Name: DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 배우세요 DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동을 살아있는 세포에서 단일 분자 수준으로 관찰하는 방법을 형광 현미경을 사용하여. 이 기법은 DNA 손상과 전사 간 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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RH 싱어, J.A. 차오, T. 미스텔리, M. 카르모 폰세카에게 플라스미드와 시약의 선물에 감사드립니다. 또한 iMM 바이오이미징 시설 직원, A. 테무도, A. Nascimento 및 J. 리노에게 원고의 비판적 판독을 위해 빚을 지고 있습니다. 이 작품은 PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 및 PTDC/MED-OUT/4301/2020Fundacão para a Ciência e a Tecnologia(FCT), 포르투갈 및 LBOISA-017-017에 의해 지원되었습니다. 포르 리스보아, 포르투갈 2020-Programa Operacional 지역 드 리스보아, FCT를 통해 FEDER에 의해 공동 투자 프로젝트. 자금조달은 EU Horizon 2020 연구 혁신 프로그램(리보메드 857119)으로부터도 지원받았습니다. M.A.는 FCT 박사 펠로우십 2020.05899.BD 수혜자입니다.

1. 살아있는 세포 현미경 검사에 대한 세포의 준비 및 배설
<ol><li>25cm2 세포 배양 플라스크의 기자 세포주(EX2, EX2-AS, 또는 PROM)를 DMEM 5mL로 준비하여 살아있는 세포 현미경 실험 전날 80-90% 합류를 달성한다.</li>
	<li>25cm2 세포 배양플라스크에서 파이펫으로 배지를 흡인하고 1x PBS의 2.5mL로 세포를 세척한다.</li>
	<li>트립신-EDTA(0.05%)의 1mL을 추가하고 세포 분리를 위해 2-3분 동안 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>세포 분리 후 HEPES 버퍼를 함유한 페놀 레드없이 DMEM 4 mL을 추가하고 10 % (v /v) 숯제거 태아 소 혈청으로 보충하고 세포를 부드럽게 다시 중단하십시오.</li>
	<li>10mm 유리 바닥 우물(직경 1.5호)가 있는 35mm 원형 접시에 셀 용액의 플레이트 1mL을 균일화한다. 35mm 원형 접시를 100mm 표준 세포 배양 접시 안에 저장하고 5% CO2로 가습된 분위기에서 37°C에서 배양합니다.</li>
	<li>~ 6 h 시드 후, 유리 바닥 접시에 세포를 변형. 각 경질 혼합물에 대해 다음 방식으로 두 가지 솔루션을 준비하십시오.<ol>
<li>1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에서, 150μL의 감소세럼 최소 필수 매체(MEM), 플라스미드 DNA( 표 1에 기술된 바와 같이), 및 2.5 μg/μL의 트랜스페션 도우미 시약 DNA를 포함하는 솔루션 A( 재료표 참조)를 준비한다.</li>
		<li>동시에, 정제액 150 μL 및 지질 계 형 질산 시약의 1.5 μg/μL DNA를 포함하는 용액 B를 준비 하십시오 (재료표 참조).</li>
		<li>실온(RT)에서 두 솔루션을 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 솔루션 A를 솔루션 B에 부드럽게 추가하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.</li>
		<li>세포를 변형시키기 위해 각 접시에 300 μL의 솔루션 A+B를 드롭와이즈로 넣고 부드럽게 분배합니다. 유리 바닥 접시를 100mm 표준 세포 배양 접시 안에 저장하고 5 % CO2로 가습 된 분위기에서 37 °C에서 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL 마이크로센심심분리기 튜브를 HEPES로 DMEM 200 μL로 준비하고, 페놀 레드는 10% (v/v) 숯이 벗겨진 태아 소 세럼으로 보충하지 않고 TA를 7.5 x 10-7 M의 농도로 추가한다.</li>
</ol>2. 실험 용 설정
<ol><li>대형 플렉시글라스 현미경 인큐베이션 챔버및 상부 단계 인큐베이션 챔버의 온도를 공통 대조군 부에서 37°C로 설정한다. 단계 인큐베이션 챔버 내부의 환경 조건을 5% CO2 및 100% 습도로 설정합니다. 참고: 현미경 케이지 및 스테이지 인큐베이터 온도는 온도 변동을 최소화하기 위해 전체 시스템의 가열을 허용하기 위해 실험을 시작하기 전에 적어도 1 h를 설정해야합니다. 다른 모든 현미경 제어 및 작동 단위를 동시에 시작합니다.</li>
	<li>방사유전자의 전사를 유도하여 방시세포(0.5 μg/mL)를 성장 배지에 첨가하고 현미경 관찰을 시작하기 전에 200 μL 마이크로피펫 ~1h로 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합한다. 참고: 100mm 표준 세포 배양 접시 안에 있는 유리 바닥 접시를 보관하여 세포 배양에서 스티로폼 용기의 현미경방으로 쉽게 취급하고 운반하여 가능한 한 안정적으로 온도를 유지합니다.</li>
	<li>관찰을 시작하기 전에 적어도 30 분 현미경으로 세포를 운반하고 도착시, 사전 가열 된 큰 현미경 인큐베이션 챔버 내부에 즉시 세포와 함께 100mm 접시를 배치합니다.</li>
	<li>마이크로센심심분리기 튜브를 1.7단계에서 미리 희석된 TA로 놓습니다. 최대 37°C까지 따뜻하게 하는 대형 현미경 환경 챔버 내부.</li>
	<li>뚜껑에 드릴링 된 3mm 직경 구멍으로 전에 준비 된 것과 유사한 유리 바닥 접시의 뚜껑을 교체하십시오 (그림 2A). 참고: TA는 현미경 단계에 장착된 접시를 조작하지 않고 뚜껑의 작은 구멍을 통해 세포에 나중에 추가됩니다.</li>
	<li>현미경 제어판에서 100x(아포크로매틱 목표, 1.4 수치 조리개) 오일 침지 목표를 선택합니다. 목표에 침지 오일 한 방울을 적용합니다.<ol>
<li>현미경 단계 인큐베이션 챔버 내부의 세포와 유리 바닥 접시를 설정하고 제자리에 잠급. 단계 인큐베이터의 뚜껑과 현미경 하우징의 모든 문을 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경 작동 및 제어 소프트웨어를 시작하고 , 초점 제어 창(그림 2B)을 열고, 스코프 창을 클릭하고, 배출 선택 창에서 100% 아이 박스를 클릭하여 눈으로 직접 샘플 관찰을 위한 안구 빔 경로를 설정합니다.<ol>
<li>필터 세트 메뉴에서 아이 필터 세트로 전환하고 브라이트필드를 클릭하고 브라이트필드 열기 버튼을 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오일이 유리에 닿을 때까지 현미경 목표를 유리 바닥 접시쪽으로 이동합니다. 그런 다음 안구를 살펴보고 셀의 평면에 수동으로 집중하십시오. 오픈 브라이트필드 버튼을 끕합니다.</li>
	<li>환경 조건에 적응하고 온도 그라데이션에 의해 이미징 하는 동안 초점 드리프트를 방지 하기 위해 실험 관측을 시작 하기 전에 30 분 동안 세포를 둡니다.</li>
	<li>실온에서 200 μL 마이크로파이프와 200 μL 필터 팁을 따로 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 이미지 수집
<ol><li>현미경 제어 소프트웨어의 초점 제어 창에서 레이저 강도를 5%로 설정하고 노출 시간 동안 50ms의 값을 입력합니다(도 2B).</li>
	<li>캡처 창을 열어 설정을 조정하여 3차원(3D) 시간 경과(그림 2C)의 자동화된 이미지 수집을 수행합니다.</li>
	<li>3D 캡처 획득 유형을 선택하고 0.4 μm로 분리된 12~16개의 광학 슬라이스를 설정하고, 범위의 확인란을 현재 주변의 확인란을 체크박스를 선택하고 캡처 후 현재 위치로 돌아갑니다.</li>
	<li>Timelapse 캡처 창에서 시간 포인트의 #에 대해 120의 값을 입력하고 간격에 대해 30을 입력합니다.</li>
	<li>Λ = GFP용 488nm, Λ = 561 nm 태그RFPt용 및 λ = 640 nmiRFP713을 위한 전감염된 형광 단백질 라벨에 따라 설정된 공초점 필터세트를 선택하고 각 채널의 노출 시간을 50ms로 설정한다.</li>
	<li>레이저 전원에 대해 현재 설정설정을 사용하여 포커스 창 에서 선택한 5%의 값을 사용합니다(그림 2C).</li>
	<li>초점 제어 창에서 카메라 창으로 이동하여 배율 이미지 표시 컨트롤을 선택하고 수동 단추를 선택하여 표시할 이미지 강도의 고정 범위를 설정합니다. 낮은 값 입력: 500 및 높음: 5000(그림 2B 참조). 참고: 이 설정은 라이브 뷰에 표시되는 카메라 캡처의 동적 범위를 제한하여 동일한 범위의 형광 강도(그림 2D) 내에서 셀을 선택합니다.</li>
	<li>DSB를 유도할 때 전사 부위의 3D 타임랩스 이미징을 위한 세포를 선택합니다. 셀을 선별하고 토론에 설명된 조건에 따라 세 가지 보기 필드를 선택합니다.</li>
	<li>이전에 관측 필드의 중심에 있는 각 셀에 Z 스택의 중간 평면에 전사 부위를 포커스를 지정합니다. 참고: XYZ의 셀 및 전사 부위를 중심으로 셀의 일부 이동을 수용합니다.</li>
	<li>세트 점을 클릭하여 포커스 컨트롤 창의 XY 창에 각 XYZ 위치를 표시합니다. 참고: 선택된 위치를 다음 5분 동안 2-3회 다시 방문하여 XYZ 차원에서 세포의 위치의 지속적인 전사와 상대적 위치 안정성을 확인한다.</li>
	<li>1.7단계에서 미리 희석된 TA의 200 μL을 추가합니다. 도 2F에 도시된 바와 같이 셀에. 참고: 표시된 XY 위치에서 의 전환을 방지하기 위해 TA를 추가하는 동안 유리 바닥 접시 또는 뚜껑을 만지지 않도록 주의하십시오. DSB 유도 후, 세포가 시야 내에서 중심이 되고 전사 부위가 중앙 Z-평면에 있는지 확인한다. 재초점 및 위치 업데이트는 1-2분 이상 걸리지 않아야 합니다.</li>
	<li>캡처 창에서 시작을 클릭하여 3D 타임시리즈 이미징을 시작합니다.</li>
	<li>현미경 제어 컴퓨터 하드 드라이브에 현미경 제어 소프트웨어 데이터 형식에 이미징 데이터를 저장합니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>현미경 제어 소프트웨어에서 이미징 데이터를 열고 16비트 TIFF 형식 파일로 내보냅니다.</li>
	<li>StaQtool21 소프트웨어로 내보낸 파일을 엽니다. 단일 스팟 3D 모드를 선택하고 이동을 눌러 이미지 파일을 로드합니다. 참고: 선택한 시계열은 최대 프로젝션 타임랩스 뷰어에서 열리며, 첫 번째 시점의 z 스택의 최대 강도 투영을 보여 줍니다(그림 3A).</li>
	<li>왼쪽에 있는 세로 MAX 슬라이더로 이미지 강도 표시를 조정합니다.</li>
	<li>가로 타임포인트 슬라이더로 분석할 시간점을 선택합니다.</li>
	<li>커서를 레이블이 부착된 전사 부위의 위치에 마우스를 가져가 수동으로 표시하거나 자동 감지 기능을 사용하고 여러 물체가 감지된 경우 각 전사 부위를 누릅니다.</li>
	<li>자동 트랙 함수를 사용하여 시간이 지남에 따라 전사 사이트의 XYZ 위치를 결정합니다. 참고: 지정된 위치를 올바르게 추적하지 않은 경우 StaQtool 소프트웨어 설명서에 따라 전사 사이트를 수동으로 선택합니다.</li>
	<li>자동 버튼을 눌러 각 시간지점에 대한 가우스 피팅을 수행하고 총 형광 강도(TFI)를 측정합니다. 참고: 전사 활동이 중단되면 추적 도구는 회절 제한 개체(레이블이 부착된 전사 사이트)가 검출된 마지막 위치에 남아 있습니다. 전사 사이트 레이블이 사라진 후 셀이 XY 방향으로 이동하면 검색 사각형 의 수동 위치 지정이 필요합니다.</li>
	<li>각 타임포인트에 대한 TFI 값 피팅을 완료한 후 종료 타임랩스 버튼을 눌러 현재 시간 시리즈 이미지 파일을 닫고 다음 파일로 계속 합니다. 참고: TFI 값이 자동으로 내보내고 Excel 파일에 저장됩니다.</li>
</ol>5. 현미경 교정 측정 및 분석
<ol><li>종자 세포는 35mm 유리 바닥 접시로 퍼지고 제1항에 설명된 바와 같이 형광 태그MS2 및 PP7 코트 단백질을 가진 트랜스펙트. 참고: 교정 측정의 경우, 소개에 설명된 동일한 기자 유전자 세포주를 사용한다.</li>
	<li>현미경 이미지 수집을 시작하기 전에 세포 1h의 성장 배지에 독시사이클린의 0.5 μg/mL을 추가합니다.</li>
	<li>현미경 단계 인큐베이션 챔버 내부에 유리 바닥 접시를 마운트하고 이전과 같이 이미지 수집을 준비 (섹션 2 참조). 참고: 유리 바닥 접시의 원래 뚜껑은 교정 실험을 위해 대체되지 않습니다.</li>
	<li>점 3.1에 설명된 것과 동일한 레이저 강도 및 노출 설정을 사용합니다.</li>
	<li>2D 시계열에 대한 캡처 설정을 설정( 캡처 유형 창에서 3D 옵션 선택 해제)을 설정하고 Timelapse 캡처 패널(그림 2C)에서 500ms 간격으로 120개의 타임포인트를 설정합니다. 참고: 이 이미지 수집 설정은 매우 짧은 간격으로 단일 광학 평면 내에서 타임 시리즈를 생성합니다.</li>
	<li>여러 위치에서 수십 개의 교정 타임 시리즈를 획득하여 수백 개의 단일 전사체 TFI 측정을 계산하는 데이터 세트를 생성합니다.</li>
	<li>교정 기간 시리즈를 분석하려면 파일을 4.1 점에 따라 16비트 TIFF 형식 파일로 변환합니다.</li>
	<li>StaQtool21 소프트웨어로 내보낸 파일을 엽니다(그림 3). 로그 선택 파일 버튼을 누르고 4.2점에 설명된 대로 획득한 각 2D 타임 시리즈의 로그파일을 선택합니다.</li>
	<li>여러 스팟 2D 확인란을 선택하고 GO 버튼을 눌러 분석 소프트웨어에 타임 시리즈를 로드합니다.</li>
	<li>TIMElapse 뷰어 창(도 3A)에서 PSF FWHM에서 입력 필드는 설명된 바와 같이 현미경 시스템 및 목표에 대해 계산된 값을 삽입한다.</li>
	<li>분석 프로세스를 시작하려면 자동 감지 버튼을 눌러 표시된 현재 시간점에 대한 모든 회절 제한 개체를 감지합니다. 그런 다음 AutoFit 을 클릭하여 가우시안 피팅을 수행하여 각 개체에 대한 TFI 값을 결정합니다(그림 3A).</li>
	<li>또는 회절 제한 오브젝트 위에 커서를 가리키고 클릭하여 선택(흰색 사각형 내의 녹색 원이 표시됨) 수동 선택 및 가우스 피팅 프로시저를 위해 가우시안 맞춤 버튼을 누릅니다. 참고: 마지막 모드는 동일한 핵에 여러 개의 초기 성적증명서가 있는 밝은 전사 사이트와 같이 계산되지 않은 개체를 제외하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>종료 타임랩스 버튼을 눌러 이전 단계를 완료합니다. 참고: 결과는 이미지 파일과 동일한 폴더에 Microsoft Excel 파일 형식으로 자동으로 저장됩니다.</li>
	<li>각 버튼을 눌러 여러 지점에 대한 TFI 및 W 배포 모듈을 시작합니다(그림 3B).</li>
	<li>파일 추가 버튼을 통해 Excel 파일을 로드하고 Go 버튼을 눌러 TFI 분석을 시작합니다. 참고: 출력은 측정된 여러 단일 전사 TFI에서 결정된 평균 TFI 값입니다.</li>
	<li>이전에 5.10점에 사용했던 PSF FWHM을 삽입하여 W 분석을 시작합니다. 그리고 Bin의 기본 값을 사용하여 이동 버튼을 누릅니다. 참고: W 파라미터는 사용되는 현미경 시스템에 대한 올바른 PSF FWHM 값을 준수하기 위해 단일 전사 TFI 측정에 대한 품질 관리입니다.</li>
</ol>6. 데이터 및 교정 병합
<ol><li>4.8점에 저장된 Excel 시트에서 얻은 타임시리즈 TFI 값을 입력합니다. 새로운 Excel 시트로 각 시간 포인트 값을 5.15 지점에서 얻은 단일 성적증명서의 평균 TFI로 나눕니다. 참고: 이 프로세스를 표준화하기 위해 사용자 지정준비엑셀 템플릿 양식이 사용되었습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

복제, 전사, DNA 손상 및 DNA 수리와 같은 필수 생물학적 과정 간의 충돌은 게놈 불안정의 중요한 원인으로 확인되었습니다22. 이러한 연구는 또한 DNA 손상의 사이트에서 전사의 발견을 주도하고 DNA 손상 복구 프로세스를 조절에 침입 유도 된 성적 증명서에 기능적 역할을 기인23. 여기에 설명된 새로운 공구 및 프로토콜은 DSBs에서 RNA Pol II 전사 역학의 추가 조사를 허용합니다. 이 프로토콜의 중요한 점은 게놈에 통합된 기자 유전자의 단일 사본을 포함하는 세포주 생성이다. 이 주요 기능은 단일 게놈 궤적 내의 여러 사본과 통합된 여러 리포터 유전자의 전사에 의해 생성된 노이즈를 제거하고 전사 역학 및 개별 RNA 성적증명서의 운동 파라미터의 수집을 허용합니다. 단일 리포터 유전자 통합의 전사를 관찰하는 중요한 기술적 요구 사항은 살아있는 세포에서 MS2 또는 PP7 시스템으로 표지된 단일 RNA 전사체의 검출을 허용하는 현미경 시스템의 가용성이다4,12. 여기서, 살아있는 세포 현미경은 반전된 현미경에 장착된 공초점 회전 디스크 시스템에서 수행되며, 다른 곳에서 설명된 바와 같이 음향 광학 용 조정 필터에 결합된 100mW 고형 레이저를 장착한다24. 더욱이, 기자를 사용하여 단일 DSB에서 전사를 공부하기 위해, 개별 세포는 몇 시간 동안 이미징 세포를 필요로 하는 가장 높은 시간 해상도를 달성하기 위해 주의 깊게 모니터링되어야하며, 이는 이를 낮은 처리량 분석으로 만듭니다. 여전히, 우리는 압전 구동 현미경 단계에 의해 제어 되는 위치와 병렬로 여러 세포를 관찰. 몇 시간 동안 살아있는 세포 관찰을 위한 최적의 환경 조건을 보장하기 위해 시료 단계를 포함한 현미경 본체가 플렉시글라스 환경 챔버 내부에 배치됩니다. 또한, 폐쇄단계 인큐베이션 챔버는 현미경 단계에 장착되어 CO2 및 습도 공급 컨트롤러에 연결됩니다.
프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 이미징을 위한 세포와 관심 있는 영역의 선택입니다. 이미징을 위해 표시된 각 XY 위치는 제1항, 표 1, 도 2D, E에 기재된 리포터 유전자 및 형광 식 RNA 줄기 루프 결합 단백질과 함께 형광 RNA 줄기 루프 결합 단백질을 나타내는 하나 이상의 세포를 포함해야 한다. 더욱이, 세포는 밝은 표지된 전사 부위를 I-SceI-GR-iRFP713 구조와 공동 으로 분리해야 하며, 단백질은 세포질에서 처음에 국한되어야 한다(도 2D 및 E).
세포는 배경 형광 수준을 통해 단일 표지된 성적증명서를 검출할 만큼 충분히 낮은 불바운드 형광 태그MS2 및/또는 PP7 코트 단백질의 형광 강도 수준을 보여줘야 한다. 동시에, 형광 태그MS2 및/또는 PP7 코트 단백질의 견고한 형광 강도 수준은 발생하는 일부 표백으로 인해 너무 많은 형광을 잃지 않고 적어도 60 분 이상 이미징을 허용해야합니다. 섹션 3.7에 설명된 바와 같이 고정 범위를 가진 "배율 이미지 디스플레이"는 형광 강도 수준에 따라 세포의 표준화된 선택을 허용하는 데 사용됩니다.
두 번째 중요한 프로토콜 단계는 유리 바닥 접시의 뚜껑에 있는 작은 구멍을 통해 미리 결정된 XY 위치에 있는 세포에 TA를 추가하는 것입니다. 유리 바닥 접시의 조작은 세포의 표시된 XY 위치에서 이동을 일으킬 것이며 피해야합니다. 따라서, 세포 성장 배지에서 희석된 TA를 첨가하면서 마이크로피펫을 신중하게 취급하는 것은 도 2F에서 입증된 바와 같이 미리 선택된 세포의 성공적인 관찰에 매우 중요하다. 관류 시스템과 같은 현미경 단계에 장착된 세포에 약물을 추가하는 다른 시스템의 적응은 튜브 입구 및 출구 개구부와 약물을 투여하기 위해 펌프 또는 주입 시스템을 갖춘 별도의 단계 인큐베이션 챔버가 필요합니다. 커버슬립과 같은 바닥 표면을 가진 채널 슬라이드와 같은 다른 방법은 투여된 약물의 느린 확산을 채널로 초래하고 약물 첨가및 효과 사이에 추가지연을 일으킨다. 마지막으로, 채널 슬라이드 개구부로 부주의한 피펫팅은 샘플 위치도 이동할 수 있다. 따라서, 유리 바닥 접시의 뚜껑에 맞춤형 드릴구멍이 있는 본 시스템은 적응하기 간단하고, 저렴한 비용으로, 다양한 성장 매체, 약물 및 성분을 투여하기에 적합하다. 단계 인큐베이션 챔버의 구멍의 작은 직경과 가습 된 대기는 또한 세포 배지에서 건조를 방지합니다.
이 프로토콜의 세 번째 중요한 단계는 DSB의 유도로 인해 전사가 중단될 때 시간 점을 수동으로 검사해야 하는 데이터 분석입니다. 전사 종료 시점은 리포터 유전자 전사의 이전에 밝은 표지된 부위로부터 마지막 녹취록을 방출함으로써 표시됩니다. 유사하게, 브레이크 유발 전사 개시의 사건은 단일 형광 표시 mRNA의 상대적으로 낮은 신호 대 잡음 비율로 개별 전사 이벤트를 검출하기 위하여 주의하여 검사되어야 합니다.
유도된 DSB의 수리 역학은 이러한 기자를 사용하여 생성된 데이터의 분석에 복잡성을 추가하여 DSB 유도 직후 첫 번째 분으로 제한합니다. 리포터 유전자의 형질전환 특성과 MS2 및 PP7 줄기 루프 어레이의 반복 풍부 특성은 독특한 크로마틴 풍경을 조립하여 안정적인 브레이크 유도 전사 프로그램을 수립하는 것을 방해할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이온화 또는 UV 조사와 비교하여, 리포터 유전자에서 DSB 의 중재 유도 는 개별 DSBs에서 전사를 조사하기 위하여 훨씬 더 강력한 시스템입니다.
인간 게놈 내에 추가 인식 부위가 있거나 없는 I-CreI, I-PpoI 또는 아시SI와 같은 상이한 엔도넬리스 시스템은 DSB생성의 가능한 더 높은 효율을 위해 본 기자 유전자 시스템과 결합될 수 있다. 그러나, 그(것)들은 먼저 기자 유전자에 엔도누네스 인식 사이트를 소개하는 것을 요구합니다. 둘째, 개별 셀에서 DSB의 타이밍 및 효율 유도에 유사한 가변성을 가질 수 있다. 한편, 엔도누클레스 인식 사이트의 탠덤 카피를 삽입하면 DSB 유도의 효율성을 높일 수 있다. 더욱이, 상이한 세포주에서 제시된 리포터 유전자 시스템을 테스트하면 다른 세포 배경과 암세포, 1차 세포 및 분화된 비순환 세포와 같은 상이한 DNA 손상 복구 경로의 가용성 사이의 DSB 부위의 전사 역학을 비교할 수 있다. 그러나, Flp/FRT 시스템과 호환되는 리포터 유전자의 생성은 현재 사용 가능한 Flp/FRT 숙주 세포주로의 통합을 제한하고 있다.
현미경 검사법 기반 응용 프로그램 이외에, 현재 리포터 유전자는 또한 염색질 면역 침전과 같은 생화학적 분석과 결합될 수 있고, 단일 DSB에 DNA 수리 또는 전사 인자의 모집을 연구하거나 DSB 사이트 의 주위에 뉴클레오소성 점유, 히스톤 수정 및 크로마틴 상태를 평가하기 위하여. 더욱이, 다른 리포터 시스템과의 조합은 게놈 조직 또는 DNA 복제 같이 DNA 손상 및 프로세스 사이 기능적인 링크의 연구 결과 허용할 것입니다.

DNA 이중 가닥 휴식 (DSBs)는 세포 기능을 방해하고 여러 질병과 노화의 반란에 기여하는 독성 DNA 병변입니다1. DSBs의 부정확한 수리로 인한 돌연변이는 유전자 발현에 영향을 미치고 세포의 기능적 쇠퇴의 기초를 설정합니다. DSBs가 병변 부위에서 드 노보 브레이크 유도 전사를 구동한다는 비상적인 견해는 DSB가 침입 유도 된 RNA를 통해 세포 기능에영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 몇몇 최근 연구 결과는 DSB가 프로그램된 (예를 들면, 자극 유도할 수 없는 유전자에서) 및 예정되지 않은 (예를 들면, 비 정경적인 프로모터에서) 전사4,5,7을 시작하기에 충분하다는 것을 표시합니다. 그러나 DNA 손상과 전사 사이의 연관성을 탐구하는 여러 연구에도 불구하고, 현장은 DNA 브레이크 사이트에서 전사 사건의 정확한 (즉, 단일 분자) 특성화를 전달하는 능력에 여전히 뒤쳐졌습니다. 이에 대한 한 가지 중요한 이유는 적절한 실험 도구의 부족이었다. 세포 조사(γ 선, 엑스레이, 무거운 이온) 및 약물 치료(예를 들어, 토포이솜라제 억제제 또는 인터칼라이닝 제)는 공간 정밀도가 부족하고 단일 가닥 브레이크 및 DNA adducts8을 포함한 DSB 이외의 DNA 병변을 유도한다. I-PpoI 및 AsiSI와 같은 엔도누클레스는 메뚜기별 DSB를 생성하지만, 높은 측두정밀을 가진 단일 궤적에서 전사의 동시 라이브 셀 시각화를 허용하는 시스템과 결합되지 않았습니다8. 이러한 한계를 우회하기 위해, 우리의 실험실은 독특한 DSB4의 통제된 유도에 따라 단일 분자 해상도로 전사를 직접 시각화하는 최첨단 기자 세트를 개발하는 데 주도했습니다. 여기서, 우리는 이 기자들을 설명하고, DSB에서 전사의 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 상세한 프로토콜을 제공하고, 단일 DSB에서 전사 개시를 드러내는 데이터를 보여줍니다.
이 프로토콜에 사용되는 리포터 유전자 시스템은 잘 특징적인 마우스 IgM 리포터 유전자를 기반으로 하며 IgM μ 중형 체인9,10,11의 멤브레인 바운드 형태(μm)의 엑슨M1 및 M2를 함유하고 있다. 하이브리드 인트론은 강한 아데노 바이러스 주요 늦은 성적 증명서 (AdML) PY tract12와 두 엑손을 분리합니다. 리포터 유전자의 발현은 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터(CMV)에 의해 제어되며, Tet 연산자(TetO) 서열의 2개의 탠덤 카피를 삽입하였다. 리포터 유전자는 각각 Flp 재조합 표적(FRT) 부위를 포함하는 플라스미드 벡터로 삽입되고 HEK293 숙주 세포주의 게놈내의 특정 FRT 표적 부위에 삽입된다. 이러한 세포수는 또한 테트라사이클린/독시사이클린의 존재 또는 부재를 통해 리포터 유전자의 발현을 조절하기 위해 Tet 억압 단백질을 구성적으로 표현한다. 기자 유전자 전사의 시각화를 허용하기 위해, MS2 줄기 루프 서열의 24탠반복및 PP7 줄기 루프 서열의 24탠반복은 리포터 유전자의 전사 개시 부위 및 엑손/인트론 구조와 관련하여 상이한 위치에 삽입되었다. MS2/PP7 RNA 줄기 루프는 전사 시 형성되며 특히 녹색 및 빨간색 형광 단백질로 태그된 ectopically 발현된 MS2/PP7 코트 단백질에 의해 결합되며, 이는 전사13,14,15를 이미지하기 전에 널리 사용되는 전략이다. 또한, 리포터 유전자내의 RNA 줄기 루프 서열 어레이에 의해 직접 측면에 있는 호밍 엔도누셀 I-SceI를 위해 18bp 인식 서열의 단일 카피를 삽입했다. 표준 복제 기술은 모든 플라스미드를 생성하기 위해 사용되었고, PROP 리포터 유전자의 I-SceI-24xMS2 줄기 루프를 함유한 단편은 상용 유전자 합성 서비스에 의해 합성되었다.
프로모터-근위 DSB 기자 유전자(PROP)는 엑슨 I에서 푸티얼 전사 시작 부위의 I-SceI 절단 부위 45기쌍(bp) 하류를 삽입하여 시 공되었으며, 24x MS2 줄기 루프 카세트가 시작될 때까지 149bp가 생성되었으며, 이는 두 개의 동일한 비동일한 줄기 루프 시퀀스로 설계되었다. 그리고 중복성을 줄이기 위해 5개의 비반복적 20bp 스페이서 시퀀스를 추가로 사용한다. MS2 줄기 루프 어레이는 1844bp 인트론과 1085 bp 엑손 II의 시작까지 72bp로 이어서 분열 및 다각성 부위까지. 엑슨 II는 인간 과옥시소말 아실 CoA 산화제로부터 C-말단 과옥시소말 표적화 서열(PTS)에 융합된 시안 형광 단백질(CFP)을 인코딩하여 리포터 유전자 발현의 독립적인 스크리닝을 허용한다(도 1A).
엑손 II DSB 기자 유전자 (EX2)는 CFP-PTS를 인코딩 하는 intron 및 엑손 II 다음에 167 bp 엑손 I로 구성. 169 bp의 거리에서 더 하류, 24x MS2 줄기 루프를 포함하는 카세트가 삽입되었고, 그 다음에 는 중앙에 I-SceI 사이트가 있는 84bp 링커 시퀀스가, 그 다음으로 24x PP7 줄기 루프와 221bp가 이어서 분열 및 다단수 부위(그림 1B)까지.
마지막으로, 항감각 전사 라벨링(EX2AS)을 가진 엑손 II DSB 기자 유전자는 인간 유비퀴틴 B(UBB) 유전자 전사 UBB-201을 기반으로 하며, 2개의 엑손과 1개의 엑손을 함유하고 있다. 24x MS2 줄기 루프 서열의 역 삽입으로 총 길이1534 bp를 가지고 있습니다. 따라서, 정확한 MS2 줄기 루프 RNA 서열은 CMV 프로모터로부터 기자 유전자의 감각 전사에 대하여 안티센스 방향으로 전사될 것이다. 인트론은 길이가 490bp이고, I-SceI 부위를 가진 엑손 II가 그 뒤를 이어, 코딩 영역은 2개의 프레임 내 유비퀴틴 서브유닛에 삽입되었다. UBB 유전자의 하류는 기자 유전자의 전사 시 24x PP7 줄기 루프를 감각 방향으로 형성하는 서열이다(도 1C).
호밍 엔도누셀 I-SceI의 유도 가능한 구조의 일시적인 트랜스페션은 각 리포터 gene18 내의 삽입된 인식 부위에서 DSB의 제어생성을 가능하게 한다. I-SceI 엔도뇌리스는 글루코코르티코이드 수용체의 리간 결합 도메인과 극한형 형광 단백질 iRFP713과 프레임에 융합된다. 이 구조는 트리암시놀론 아세토니드(TA)가 없는 경우 세포질(cytoplasmic)이지만, 세포의 성장 배지에 TA를 첨가하면 핵으로 빠르게 이동한다(도 1D). I-SceI 시스템에 의한 DSB의 유도는 18,19,20전에 입증된 바와 같이 견고합니다. 리포터 유전자 전사는 형광 태그RNA 줄기 루프 시스템 MS2 및 PP7을 시각화하여 병렬로 모니터링될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>100mW 고체 레이저</td><td>Coherent Inc., 미국 캘리포니아</td><td></td><td></td>주 산타클라라</tr><tr><td>3i Marianas SDC 컨포칼 회전 디스크 시스템</td><td>Intelligent Imaging Innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>공랭식 EMCCD 카메라 Evolve 512</td><td>Photometrics, Tucson, AZ USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer Z1 도립 현미경</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>숯 박리 소 태아 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6765-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>CO2 module S</td><td>PeCon GmbH, Erbach, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 컨포칼 회전 디스크 유닛</td><td>Yokogawa Electric, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Hepes no PhenolRed</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Doxicyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>리포터 유전자 발현 유도; 0.5 mg/ml의 원액을 1:1000 딜루션에서 사용하였다. 세포 성장 배지</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In T-REx 293 세포주</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>R75007</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI-24x MS2 줄기 루프 서열</td><td>GeneArt, Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td>단일 I-SceI 인식 서열 및 24개의 직렬 MS2 스템 루프 서열을 포함하는 맞춤형 합성 DNA 단편</td></tr><tr><td>가열 장치 습도 2000</td><td>PeCon GmbH, Erbach, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>이멀젼 오일 Immersol 518 F</td><td>Carl Zeiss MicroImaging Inc.)</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 헬퍼 시약 P3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>트랜스펙션 헬퍼 시약</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>지질 기반 트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>MatTek 35 mm 접시, 유리 바닥 번호 1.5</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>현미경 배양 챔버</td><td>PeCon GmbH, Erbach, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA5/FRT/TO</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>V652020</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 플라스미드</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 6.0 Software</td><td>Intelligent Imaging Innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테이지 배양 챔버 PeCon P-Set 2000</td><td>PeCon GmbH, Erbach, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StaQtool Software</td><td>iMM-JLA 리스본, 포르투갈</td><td></td><td>사용 가능 위치: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip</td></tr><tr><td>트리암시놀론 아세토나이드(TA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6501</td><td>합성 글루코 코르티코이드; 글루코코르티코이드 수용체가 세포질에서 핵으로 이동하도록 유도</td></tr><tr><td>트립신/EDTA 용액(TE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R001100</td><td></td></tr></tbody></table>

dna 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA 이중 가닥 휴식(DSB)은 DNA 손상의 가장 심각한 유형입니다. 게놈 무결성에 치명적인 결과에도 불구 하 고, 그것은 지금까지 어려운 DSBs 전사에 영향을 미치는 방법. 그 이유는 충분한 시간적 및 공간 해상도를 가진 조네이닉 DSB의 전사와 유도를 동시에 모니터링할 수 있는 적합한 도구가 부족하기 때문입니다. 이 작품은 DNA 템플릿에서 DSB를 유도한 직후 살아있는 세포에서 전사를 직접 시각화하는 새로운 기자 집합을 설명합니다. 박테리오파지 RNA 줄기 루프는 단일 분자 감도로 전사를 모니터링하기 위해 사용된다. 특정 유전자 부위에 DSB를 탈피하기 위해, 리포터 유전자는 인간 게놈에서 결석한 호밍 엔도누셀 I-SceI의 단일 인식 서열을 포함하도록 설계된다. 각 리포터 유전자의 단일 사본은 인간 세포선의 게놈에 통합되었다. 이 실험 계통은 정영 유전자 전사 또는 DNA 브레이크 유도 전사 개시에 의해 생성된 단 하나 RNA 분자의 검출을 허용합니다. 이 기자들은 전사와 DNA 손상 사이의 상호 작용을 해석하고 DNA 파손 유발 전사의 지금까지 인정받지 못하는 측면을 공개할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다.

도 1A-C에 기재된 리포터 유전자를 수용하는 세포선은 살아있는 세포에 있는 단 하나 DSB에서 전사 역학의 연구를 허용합니다. 각 그래픽 리포터 유전자 표현 아래 그림 1A-C의 숫자는 킬로베이스 쌍(kbp)의 길이를 나타낸다. CMV는 시토메갈로바이러스 프로모터를 나타내고, TetO는 Tet-operator sequences이며, pA는 유전자 끝에서 3'골짜기 및 폴리 아데닐레이션 부위를 강조한다. CFP-PTS는 폐산소 표적화 신호에 융합된 인코딩된 시안 형광 단백질이며, 2UBB는 인코딩된 인간 유비퀴틴 B 탠덤 유닛이다. 상술한 프로토콜 및 분석 절차에 따라, 시간이 지남에 따라 형광표시 기자 유전자 전사체의 수를 표시하는 그래프를 얻을 수 있으며, 최대 시간 동안 초의 시간적 해상도(그림 4A-D). 도 4A의 그래프는 초기 성적증명서에 MS2-GFP 분자의 축적에 의해 표지된 PROM 리포터 유전자 전사 부위의 TFI 값의 시간 과정을 나타낸다. 이 특정 그래프는 TA 첨가 없이 제어 실험을 나타낸다. 따라서 DSB가 유도되지 않습니다. 전사는 60 분의 전체 관찰 기간 동안 한 번에 버스트와 같은 봉우리와 2-8 성적 증명서로 계속됩니다. EX2 및 EX2-AS 기자 유전자(여기에 표시되지 않은 데이터)를 위해 유사한 결과를 얻었다. 기자 유전자(I-SceI-GR-iRFP 사용)에서 단일 DSB를 유도하면 DSB의 진행 중인 기자 유전자 전사 및 DSB 부위에서 나오는 전사 사건의 모니터링, 즉 브레이크 유도 전사(그림 4B-D)에 대한 DSB의 영향을 연구할 수 있습니다.
DNA 브레이크 유도 전사의 역학은 유전자 내의 DSB의 위치에 따라 달라집니다. 프로모터-근위 I-SceI 인식 부위를 가진 기자 유전자에서 I-SceI-GR-iRFP에 의한 단일 DSB의 유도는 TA 첨가 후 약 11분 후에 기자 유전자의 전사 침묵으로 이어지며, 전사는 60분 관찰 기간(도 4B) 내에서 복원되지 않는다. EX2 기자 유전자 전사를 관찰할 때, 정경 프로모터 구동 전사의 완전한 억제는 TA 첨가 후 약 30분 후에 MS2-GFP 및 PP7-RFP 신호 모두의 완전한 손실에 의해 검출되었다. 그러나, 10 분 안에, 전사는 PP7-RFP 형광의 피크를 다시 나타나는 에 의해 드러낸 대로, 다시 시작됩니다. PP7-RFP 신호의 완전한 복구(그리고 MS2-GFP 형광이 아님)는 손익분기 유발 전사 개시(도 4C)를 나타낸다. 파손 유발 전사는 장시간 안정되지 않습니다. 그것은 DSB 사이트에서 몇 번의 브레이크 유도 성적 증명서가 시작되었다는 것을 나타내는 버스트와 같은 낮은 피크 강도로 나타납니다.
I-SceI 부위의 엑슨 II 하류에 24x PP7 줄기 루프 어레이를 함유한 EX2AS 리포터 유전자는 TA 추가 후 약 25분 이내에 EX2AS 기자 유전자 내에서 기공 프로모터 구동 전사를 기재하는 것을 나타낸다. 그런 다음 안티센스 MS2 줄기 루프 서열로부터 생성된 RNA에 대한 MS2-GFP 단백질 결합의 축적에 의해 밝혀진 바와 같이 안티센스 브레이크 유도 전사로 대체된다(도 4D). 안티센스 전사 활동은 DSB의 유도로 인한 감각 전사의 중단 전에 결석하고 이 예에서 여러 녹취록이 약 15 분 이내에 브레이크 사이트에서 시작되었다는 것을 보여줍니다. 여기에서 얻은 대표적인 데이터는 DSB가 유전자 내의 그들의 위치에 따라서 전사에 다른 효력이 있다는 것을 보여줍니다, 최근에 보고된 바와 같이 4. 데이터는 또한 TA 추가 후에 12 에서 30 분 범위 I-SceI-GR-iRFP에 의한 DSB 유도의 타이밍에 있는 세포 가변성을 드러냅니다. 더욱이, 개별 전사체의 검출은 세포가 끊기 유발 전사 활동의 강도로 세포 및 파손 부위 차이를 발견할 수 있게 한다. 손침입 유도 전사는 유전자 내의 DSB에서만 검출됩니다. 그것은 나머지 관측 기간 동안 DSB에 정경 전사가 중단되는 프로모터 근위 DSB에 없습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig1v2.jpg"> 도 1: 리포터 유전자와 DNA 이중 가닥 브레이크를 유도하는 시스템. (A)에서 (C)의 회로도 표현은 DNA 이중 가닥 파손의 유도시 전사를 연구하는 데 사용되는 3개의 리포터 유전자의 구조를 나타낸다. 제1 엑시온(PROM)에서 프로모터-근위 I-SceI 부위를 가진 리포터 유전자는 24x MS2 줄기 루프(MS2-SL) 서열 배열에 의해 하류로 측면이 있는 (A)에 묘사된다. 제2 엑슨(EX2)에서 I-SceI 부위를 가진 리포터 유전자는 24x MS2 줄기 루프 서열및 하류로 상류로 24x PP7 줄기 루프(PP7-SL) 어레이에 의해(B)로 도시된다. I-SceI 부위에 위치한 I-SceI 부위를 가진 리포터 유전자는 I-SceI 부위의 24x MS2 줄기 루프 서열 상류의 항병렬 삽입을 통해 안티센스 전사(EX2-AS)를 검출하는 것으로 나타났다(C). I-SceI-GR-iRFP 융합 단백질 구조의 기능은 아래 라이브 셀의 그래픽 디스플레이 및 해당 이미지에 의해 (D)로 묘사된다. 기자 유전자 세포주에서 분재(적색)의 일시적인 발현시, 단백질은 전적으로 세포질로, I-SceI 엔도니션에 의한 표적 부위의 조기 분열을 방지한다. TA를 첨가하면 융합 단백질이 세포 핵으로 이동하기 시작하고(대시 선으로 표시) 5-15분 사이에 축적하기 시작합니다. Scalebar = 10 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig2v2.jpg"> 그림 2: 전사 부위의 3D 타임랩스 이미징을 위한 셀 선택. (A)의 사진은 살아있는 세포 이미징에 사용되는 35mm 유리 바닥 접시를 보여주며, 맞춤형 수정 된 뚜껑을 사용하여 3mm 직경의 구멍을 뚫어 성장 배지에서 희석 된 TA를 직접 첨가합니다. 구멍 위치는 빨간색 원으로 표시됩니다. (B)의 패널은 라이브 뷰 노출 시간, 필터 설정, 레이저 강도 및 스케일 이미지 디스플레이를 설정하는 현미경 제어 소프트웨어의 "초점" 창의 스크린샷을 보여 주며, 해당 "캡처" 창의 스크린샷은 라이브 셀의 3D 타임랩스 획득을 위한 모든 설정을 조정한다. 필터, 캡처 유형, 타임랩스 캡처 및 3D 캡처 창에 대한 특정 설정은 섹션 3에 설명되어 있습니다. 여기에 나타난 보기에서, 설정은 리포터 유전자의 프로모터-근접 영역에서 DNA 이중 가닥 파손의 유도시 이미징 전사를 위한 MS2-GFP 및 I-SceI-GR-iRFP 구조로 전염된 PROM 리포터 유전자 라인의 3D 시간 경과를 획득하도록 조정된다. (D)의 이미지는 GFP 및 iRFP 채널을 위해 병합되고 293-PROM 리포터 유전자 세포주의 여러 세포와 함께 현미경 시스템을 통해 본 바와 같은 시야를 나타낸다. 세포는 핵 국소화 서열, 2개의 녹색 형광 단백질(GFP-MS2CP), 및 I-SceI-GR-iRFP 구조에 융합된 탠덤 디머 MS2 코트 단백질 구조와 공동 으로 전염되었다. 몇몇 세포는 GFP-MS2CP 구조의 발현을 나타내며, 그로 인해 핵과 I-SceI-GR-iRFP 구조를 강조하여 세포질을 강조한다. 파선된 사각형은 (E)에 표시된 확대 된 영역을 나타냅니다. 3D 타임랩스 이미징의 경우, 세포는 (D)에서 확대된 영역에서 더 큰 핵을 가진 세포와 같은 토론에서 부여된 요구 사항에 따라 선택된다. 이 세포는 두 형광 구조로 전염되며, 드 노보 전사 기자 유전자 사전 mRNA(왼쪽 이미지)에 GFP-MS2CP를 축적하여 밝게 표지된 전사 부위(arrowhead)를 나타낸다. 세포의 성장 배지는 TA를 포함하지 않는다; 따라서 I-SceI-GR-iRFP 구조는 독점적으로 세포질(오른쪽 이미지)입니다. (F)에서, 유리 바닥 접시는 3D 타임랩스 이미징 실험을 위해 현미경 단계 인큐베이션 챔버에 장착되고 TA 로딩 구멍을 포함하는 사용자 정의 뚜껑을 갖추고 있습니다. 200 μL 마이크로피펫 팁은 조심스럽게 구멍에 삽입되어 희석된 TA를 세포의 성장 배지에 적용합니다. Scalebar = 10 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig3v2.jpg"> 그림 3: 이미지 수집 및 분석 소프트웨어. (A)의 패널은 STaQTool: 스팟 추적 및 정량화 도구의 스크린샷을 보여줍니다. 이미지는 중앙의 최대 강도 투영 디스플레이에서 녹색 원/흰색 사각형으로 표시된 표지된 전사 부위를 가진 PROM 리포터 유전자 세포선의 예시 계열을 표시한다. 오른쪽 창문은 선택한 전사 현장, 현재 시점에 대한 2D 가우시안 핏 그리드와 함께 해당 3D 그늘진 강도 표면 플롯뿐만 아니라 z 스택 내의 전사 부위 Z 위치, 가우시안 핏 폭(W) 및 TFI 측정에 대한 확대된 뷰를 표시합니다. (B)의 현미경 이미지는 MS2-GFP로 감염된 PROM 리포터 유전자 세포주의 핵의 줌화된 단일 광학 평면을 나타낸다. 이미지는 120개의 타임포인트가 있는 2D 교정 타임 시리즈의 일회성 지점을 나타냅니다. 핵은 핵에 있는 회절 제한된 객체로 나타나는 몇몇 형광표시된 녹취록을 보여줍니다 (백색 사각형으로 표시). 오른쪽 패널은 STaQTool에서 TFI 및 W 배포 도구의 스크린샷을 보여 2D 타임랩스 획득시 여러 지점을 분석합니다. 이 예분석에서, 이 도구는 핵에서 확산되는 MS2-GFP로 표지된 기자 유전자 전사체를 나타내는 408개의 회절 제한 반점을 검출했다. 오른쪽 그래프에는 TFI와 가우시안핏 너비 분포 히스토그램과 가우시안 핏 커브가 표시됩니다. 가우시안 핏 곡선의 중심 피크 위치에서 파생된 TFI 및 W 평균 값과 계산된 신뢰도 간격이 각 창에 표시됩니다. Scalebar = 10 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig4v2.jpg"> 그림 4: DNA 이중 가닥 휴식 부위의 전사 검출의 대표적인 결과. (A)에서 (D)의 그래프는 시간이 지남에 따라 하나의 전사 사이트의 보정된 TFI 곡선을 나타냅니다. TFI 값은 각각의 실험에서 사용되는 RNA 줄기 루프 결합 단백질 MS2 또는 PP7에 대한 각각의 리포터 유전자 구조 및 형광 태그된 RNA 줄기 루프 결합 단백질 MS2 또는 PP7에 대한 교정 실험에서 측정된 단일 전사체의 평균 TFI를 사용하여 전사체로 변환된다. (A)에서, TA 첨가 없이 PROM 리포터 유전자를 이용한 대조군 실험으로부터의 그래프가 나타난다. MS2-GFP로 표시된 성적증명서는 전체 관찰 기간 동안 지속적인 전사 활성을 나타냅니다. (B)의 그래프는 TA 첨가 및 DSB의 유도시 PROM 기자 유전자를 나타내며, 이는 남은 관찰 시간 동안 전사의 억제로 이어진다. (C)의 EX2 리포터 유전자 그래프는 TA 첨가 시 정경 프로모터 중심의 전사의 전사 억제를 나타낸다. 나중에 같은 시간 경과에서 PP7-RFP 표지된 전사 활동만 나타난다. 그래프에서 (D), 정경 프로모터로부터의 EX2-AS 기자 유전자 전사는(C)에서 EX2 리포터 유전자에 첨가된 TA에 대해 유사하게 억제된다. 그러나, MS2-RFP 표지된 녹취체의 출현은 TA 첨가 전에 센스 전사 활동 중에 존재하지 않는 안티센스 전사를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>리포터 셀라인</td>
			<td>EX2 및 EX2-AS</td>
			<td>무도회</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">플라스미드에서 트랜스펙트까지</td>
			<td>1.5 μg pI-SceI-GR-iRFP</td>
			<td>1.5 μg pI-SceI-GR-iRFP</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry</td>
			<td>0.5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 리포터 유전자 세포주 의 이식. 표는 다른 리포터 유전자 세포주를 일시적으로 transfect하는 데 사용되는 다른 플라스미드의 형질 과적 계획 및 양을 설명합니다.

이 프로토콜은 단일 분자 감도를 가진 DNA 이중 가닥 브레이크에서 전사를 검출하기 위하여 새로운 기자 유전자 시스템 및 실험적인 설치를 제시합니다.

DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

이 프로토콜은 전사 사건을 관찰하고 검출할 수 있게 하고 유전자의 지속적인 전사에 DNA 이중 가닥 휴식의 효력에 관하여 통찰력을 줍니다. 이 기술의 주요 장점은 총 1시간 이상의 시간 동안 초당 간격으로 단일 세포에서 개별적으로 표지된 RNA 전사체의 관찰이다. 이 방법은 DNA 복제 및 DNA 병변과 같은 전사와 세포 과정 사이의 교차토크를 조사하기 위해 DNA 손상 반응에 대한 통찰력을 제공합니다.우리의 조언은 독시사이클린을 사용하여 세포를 관찰하고 전사 부위와 표지 된 RNA 분자의 검출을 훈련하기 위해 교정 측정을 수행하는 것입니다. 1.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에서, 경질 도우미 시약에서 감소된 혈청 MEM 혈장 DNA 150마이크로리터와 DNA 의 마이크로리터 당 2.5 마이크로그램을 포함하는 솔루션 A를 준비한다. 동시에, 지질 계 형질 전환 시약에서 DNA의 마이크로리터 당 150 마이크로 리터및 1.5 마이크로 그램을 포함하는 용액 B를 준비합니다.실온에서 솔루션을 5분 간 배양한 다음 솔루션 A를 솔루션 B에 부드럽게 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 세포를 변형시키기 위해, 혼합 용액 A와 B의 300 마이크로 리터를 각 접시에 드롭 와이즈를 추가하고 부드럽게 분배합니다. 유리 바닥 접시를 100mm 표준 세포 배양 접시 안에 보관하고 5 %의 이산화탄소로 가습 된 분위기에서 섭씨 37도에서 배양하십시오.페놀 레드 없이 HEPES로 200 마이크로리터를 장착하고 10%의 숯을 벗겨진 태아 소 세럼으로 보완한 다음 TA를 추가하여 1.5 밀리리터 마이크로센심심분리기 튜브를 준비합니다. 현미경 관찰을 시작하기 약 1 시간 전에, 성장 배지에 독시 사이클린을 추가하여 기자 유전자의 전사를 유도하고 부드럽게 200 마이크로 리터 마이크로 파이프로 위아래로 파이펫하여 혼합. 관찰을 시작하기 전에 적어도 30 분 현미경으로 세포를 수송하고 예열 된 큰 현미경 인큐베이션 챔버 내부의 세포와 함께 100 밀리미터 접시를 놓습니다. 마이크로센트심분리기 튜브를 대형 현미경 환경 챔버 내부에 미리 희석된 TA로 배치하여 섭씨 37도까지 데우십시오.유리 바닥 접시의 뚜껑을 드릴링 된 3 밀리미터 직경 구멍이있는 뚜껑으로 교체하십시오. 현미경 제어판에서 100X 오일 침지 목표를 선택하고 목표에 침지 오일 한 방울을 적용합니다. 현미경 단계 인큐베이션 챔버 내부의 세포와 유리 바닥 접시를 설정하고 장소에 잠근 다음 단계 인큐베이터의 뚜껑과 현미경 하우징의 모든 문을 닫습니다.현미경 작동 및 제어 소프트웨어를 시작하고 포커스 제어 창을 열고 범위 창을 클릭합니다. 배출 선택 창에서 100% 눈 상자를 클릭하여 눈별 직접 시료 관찰을 위한 안구 빔 경로를 설정합니다. 필터 세트 메뉴에서 아이 필터 세트로 전환하고 브라이트필드를 클릭한 다음 열린 브라이트필드 버튼을 누릅니다.오일이 유리에 닿을 때까지 현미경 목표를 유리 바닥 접시쪽으로 이동합니다. 안구를 살펴보고 셀의 평면에 수동으로 초점을 맞춘 다음 열린 브라이트필드 버튼을 끕니다. 실험 관측을 시작하기 전에 세포를 30분 동안 방치하여 환경 조건에 적응하고 온도 그라데이션으로 인해 이미징 중에 초점 드리프트를 방지할 수 있습니다.실온에 200 마이크로리터 마이크로파이프와 200 마이크로리터 필터 팁을 설정합니다. 현미경 제어 소프트웨어의 초점 제어 창에서 레이저 강도를 5%로 설정하고 노출 시간 동안 50밀리초의 값을 입력합니다. 캡처 창을 열어 설정을 조정하여 3차원 시간 경과를 자동화된 이미지 수집을 수행합니다.3D 캡처 획득 유형을 선택하고 0.4 마이크로미터로 분리된 12~16개의 광학 슬라이스를 설정합니다. 현재 범위의 확인란을 선택하여 캡처 후 현재 위치로 돌아갑니다. 타임랩스 캡처 창에서 시간 포인트 수에 대해 120의 값을 입력하고 간격의 경우 30초를 입력합니다.텍스트 원고에 언급된 대류 형광 단백질 라벨에 따라 설정된 공초점 필터세트를 선택하고 각 채널의 노출 시간을 50밀리초로 설정합니다. 레이저 전원에 대한 설정 전류를 사용하여 포커스 창에서 선택한 5%의 값을 사용합니다. 초점 제어 창에서 카메라 창으로 이동하여 스케일 이미지 표시 컨트롤을 선택하고 수동 버튼을 선택하여 표시할 이미지 강도의 고정 범위를 설정합니다.DNA 이중 가닥 브레이크를 유도할 때 전사 부위의 3D 타임랩스 이미징을 위한 세포를 선택합니다. 셀을 선별하고 텍스트 토론에 설명된 조건에 따라 세 가지 보기 필드를 선택합니다. 이전에 관측 필드의 중심에 있는 각 셀에 Z 스택의 중간 평면에 전사 부위를 포커스를 지정합니다.설정 점을 클릭하여 포커스 컨트롤 창의 XY 평면에 각 XYZ 위치를 표시합니다. 미리 희석된 TA의 200마이크로리터를 세포에 추가하고 캡처 창에서 시작을 클릭하여 3D 타임시리즈 이미징을 시작합니다. 현미경 제어 컴퓨터 하드 드라이브에 현미경 제어 소프트웨어 데이터 형식에 이미징 데이터를 저장합니다.현미경 이미지 수집을 시작하기 전에 세포의 성장 배지에 독시 사이클린의 밀리리터 당 0.5 마이크로 그램을 추가합니다. 현미경 단계 인큐베이션 챔버 내부에 유리 바닥 접시를 마운트하고 이전에 설명한 대로 이미지 수집을 준비한다. 이전과 동일한 레이저 강도 및 노출 설정을 사용합니다.2D 타임 시리즈의 캡처 설정을 설정하고 타임랩스 캡처 패널에서 500밀리초 간격으로 120시간 포인트를 설정합니다. 수백 개의 단일 전사체 TFI 측정을 계산하기 위해 데이터 집합을 생성하기 위해 여러 위치에서 수십 개의 교정 타임 시리즈를 획득합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 그래프는 최대 시간의 기간에 걸쳐 초의 시간적 해상도와 시간이 지남에 따라 형광 표지 기자 유전자 성적 증명서의 수를 표시하는 얻어진다.초기 성적증명서에 녹색 형광 단백질 분자로 표지된 MS2 코트 단백질의 축적에 의해 표지된 PROM 기자 유전자 전사 부위의 TFI 값의 시간 과정이 여기에 나와 있다. 기자 유전자에 있는 단일 DSB의 유도는 DSB 사이트에서 나오는 전사 사건의 지속적인 기자 유전자 전사 및 감시에 그것의 충격을 연구하는 가능하게 합니다, 즉 브레이크 유도 전사. DSB의 TA 첨가 및 유도는 60분까지 회복되지 않는 약 11분 후에 PROM 기자 유전자 전사의 억제로 이어집니다.PP7-RFP 신호의 완전한 복구는 고장 유발 전사 개시를 나타낸다. EXON 2 안티센스 리포터 유전자는 프로모터 구동 전사 종료를 나타내며, 이는 안티센스 MS2 줄기 루프 서열에서 생성된 RNA에 결합하는 적색 형광 단백질로 표지된 MS2 코트 단백질의 축적에 의해 밝혀진 바와 같이 안티센스 브레이크 유도 전사로 대체된다. 이미징을 위한 세포의 선택은, 각 XY 위치에 표지된 전사 부위의 Z 위치를 조정하는 처리된 타임랩스 이미징을 Z 스택의 중심으로 설정하여 획득한다.그리고 마지막으로, 성장 배지에서 희석된 TA의 첨가는 미리 선택된 위치의 임의의 이동을 방지하기 위해 극도의 주의를 기울여 실행되어야 하며, 이는 전산된 위치와 함께 이미지화되어야 한다. 살아있는 세포에서 시간이 지남에 따라 3D에서 단일 RNA 전사체의 이미징은 세포 주기 진행 중 DNA 복제 또는 전사의 변화 동안 RNA 전사를 연구하기 위해 적용될 수 있다.

live-cell-imaging-transcriptional-activity-at-dna-double-strand

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

이 프로토콜은 DNA 손상뿐만 아니라 유사 분열 동안의 현지화에 대한 응답으로 활성화 DNA 이중 가닥 브레이크 신호 단백질을 시각화하는 방법을 설명합니다.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

이 비디오에서는 인간 단핵 세포의 DNA 이중 가닥 절단 부위에 국한된 특정 DNA 손상 반응 단백질을 검출하는 면역형광 현미경 검사 기술에 대해 설명합니다. 단백질은 특정 1차 항체에 의해 인식되며, 이 항체는 다시 현미경 시각화 중에 형광을 발하는 형광단 표지된 2차 항체에 결합하여 단백질을 세포핵 내에서 뚜렷한 형광 병소로 시각화할 수 있습니다.

DNA Double-Strand Break 분석을 위한 면역형광 현미경 검사

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

본 프로토콜에서, 우리는 면역 형광 기지를 둔 방법을 사용하여 세포 주기의 S/G2 단계 도중 DNA 이중 가닥 말 절제술을 구상하는 방법을 보여줍니다.

세포 주기 차별 화상 진찰과 결합된 BrdU DNA 라벨링을 사용하여 글로벌 DNA 이중 가닥 끝 절제술의 평가

다음 프로토콜은 세포주기 동기화 후 RPA2 면역형광 염색을 사용하여 세포주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소를 검출하는 방법을 제시합니다.

세포 주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소 시각화

우리는 발광 기반 염색체 외 리포터 기질 세트를 사용하여 세포에서 이중 가닥 절단 복구 경로 숙련도를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가

배우세요 DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동을 살아있는 세포에서 단일 분자 수준으로 관찰하는 방법을 형광 현미경을 사용하여. 이 기법은 DNA 손상과 전사 간 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

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