 발견된 값에 기초하여(N녹색, N레드 및 NPIE).</li>
		<li>녹색 및 빨간색 형광의 100 % 공동 확산시 샘플에 대한 진폭 비율 rGR 및 rRG를 계산합니다 (eq. 6). NPIE는 초점에 이중 표지 된 분자의 수를 반영하지 않지만 만 1 /G0(tc)을반영한다는 점에 유의하십시오. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg">및 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg"> eq. 6</li>
	</ol></li>
	<li>라이브 셀 실험<ol><li>단일 레이블이 지정된 구문의 경우 셀 샘플을 적절한 모델에 맞춥시게 합니다. 표시된 멤브레인 수용체의 경우, 확산은 짧고 긴 확산 시간으로 양모달 방식으로 발생합니다. 또한, 형광의 광물리학 및 깜박임은 고려되어야 합니다: <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> eq. 7 여기서, td1 및 td2는 두 개의 필수 확산 시간이며, 1은 첫 번째 확산 시간의 분획이다. 참고: 자유 염료와 DNA 가닥이 모든 방향으로 자유롭게 확산되는 교정 측정과는 달리 막 수용체는 세포막을 따라 2D 확산만 을 보여줍니다. 3D와 2D 확산 의 차이는 2D 케이스의 tD가 공초점 볼륨 요소의 형상 계수에 의존하지 않는 수정된 확산 용어(eq. 1을 비교)에 의해 반영됩니다.</li>
		<li>기본 수학(eq. 8)을 사용하여 각각의 N 및 Veff에서 녹색 또는 빨간색 표지 단백질의 농도 c를 계산합니다. <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg">eq. 8 어디 NA = 아보가드로의 번호</li>
		<li>N단 SNAP 라벨 및 세포내 eGFP의 경우, 이중 표지된 샘플의 이중 라벨링 된 샘플의 두 개의 자가상관(ACFgp 및 ACFrd)에ACF(eq. 7) 및 이중 변조 모델을 사용하는 CCFPIE에 대해 동일한 모델을 사용하여 적합합니다(eq. 9) : <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg">eq. 9 참고: 시스템의 글로벌 설명의 경우, 세 곡선 모두 공동으로 적합해야 합니다: 확산 용어는 세 곡선 모두에 대해 동일하며 유일한 차이점은 CCFPIE의완화 용어입니다. 두 형광의 광물리학은 일반적으로 관련이 없기 때문에 상관 관계가 필요하지 않습니다. 이완 용어가 없으면 짧은 상관 관계에 평평한 CCFPIE가 발생합니다. 그러나, 기증자 형광로 인한 수락자의 교차토크 및 직접 흥분은 거짓 양성 진폭을 보일 수 있으며 교정 측정을 사용하기 위해 주의 깊게 검사해야합니다.</li>
		<li>방정식 8을 사용하여 각각의 N 및 Veff로부터 녹색 또는 빨간색 표지 단백질의 농도 c를 계산합니다.</li>
		<li>DNA 샘플로부터 수득된 교정 인자를 이용하여 세포 샘플로부터 녹색 및 적색 표지 단백질을 상호 작용하는 분획 또는 농도, cGR 또는 cRG,세포 샘플의 진폭 비 rGR 및 rRG 및 각각의 수득 농도(eq. 10)를 추정한다. <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"> 및 <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg"> eq. 10</li>
		<li>C-단말 SNAP 라벨 및 세포내 eGFP의 경우, FRET 샘플의 두자가상관(ACFgp 및 ACFrd)을단일 표지 샘플(방정식 7) 및 CCFFRET를 반상관 용어(방정식 11)를 포함하는 바이모달 확산 모델에 맞춥니다. <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> eq. 11 여기서f는 총 항상관 및 R 및 t R의 진폭을 각각의 진폭 및 이완 시간을 반사한다. 참고: FRET로 인한 상관 관계가 없는 형광 변화의 경우 하나 또는 여러 가지 상관관계 방지 조건이 필요할 수 있으며, 그 결과 두 가지 상관관계가 증가하는 것과 일치하는 낮은 상관 시간에 CCFFRET의 "딥"이 발생할 수있습니다(ACFgp 및 ACFrd). 그러나, 삼중 깜박임과 같은 광물리학은 FRET 유도된 항상관관계를 약화시킴으로써 반상관 용어를 가릴 수 있다는 점에 유의하십시오. 필터링된 FCS 방법으로 보완된 조인트 분석은 상관 관계 방지 용어의 마스크를 해제하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 나노초 범위에서 계수 전자 기기의 데드 타임으로부터 유래된 기술 유물은16을제외해야 한다. ChiSurf28에서 분석을 수행하는 방법에 대한 보다 상세한 단계별 절차 및 공초점 볼륨 또는 분자 밝기 계산을 위한 템플릿은 Github 리포지토리(https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS github repository)와 보충파일(보충 주 4 및 보충 주 6)에제공됩니다. 또한 .ptu 형식으로 Symphotime 소프트웨어로 획득한 데이터의 일괄 내보내기를 위한 파이썬 스크립트를 찾을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 선언할 충돌이 없습니다.

형광 분광법은 세포 맥락에서 최소한의 교란으로 단백질 역학 및 단백질 단백질 상호 작용을 정량화하는 주요 방법 중 하나입니다. 공초점 형광 상관 분광법 (FCS)은 단일 분자 민감성, 고도로 선택적 및 라이브 셀 호환1이기때문에 분자 역학을 분석하는 강력한 방법 중 하나입니다. 다른 역학 지향 접근법과 비교하여 FCS는 ~ ns에서 ~ s에 이르는 광범위한 측정 가능한 시간 범위를 가지며, 가장 중요한 것은 이미징 기반 방법으로 는 종종 접근할 수 없는 빠른 시간 척도를 포괄합니다. 더욱이, 또한 막, 세포질 및 핵 분자 역학이 쉽게 구별될 수 있도록 공간 선택성을 제공한다 2. 따라서, 분자 깜박임, 평균 국부 농도 및 확산 계수는 FCS로 정량적으로 분석될 수 있다. 결합과 같은 분자 역학은 이중 색 접근법에서 형광 간 상관 분광법(FCCS) 분석3,4,5에서 두 분자 종의 공동 확산을 프로빙할 때 쉽게 접근할 수 있게 된다.
상관 분광법의 주요 기본 원리는 레이저 초점 안팎에서 확산되는 형광표시 생체 분자에 의해 방출되는 강도 변동의 통계적 분석이다(도1A). 결과 자동 또는 상호 상관 함수는 곡선 피팅에 의해 더 분석하여 결국 이자율 상수를 도출할 수 있습니다. 즉, 통계적 방법 FCS 및 FCCS는 단일 입자 추적과 같은 단일 분자 추적을 제공하지 않지만, 높은 시간적 분해능을 가진 프로브 표본의 동적 패턴 또는 "지문"을 제공한다. Förster 공명 에너지 전달(FRET)과 결합될 때, 형태 변화와 같은 분자 내 역학은 공통의 공초점 설정5,6에서동시에 모니터링될 수 있다. FRET는 두 개의 형광의 거리를 탐사하고 종종 분자 "나노 통치자"라고합니다. 에너지 전달은 분자가 가까운 부근(< 10nm)에 있을 때만 이루어지며, 기증자의 방출 스펙트럼은 수용체 분자의 흡수 스펙트럼과 현저히 겹치며, 기증자 및 수용자의 편골 방향은 (충분히) 평행하다. 따라서 FRET와 FCCS의 조합은 매우 높은 스파티오-측두성 해상도를 가진 기술을 제공합니다. 공간 선택성, 감도 및 라이브 셀 호환성이 필요한 경우 FRET-FCCS는 이소레말 적정 열량량법(ITC)7,표면 플라스몬 공명(SPR)8,또는 단백질 역학 및 상호 작용을 측정하기 위한 핵 자기 공명(NMR)9,10과 같은 다른 방법에 비해 명백히 유리하다.
이중색 형광 교차 상관 분광법(dc-FCCS)의 기능과 약속에도 불구하고, 라이브 셀에서 DC-FCCS를 수행하는 것은 채널3,4 사이의 스펙트럼 출혈 또는 크로스토크로 인해 기술적으로 도전적이며, 관상구별 레이저 라인3,4,11,배경 신호 및 노이즈 또는 제한된 사진 시료의 반사적 변화 또는 노면 또는12의제한된 광시로 인한 공초점 볼륨의 차이 13,14,15. FCCS에 펄스 인터리브 된 여기 (PIE)의 도입은채널(16)사이의 스펙트럼 크로스토크를 줄이기위한 다른 레이저 여기를 일시적으로 분리하는 중요한 조정이었다. 스펙트럼 출혈을 통해17,18,19 및 배경 보정에 대응하는 다른 보정 방법도 잘 받아 들여왔다17,18,19. FCS, PIE 또는 FRET에 대한 세부 사항 및 기본사항에 대해 독자는 다음 참조2,4,6,16,20, 21,22,23,24를참조한다.
여기서, 모든 필요한 교정 실험 및 분석은 프로토타입 G 단백질 결합 수용체의 실험 결과와 함께, β 2-아드레너기수용체(β2AR)를 제시한다: (1) 단일 표지 분자는 "녹색"(eGFP) 또는 "빨강"(SNAP 태그 기반 라벨링)25 플루오포를 운반한다. (2) N 단말 SNAP 태그및 세포 내 eGFP(NT-SNAP)를 운반하는 이중 표지 된 구조 (이 경우, 두 라벨모두 동일한 단백질에 있습니다. 따라서 100% 공동 확산이 예상됩니다]; (3) 두 형광이 세포막의 동일한 측면에 있는 이중 표지된 샘플(CT-SNAP). C 단말 SNAP 태그와 세포 내 eGFP를 전달합니다. 여기서, 다시 두 라벨은 다시 100% 공동 확산이 예상되는 동일한 단백질에 있습니다. 두 라벨모두 세포막의 같은 면에서 서로 매우 가깝기 때문에 FRET 및 항상관 적 행동을 관찰 할 수있는 잠재력을 보여줍니다. 모든 구조물은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 전염되었고, 나중에 CT-SNAP 구조에 대한 NT-SNAP 구조 및 멤브레인 투과성막에 대해 막을 침투할 수 없는 적색 형광기판으로 표지되었다. 마지막으로, 시뮬레이션된 데이터는 FRET 유도 된 항상관에 대한 실험 파라미터의 영향과 단백질 단백질 상호 작용이 공동 확산 진폭에 미치는 영향을 예시합니다.
따라서, 이 프로토콜은 기술/물리적 유물, 도전 및 가능한 해결책을 인식하면서 단백질 역학 및 단백질 단백질 상호 작용을 이해하기 위하여 살아있는 세포에 결합된 FRET-FCCS를 능력을 발휘하는 완전한 가이드를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>5개의 렌즈가 있는 4f 구성의 1x 망원경</td><td>Qioptiq, Rhyl, UK</td><td>G063126000</td><td>광학</td></tr><tr><td>2x 밴드 패스 필터 Brightline</td><td>AHF, T&uuml; bingen, 독일</td><td>HC 525/50 및 HC 600/52</td><td>필터</td></tr><tr><td>2x 이색성 빔 스플리터</td><td>AHF, T&uuml; Bingen, Germany</td><td>HC BS F38-573</td><td>Filter</td></tr><tr><td>6-well culture plate Nunc</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>140675</td><td>시약</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>A20000</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>A20003</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ASI 스테이지 PZ-2000 XYZ</td><td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td><td>WK-XYB-PZ-IX71</td><td>현미경 부품</td></tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber, 직경 35mm&nbsp; 25mm 라운드 커버슬립</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>A7816</td><td>유리 커버슬립 홀더</td></tr><tr><td>Avalanche 포토다이오드 Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td><td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td><td>SPCM-AQR-14</td><td>단일 광자 계수 검출기</td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Newport, 다름슈타트, 독일</td><td>10FC16PB.3</td><td>Filter</td></tr><tr><td>Biorender (Software)</td><td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td><td>---</td><td>GPCR 스케치 생성에 사용되는 소프트웨어, https://app.biorender.com/</td></tr> <tr><td>Chinese hamster ovary (CHO) 세포주</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td>세포주</td></tr><tr><td>ChiSurf (데이터 분석 소프트웨어)</td><td>Thomas-Otavio Peulen, 미국 샌프란시스코 캘리포니아 대학교 생명공학 및 치료과학과</td><td></td>---<td>형광 상관 관계 데이터 및 형광 감쇠 히스토그램을 분석하기 위한 tttrlib 기반 소프트웨어, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf 튜토리얼: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s 참조: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치(미국 세인트루이스)</td><td>472476-2.5L</td><td>시약</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>AppliChem GmbH(독일 다름슈타트)</td><td>A3672,0250</td><td>시약</td></tr><tr><td>DNA 가닥(40bp 형광단 거리)</td><td>IBA Lifesciences GmbH(G&ouml; ttingen, Germany)---</td><td></td><td>시약, 5' CGC, 행위, GAA, CAG, 고양이, ATG, ACA, CGC, GAT는, AGG, CTA, TCC, TGC, AGT, ACG, CT(Alexa568)C, AGG, 3', 3' GCG, TGA, CT(Alexa488), T, GTC, GTA, TAC, TGT, GCG, CTA, TCC, GAT, AGG, ACG, TCA, TGC, TGC, GAG, TCC, 5'</td></tr><tr><td>둘베코' s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td><td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>P04-41250, P04-41650</td><td>시약</td></tr><tr><td>에탄올(절대)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>34852-1L-M</td><td>시약</td></tr><tr><td>Erythrosin B,염료 함량 >=95 %</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>200964-5G</td><td>시약, 기기 응답 기능, EtOH에서 10 mg/mL</td></tr><tr><td>로 해결소태아 세럼 (FBS)</td><td>바이오크롬&nbsp; (독일 베를린)</td><td>S 0615</td><td>시약</td></tr><tr><td>형광 광원 X-Cite 120 Q</td><td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td><td>XI120-Q-5060</td><td>현미경 부품</td></tr><tr><td>형광 SNAP-기판 셀 : SNAP Cell TMR- STAR</td><td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td><td>S9105S</td><td>시약</td></tr><tr><td>형광 SNAP-기판 표면 : DY-549</td><td>New England BioLabs (독일 프랑크푸르트)</td><td>S9112S</td><td>시약</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 (크기 : 직경 24mm, 두께 0.13-0.16mm)</td><td>Marienfeld-Superior (Lauda-K &ouml; nigshofen, Germany)</td><td>111640</td><td>시약</td></tr><tr><td>레이저 컨트롤러</td><td>Picoquant, Berlin, Germany</td><td>910020 (PDL 828-S "SEPIA II")</td><td>광학</td></tr><tr><td>레이저 라인(480nm 및 560nm)</td><td>Picoquant, Berlin, Germany</td><td>912485(LDH-D-C-485), 912561(LDH-D-TA-560)</td><td>Optics</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Life Technologies(Carlsbad, USA)</td><td>11668-019</td><td>시약</td></tr><tr><td>MFD suite (Software)</td><td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td><td>---</td><td>Kristine(tttr 데이터의 상관관계), Burbulator(단분자 실험 시뮬레이션), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td></tr><tr><td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm</td><td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany를 포함한 단일분자 형광 실험 분석을 위한 소프트웨어 패키지</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>빔 확장기</td></tr><tr><td>Neubauer 챔버의 두 번째 부분 (깊이 0.1 mm)</td><td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&ouml; nigshofen, Germany)</td><td>640110</td><td>시약</td></tr><tr><td>Olympus IX 71 stand</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>IX2-ILL100</td><td>Microscope Parts</td></tr><tr><td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td><td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>31985-047</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>049M4857V</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>GIBCO, Life Technologies(미국 칼즈배드)</td><td>14190144</td><td>시약</td></tr><tr><td>핀홀(50 &마이크로; M)</td><td>Newport, Darmstadt, Germany</td><td>PNH-50</td><td>Pinhole</td></tr><tr><td>PMT Hybrid-40</td><td>Picoquant, Berlin, Germany</td><td>932200 (PMA Hybrid 40)</td><td>Single photon counting detector</td></tr><tr><td>Python scripts (Software)</td><td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td><td>---</td><td>(1) 평균 계수를 결정하고, (2) 데이터를 상관 관계를 파악하고, (3) 형광 감쇠 히스토그램을 구축하는 데 사용되는 tttrlib(https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib)를 기반으로 자체 작성된 Python 스크립트 모음</td></tr>, <tr><td>https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td><td>AHF, T&uuml; Bingen, Germany</td><td>F73-421PH</td><td>Filter</td></tr><tr><td>Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator</td><td>Picoquant, Berlin, Germany</td><td>02126</td><td>Optics</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td><td>6771.1</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td><td>Picoquant, Berlin, Germany</td><td>931073 (SPT64-1+2 single user)</td><td>자체 구축된 FCCS 설정에서 시간 태그 시간 분해(tttr) 데이터 수집, 데이터 내보내기</td></tr><tr><td>TCSPC(Time-Correlated Single Photon Counting ) 시스템 Hydraharp 400</td><td>Picoquant, Berlin, Germany</td><td>930010 (Hydraharp 400)</td><td>Optics</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>T4299-100ml</td><td>시약</td></tr><tr><td>비장착 무채색 이중선, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td><td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td><td>ACN127-020-A</td><td>빔 확장기</td></tr><tr><td>침수 대물렌즈의 첫 번째 부분(UPlanSApo 60x/1.20 W)</td><td>Olympus, 함부르크, 독일</td><td>UPLSAPO60XW</td><td>대물렌즈</td></tr></tbody></table>

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 막 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합된 살아있는 세포 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하는 프로토콜 및 워크플로우를 제시합니다. 형광 강도의 변동이 각각의 형광 생체 분자의 동적 "지문"을 나타내는 이중 색 FCCS에서, 우리는 수용체의 공동 확산 또는 결합을 조사 할 수 있습니다. FRET는 분자 거리에 대한 높은 민감도를 가지고 있으며 분자 내 변화를 모니터링하는 잘 알려진 "나노 통치자"역할을합니다. 종합하면, 세포 설정에서 현지 수용체 농도 및 이동성 상수와 같은 형성적 변화와 주요 매개 변수가 접근할 수 있게 됩니다.
정량형 형광 접근법은 높은 소음 수준과 샘플의 취약성으로 인해 세포에서 도전적입니다. 여기서 는 eGFP 및 SNAP 태그-TAMRA로 표지된 2-adrenergic 수용체(β2AR)β 이중 색 라벨을 사용한 교정 단계를 포함하여 이 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다. 사용자 지정이 용이한 오픈 소스 소프트웨어 및 템플릿을 사용하여 단계별 데이터 분석 절차가 제공됩니다.
우리의 지침은 살아있는 세포 실험에 있는 제한된 신호-잡음 수준에도 불구하고 높은 신뢰성으로 그(것)에 있는 살아있는 세포에 있는 생체 분자의 분자 상호 작용을 해명하는 가능하게 합니다. FRET의 운영 창과 특히 낮은 농도의 FCCS는 거의 생리학적 조건에서 정량적 분석을 허용합니다.

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

형광 간 상관 분광법은 살아있는 세포에서 G 단백질 결합 수용체의 동적 서명을 정확히 파악하기 위해 시간 결과 형광을 사용하는 통계적 방법입니다. 여기에서, 우리는 베타-2 부전 수용체에 특히 관심이 있습니다. 스핑크고립지 수용체는 주로 번역 확산 역학에 대한 정보를 제공하고 형광 성 이방성 또한 회전 확산의 도움으로.추가 라벨을 도입함으로써, 우리는 또한 프로브로 라벨 사이의 공명 에너지 전송을 육성하는 경우 친 결합 또는 심지어 형성 변화를 할 수 있습니다. 정량적 시간 해결 형광은 설정 및 교정 측정의 신중한 정렬이 필요합니다. 다음 분에서, 우리는 클론 유동성 태그 및 합성 유동력을 사용하여 G 단백질 결합 수용체의 생명 세포 형광 상관 분광, 교차 상관 분광법 및 포스터 공명 에너지 전송에 대한 실험 가이드를 제공 할 것입니다.세포 앉아서 전균은 멸균 조건하에서 수행될 필요가 있습니다. 깨끗한 커버 슬립 바벨을 6개의 웰 배양 판에 놓고 멸균 인산염 완충식 식염수로 씻어 내고, 페놀 레드가 10% 태아 소 세럼, 100 마이크로그램, 아민 페니실린 당 100 마이크로그램, ml 연쇄상 절제술당 100 마이크로그램을 첨가하여 멸균 인산완충소 식염수로 씻어 내세요. 페놀 레드가 37도에서 섭씨 37도에서 동일한 배지로 배양되는 CHO 세포를 5% CO2에서 5mL PBS로 세척하여 죽은 세포를 제거합니다.트립신 2mL을 넣고 실온에서 2분간 배양합니다. 페놀 레드로 8mL의 매체로 데이터 셀을 희석하고 파이펫팅하여 조심스럽게 섞습니다. Neubauer 챔버에서 세포를 계산하고 커버 슬립을 포함하는 6 개의 잘 배양 판에서 잘 당 150, 000 세포의 밀도로 세포를 앉습니다.세포가 대략 80%의 수렴성을 달성하기 위해 24시간 동안 인큐베이터에서 자랄 수 있도록 하십시오. 원하는 벡터 DNA의 2마이크로그램을 희석시. 예를 들어 CT SNAP 또는 NT SNAP 및 그 형질 산의 6 마이크로리터는 두 개의 별도의 튜브로 시약을 삽입합니다.각각 500 마이크로리터를 함유하고 있는 각 우물에 대한 혈청 배지를 감소시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 두 솔루션을 함께 섞어 트랜스펙트 혼합물을 얻고 실온에서 20분 더 배양합니다. 그 동안, 멸균 PBS로 한 번 앉아 CHO 세포를 세척.PBS를 페놀 레드 프리 배지 의 웰당 1ml로 대체하고, 10%의 태아 소 세럼과 항생제가 없는 것으로 보충됩니다. 1 ml 의 전체 건설 혼합물을 각 우물에 현명하게 넣고 5 % CO2에서 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 라벨링을 위해, 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 1mL 배지에서 적절한 SNAP 기판을 희석하여 1개의 마이크로몰러의 최종 농도를 얻습니다.PBS로 감염된 세포를 한 번 세척하고 하나의 마이크로 몰러 SNAP 기판 용액의 웰 당 하나의 mL을 추가합니다. 5% CO2에서 37도에서 20 분 동안 세포를 배양하십시오. 페놀 레드 프리 배지로 세 번 씻어 내고, 페놀 레드 프리 배지당 2mL를 추가합니다.5% CO2에서 섭씨 37도에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오. 이후 모든 샘플의 커버 슬립을 이미징 챔버로 옮기고 500 마이크로리터 이미징 버퍼로 세척합니다. FRED FCS 설정으로 이동하기 전에 500개의 마이크로리터 이미징 버퍼를 추가합니다.FRED FCS 설정에는 공초점 현미경 물 목표, 두 개의 레이저 라인, 시간 퀼터 단일 외국 카운팅 시스템, 2개의 하이브리드 BMT 및 광자 수집 및 데이터 수집 소프트웨어를 위한 2개의 주식이 장착되어 있습니다. 라이브 셀에서 측정하기 전에 매번 설정을 정렬하는 것이 매우 중요합니다. 초점, 핀홀 및 착색 위치를 조정하기 위해 2개의 나노몰러 녹색 교정 용액을 유리 커버 슬립에 놓고 더미, 인터리브 된 여기 또는 PI 모드에서 작동하는 485 나노미터 및 560 나노 미터 레이저에 스위치를 놓습니다.최대의 분자 밝기를 얻기 위해 가장 높은 카운트 속도와 가장 작은 공초점 볼륨을 얻을 수 있도록 용액에 초점을 맞추고 핀홀과 칼라 링 위치를 조정합니다. 10 나노 몰레드 교정 용액과 둘 다의 혼합물로 빨간색 채널에 대해이 프로세스를 반복하십시오. 유리 커버 슬립에 10 나노 몰러 DNA 용액을 배치하고, 녹색과 빨간색 검출 채널 사이의 교차 색상이 가장 높은 있도록 핀홀과 칼라 링 위치의 초점을 조정합니다.즉, 소스가 가장 높은 진폭입니다. 살아있는 세포에서 측정을 위해 마커 램프로 제한하고 안구를 통해 관찰하여 적합한 셀을 찾습니다. PI 모드에서 레이저를 모두 켜고 초당 최대 카운트를 찾아 멤브레인에 집중하십시오.셀 샘플의 경우 레이저 전력을 줄여야 할 수 있습니다. 바람직하게는 객관적으로 5 마이크로와트 미만. 이것은 사용되는 꽃과 설정에 매우 의존합니다.데이터 수집 소프트웨어의 온라인 미리 보기에서 EGP에 바인딩된 베타-2 AR의 자동 및 크로스 콜 커브를 관찰하고 60~180초 사이의 획득 시간으로 여러 정렬 측정을 수집합니다. 상관 관계 과정과 대비를 모든 측정값과 내보냅니다. 프롬프트 및 지연 시간 창을 올바르게 정의하고 데이터 상관 소프트웨어에서 옵션을 얻는 몇 가지 마이크로 시간을 사용하십시오.전체적으로 세 가지 상관 관계가 필요합니다. 녹색 채널 프롬프트 시간 창의 자동 상관 관계입니다. 빨간색 채널과 지연 시간 창의 자동 상관 관계입니다.그리고 마지막으로 녹색 채널 신호의 교차 상관관계, 그리고 프롬프트 시간 창은 지연 시간 창에서 빨간색 채널 신호였다. 다음은 솔루션용 녹색 및 빨간색 FRED의 자동 상관 기능이며 B가 곡선의 기준선과 분자 및 초점 수인 두 개의 사용 색상 채널에 대한 공초점 검출 볼륨의 모양과 크기를 보정하는 데 필요한 추가 삼중 용어와 함께 3 DT 확산 모델에 적합합니다. 확산 시간 및 S, 오메가 0 이상 0은 공초점 볼륨 요소의 형상 계수를 TD합니다. 삼중 깜박임 및 사진 물리학은 진폭 AR 및 릴렉스 타임 TR으로 설명됩니다. 녹색 및 적색 교정에 대해 알려진 확산 계수를 사용하여 눈에 띄는 모양 요소를 사용하여 감염성 공초점 볼륨 요소의 치수 및 부피를 결정합니다.IFR, 채널 제로에서 수집된 녹색 형광 신호, 오른쪽 감지 채널, 채널 1 및 3에 대한 스펙트럼을 배경 수집 신호의 비율로 계산합니다. 빨간 레이저에 의한 지연 시간 창 에서 바로 배경에 녹색 레이저에 의해 빨간색 교정 측정 및 프롬프트 타임 윈도우 여기의 눈금의 대조를 수집 배경의 비율에 의해 기증자 여기 파장에 의해 데이터의 수용자 흐름의 직접적인 기대를 결정한다. B의 분자 밝기를 모두 녹색과 적색 유동력으로 계산하여 대조를 수집한 배경을 기반으로 분자 수를 얻고 3DT 확산 적합성에 집중한다.녹색 및 빨간색 채널에서 두 가지 극성 상관관계를 모두 맞출 뿐만 아니라 이중 레벨 DNA의 녹색 프롬프트 및 적색 지연에서 3 DT 확산 모델에 대한 상관 관계를 통해 자동 상관 관계 기능에 대해 획득 된 모양의 요소를 일정하게 유지합니다. 교차 상관 관계 함수의 셰이프 요소는 일반적으로 이러한 두 값 사이에 있습니다. 분자 및 초점 의 명백한 수의 글꼴 값에 따라 0 상관 시간에 진폭을 결정합니다.시료의 진폭 비율을 계산하는 것은 녹색 및 빨간색 바닥력의 100% 공동 확산이었다. 셀 샘플을 적절한 모델에 맞춥시게 합니다. 그들은 이중 모달 방식으로 호기심이 없는 막 수용체 확산을 어떻게 보여주는지는 짧고 긴 확산 시간이 아니었습니다.또한, 사진 물리학 및 바닥 힘 밖으로 깜박이는 고려되어야한다. TD1 및 TD2는 확산 시간을 위해 필요한 두 가지입니다. 그리고 하나의 첫 번째 확산 시간의 분획자유 주사위와 DNA 가닥 확산, 모든 방향, 멤브레인 수용체가 세포막을 따라 2D 확산만 표시되는 교정 측정과 는 대조적으로 분자 수와 초점의 관점에서 녹색 또는 적색 라벨 단백질의 농도를 계산한다.그리고 바이어스 질량을 사용하여 공초점 볼륨 요소의 부피. 이중 표지된 샘플의 두 알토 상관관계에 는 이중 모달 확산 모델을 사용하여 단일 레벨 구조 및 교차 상관 함수와 동일한 모델을 사용하여 이중 표지된 샘플의 상관관계를 조정하여 시스템의 글로벌 설명을 참고한다. 세 가지 작물은 모두 공동으로 적합해야 합니다.확산 기간은 세 작물 모두에 대해 동일합니다. 그리고 유일한 차이점은 평판 시간이 떨어지고, 교차 상관 관계 함수입니다. 각각의 분자 수와 초점 및 공초점 부피 원소의 부피로부터 녹색 또는 적색 노동 단백질의 농도를 계산합니다.DNA 샘플로부터 얻은 교정 인자, 세포 샘플의 진폭 비 및 각각의 얻어진 농도를 사용하여 세포 샘플에서 상호 작용하는 녹색 및 빨간색 라벨 단백질의 분획 또는 농도를 추정한다. AF가 각각의 진폭 및 이완 시간을 전체 항 상관관계 및 AR 및 TR의 진폭을 반영하는 항 상관 용어를 포함하는 이중 모달 확산 모델에 대한 단일 표지된 샘플 및 전면 교차 상관관계로서 FRED 샘플의 두 가지 상호 상관관계를 맞춥시다. FRED 하나 또는 여러 개의 항 상관 관계 조건으로 인한 상관 관계가 방지된 형광 변경이 필요할 수 있으며, 이로 인해 두 개의 자동 상관 관계 함수의 상승과 일치하는 낮은 상관 시간에 프레드 교차 상관 관계 기능이 급락하게 됩니다.녹색 과 빨간색 꽃 솔루션의 보정 측정은 6.5 및 녹색 채널의 요소를 면도하고 빨간색 채널에서 6.8을 면도합니다. 따라서, 공초점 부피는 이 측정일에 나중에 1.4 및 1.9 펨토의 크기를 가지며, 분자 밝기는 분자당 12.5 킬로헤르츠, 분자당 2.6 킬로헤르츠에 있다. 우리는 기증자 의 흥분 후 붉은 채널로 녹색 꽃에서 크로스 토크의 15 %를 가지고 있으며, 우리의 DNA 측정에서, 우리는 공초점 중첩 볼륨에 대한 교정 인자를 결정0.6 과 0.7 너무, 단일 라벨 구조로 전관 된 세포는 대략 반 분자의 확산에 이중 모달 차원 2 입헌을 보여줍니다. 50~100밀리초 의 시간 척도와 나머지 절반은 두 구문에서 약 2밀리초 정도 비교적 빠릅니다.또한 삼중 깜박임이 존재합니다. 그러나, 빨간색 레벨 스냅 에서 또 다른 휴식 시간에 취득 180 마이크로 초, 이는 바로 언바운드 스냅에서 유래 할 수있다. 이중 라벨 자체에서, 세포막의 두 개의 서로 다른 측면에 두 개의 라벨이 있는 안티 스냅 구조로 대회하여, 2개의 적은 측정이 노이즈와 적색 코트를 상관관계에 수집하였다.그리고 PI 교차 상관 관계는 여기에서 매우 높습니다. 여기서 분자의 70%는 백 밀리초 시간 척도에서 천천히 30% 빠르며, 이중 해방 분자의 분수는 낮고 CT 스냅에 대한 데이터가 더 잘 보이며 덜 시화됩니다. 그러나, 예상되는 전방 깊은 안티 상관관계는 높은 양의 크로스토크에 의해 질량이 가장 높고, 두 꽃의 직접 적인 외침과 삼중 깜박임, 수집된 형광 강도 DKS를 이용한 데이터 분석 방식이 모의 데이터 세트에 도시된 바와 같이 이를 구출하는 데 도움이 될 수 있다.Fred FCS 기술의 장점은 이동성과 함께 GPCR의 컨퍼런스 역학을 조사 할 수 있다는 것입니다. 그러나 실험실에서 FRED FC를 수행하는 것은 어렵고 우수한 전세포, 효율적인 라벨링 및 완벽한 교정 설정을 요청합니다. 그냥 프레드 쌍 프로 힘도 매우 중요합니다.중요한 실험 단계에는 경질 최적화, 배경 최소화 및 자동 형광이 포함됩니다. 또한 원자 분석 파이프 라인은 살아있는 세포에서 preceptors의 다양한 역학을 이해하는 데 도움이됩니다. 우리는이 프로토콜이 라이브 셀 실험에서 FRED FCS 접근 방식을 수행하는 데 유용 할 것으로 기대합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 형광 변동 분광법(fluorescence fluctuation spectroscopy)을 사용하여 세포 간 접촉에서 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 형광 단백질로 표지된 관심 대상인 막관통 접착 수용체를 발현하고 스펙트럼으로 분리된 두 개의 형광 표지를 가진 두 개의 서로 다른 세포 집단을 혼합함으로써, 서로 다른 색의 형광을 가진 두 인접 세포의 수용체 간의 trans-interaction은 형광 강도 변동의 교차 상관관계를 통해 평가됩니다.

세포 접촉에서 단백질 상호 작용을 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

이 비디오는 단백질 호모올리고머화를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(FFS) 기술을 보여줍니다. 샘플의 형광 표지된 단백질은 FFS를 사용하여 단백질 올리고머화를 연구할 때 에이전트를 사용하여 이합체화됩니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 단백질이 작은 관찰 부피 안팎으로 이동할 때 단백질의 올리고머 상태를 결정하기 위해 형광 분자의 밝기 변동 분석을 수행합니다.

단백질 호모올리고머화(Homo-Oligomerization)를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

여기, 우리는 프로토콜 3 색 smFRET 데이터 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델의 분석을 제시. 이 방법을 과학자 들은 복잡 한 단백질 시스템, cooperativity 또는 서로 상호 작용을 포함 하 여에서 운동 정보를 추출할 수 있습니다.

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

우리는 여기에서 형광 상관 분광학을 사용하여 세포 용해 및 살아있는 세포에 있는 단백질 올리고머 및 응집을 측정하는 절차를 소개합니다.

형광 상관 분광법을 사용하여 단백질 응집 감지

HCN 채널과 보조 서브 유닛 사이의 상호 작용은 주요 우울 장애의 치료 대상으로 확인되었습니다. 여기서,이 단백질 - 단백질 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 형광 편광 - 기반 방법이 제공된다.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

단백질 상호 작용은 세포의 기능의 핵심이다. 열량 및 분광 기술은 일반적으로 그 특성을하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 Shwachman - 다이아몬드 증후군 (SBDS)에 돌연변이 단백질과 신장 인자 같은 1는 GTPase (EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성을 설명합니다.

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

학습하세요 살아있는 세포에서 이중 색 형광 교차 상관 분광법(FCCS)과 FRET를 결합하여 G단백질 연결 수용체의 역학과 상호작용을 정량 분석하는 방법을. CHO 세포를 이용한 이 프로토콜은 수용체 확산 동역학 연구에 강력한 프레임워크를 제공합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

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