Name: 단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 배우세요 마우스 망막 광수용체 세포 구획을 단리하는 두 가지 박리 방법을 통해 단백질 분석을 수행하는 기술입니다. 이 간단한 기법은 저렴한 실험 재료를 사용하여 건강하고 질병 상태의 막대세포 생리학적 과정을 연구할 수 있습니다.

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이 작업은 NIH Grant EY12155, EY027193 및 EY027387에서 JC에 지원했습니다. 원고를 교정해 주신 Spyridon Michalakis 박사(Caltech, Pasadena, USA)와 Natalie Chen(USC, Los Angeles, USA)에게 감사드립니다. 또한 저자가 제공한 영상을 수집하는 데 필요한 장비를 제공해 주신 Seth Ruffins 박사(USC, 로스앤젤레스, 미국)와 Janos Peti-Peterdi 박사(USC, 로스앤젤레스, 미국)에게도 감사드립니다. 소재지: Kasey Rose et al., 단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 분리, 분자 신경변성, [2017], [Springer Nature].

<ol><li>Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+proteins+and+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">G proteins and phototransduction.</a> Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).</li>
<li>Molday, R. S., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors at a glance.</a> Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).</li>
<li>Koch, K. W., Dell'Orco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+signaling+networks+in+vertebrate+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67(2015).</li>
<li>Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+light+intensity+threshold+for+retinal+damage+in+albino+rats+raised+under+6+lx%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx.</a> Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).</li>
<li>Brann, M. R., Cohen, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+expression+of+transducin+mRNA+and+translocation+of+transducin+in+rods+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina.</a> Science. 235 (4788), 585-587 (1987).</li>
<li>Philp, N. J., Chang, W., Long, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-stimulated+protein+movement+in+rod+photoreceptor+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina.</a> FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).</li>
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<li>Roof, D. J., Heth, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transducin+in+retinal+rod+photoreceptor+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments.</a> Science. 241 (4867), 845-847 (1988).</li>
<li>Sokolov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+light-driven+translocation+of+transducin+between+the+two+major+compartments+of+rod+cells%3A+a+novel+mechanism+of+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation.</a> Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+translocation+is+induced+at+a+critical+threshold+of+visual+signaling+and+is+superstoichiometric+to+bleached+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).</li>
<li>Nair, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+redistribution+of+arrestin+in+vertebrate+rods+is+an+energy-independent+process+governed+by+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions.</a> Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).</li>
<li>Strissel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recoverin+undergoes+light-dependent+intracellular+translocation+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).</li>
<li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).</li>
<li>Majumder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+contributes+to+rod+survival+and+enhances+synaptic+transmission+from+rods+to+rod+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).</li>
<li>Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+photoreceptors+die+%28and+why+they+don%27t%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Why photoreceptors die (and why they don't).</a> BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).</li>
<li>Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+susceptibility+to+light+damage+in+an+arrestin+knockout+mouse+model+of+Oguchi+disease+%28stationary+night+blindness%29%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness).</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).</li>
<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-1+expression+level+in+rods%3A+balancing+functional+performance+and+photoreceptor+health%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health.</a> Neuroscience. 174, 37-49 (2011).</li>
<li>McConnell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+retinal+outer+segment+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The isolation of retinal outer segment fragments.</a> The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).</li>
<li>Tsang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+target+enzyme+in+deactivation+of+photoreceptor+G+protein+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo.</a> Science. 282 (5386), 117-121 (1998).</li>
<li>Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recordings+of+retinal+bipolar+cells+in+response+to+extracellular+electrical+stimulation+in+wholemount+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).</li>
<li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research.+Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li>
<li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+by+cyclin-dependent+protein+kinase+5+of+the+regulatory+subunit+of+retinal+cGMP+phosphodiesterase.+II.+Its+role+in+the+turnoff+of+phosphodiesterase+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).</li>
<li>Wolbring, G., Cook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+and+characterization+of+protein+kinase+C+from+bovine+retinal+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments.</a> European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).</li>
<li>Williams, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein+kinase+C+in+photoreceptor+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments.</a> Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).</li>
<li>Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+form+of+the+G+protein+beta+subunit+Gbeta5+is+specifically+expressed+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).</li>
<li>Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTPase+activating+factor+for+transducin+in+rod+photoreceptors+is+the+complex+between+RGS9+and+type+5+G+protein+beta+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).</li>
<li>Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+rhodopsin%2Farrestin+complex+leads+to+retinal+degeneration+in+a+transgenic+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).</li>
<li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+photoresponses+and+light-induced+apoptosis+in+rods+lacking+rhodopsin+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mistrafficking+of+prenylated+proteins+causes+retinitis+pigmentosa+2%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2.</a> FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).</li>
<li>Weiss, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+differences+in+expression+of+G-protein-coupled+receptor+kinase+%28GRK%29+7+and+GRK1+in+mammalian+cone+photoreceptor+cells%3A+implications+for+cone+cell+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).</li>
<li>Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+forms+of+human+rhodopsin+kinase+%28GRK1%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1).</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).</li>
<li>Newton, A. C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+phosphorylation+of+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).</li>
<li>Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+protein+kinase+C+isoforms+are+required+for+rod+photoreceptor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).</li>
<li>Sokal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+kinase+C+isozymes+responsible+for+the+phosphorylation+of+photoreceptor-specific+RGS9-1+at+Ser475%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).</li>
<li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28(2017).</li>
<li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+degeneration%3A+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li>
</ol>

저자들은 그들이 경쟁하는 이익이 없다고 선언합니다.

많은 망막 질환이 막대 광수용체 세포에 영향을 미쳐 막대 사망으로 이어지고 궁극적으로 완전한 시력 상실37로 이어집니다. 인간 망막 변성의 유전 적 및 기계론적 기원의 상당 부분이 수년에 걸쳐 수많은 마우스 모델에서 성공적으로 재생산되었습니다. 이러한 맥락에서, 작은 마우스 망막으로부터 개별 막대 하부 세포 구획을 쉽고 선택적으로 분리하는 능력은 망막 질환의 국부적 인 생화학 적 및 분자 토대에 대한 우리의 이해를 크게 향상시킬 것입니다. 또한, 신경 망막의 층상 특성은 막대 광수용체의 독특하고 고도로 편광 된 배열과 결합되어 선택적 박리에 의해로드 구획의 분리를 허용합니다. 이 원고는 면역 블롯팅을 위해 막대 광수용체 세포의 개별 세포 하위 구획을 분리하는 데 사용되는 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 두 방법 모두 기존의 접선 단면화 방법과 비교할 때 상당히 빠르고 기술적으로 덜 어려울 뿐만 아니라9, 밀도 구배를 사용하는 ROS의 일반적인 ...

신경 망막의 최외곽층에 단단히 포장 된 막대 광수용체 세포는 희미한 빛 시력의 필수적인 부분입니다. 충실한 광자 카운터 역할을 하기 위해 로드는 광형질도입(phototransduction)이라고 불리는 G-단백질 기반 신호전달 경로를 활용하여 단일 광자 포획에 대한 신속하고 증폭되며 재현 가능한 반응을 생성합니다. 빛에 대한 이러한 반응은 궁극적으로 원형질막에서 전류의 변화를 촉발시키고 그 후 시각 시스템의 나머지 부분에 신호를 보냅니다1. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, 각 막대 세포는 뚜렷한 막대 모양의 모양을 가지며 외부 세그먼트 (OS), 내부 세그먼트 (IS), 세포체 (CB) 및 시냅스 말단 (ST)으로 구성된 고도로 편광 된 세포 형태를 나타냅니다. 각 세포 하부 구획에는 특정 단백질 기계 (막 결합 및 용해성), 생체 분자 특징 및 시각적 광형질도입, 일반적인 하우스 키핑 및 단백질 합성, 시냅스 전달과 같은 중요한 역할을하는 단백질 복합체가 있습니다2,3.
30여 년 전, 아세포 단백질, 특히 트랜스듀신(OS로부터 멀어짐)과 어레스틴(OS를 향하여)의 광의존적 상호 이동이 처음 관찰되었다4,5,6,7. 초기에, 이 관찰된 현상은 부분적으로는 에피토프 마스킹에 대한 면역조직화학의 취약성 때문에 회의론으로 받아들여졌다8. 2000년대 초에, 자극-의존성 단백질 전좌는 엄격하고 힘든 물리적 절편 기술9을 사용하여 확인되었다. 면역블롯팅에 이어 동결된 평탄한 설치류 망막의 직렬 접선 절편은 트랜스듀신9,10, arrestin11,12 및 recoverin13이 모두 빛에 반응하여 세포하 재분배를 겪는다는 것을 밝혀냈다. 이러한 주요 신호전달 단백질의 광구동 전좌는 광형질도입 캐스케이드9,14,15의 감도를 조절할 뿐만 아니라, 광손상에 대한 신경보호가 될 수도 있다고 여겨진다16,17,18. 막대에서의 광 구동 단백질 수송은 막대 세포 생물학 및 생리학에 매우 중요한 것으로 보이기 때문에 단백질 분포를 결정하기 위해 다른 세포 하위 구획을 분리 할 수있는 기술은 귀중한 연구 도구입니다.
현재, 막대 세포 하부 구획을 분리하기위한 몇 가지 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 길고 재현하기 어렵거나 상당한 양의 망막 분리가 필요할 수 있습니다. 밀도 구배 원심분리19를 통한 막대 외부 세그먼트(ROS) 제제는 예를 들어, 망막 균질물로부터 ROS를 분리하는데 일반적으로 사용된다. 이 방법은 웨스턴 블롯에 널리 사용되지만 절차는 매우 시간이 많이 걸리고 최소 8-12 뮤린 레티네20이 필요합니다. 한편, 냉동 뮤린 및 래트 망막의 직렬 접선 절편은 OS, IS, CB, 및 ST9,11,13을 단리하는데 성공적으로 구현되었다. 그러나이 방법은 접선 절편화 전에 망막 층을 정렬하기 위해 작고 고도로 구부러진 뮤린 망막을 완전히 평평하게 할 필요가 있기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 시각 시스템의 질병을 되풀이하는 마우스 모델과 트랜스제닉 마우스가 과다하기 때문에 개별 막대 구획을 안정적이고 신속하며 쉽게 분리하는 기술의 생성은 각 특수 구획에서 발생하는 생리 학적 과정과 건강 및 질병의 시각적 과정의 기초가되는 메커니즘을 드러내는 데 공약을 가지고 있습니다.
이러한 조사를 용이하게하기 위해, 우리는 현재의 프로토콜보다 더 쉽게 막대 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 박리 방법을 설명합니다. 패치 클램프 기록21을 위해 형광 표지된 양극성 세포를 노출시키는 기술로부터 적응된 첫 번째 박리 방법은 셀룰로오스 여과지를 사용하여 살아있는 분리된 뮤린 망막으로부터 ROS를 순차적으로 제거한다(도 1). 병아리22 및 개구리23 망막으로부터 3개의 일차 망막 세포층을 분리하는 절차에서 적응된 두 번째 방법은 접착 테이프를 사용하여 동결건조된 망막으로부터 ROS 및 막대 내부 세그먼트(RIS)를 제거한다(그림 2). 두 절차 모두 1 시간 내에 완료 할 수 있으며 상당히 사용자 친화적입니다. 우리는 로드 트랜스듀신(GNAT1) 및 어레스틴(ARR1)의 광유도 전좌를 입증하기 위해 C57BL/6J 마우스로부터의 어두운 적응 및 광노출 망막을 활용하여 웨스턴 블롯에 대한 이러한 두 가지 분리 프로토콜의 효과에 대한 검증을 제공합니다. 또한, 테이프 필링 방법을 사용하여, 우리는 우리의 기술이 면역 세포 화학 (ICC)에 의해 획득 된 단백질 국소화 데이터와 서양 블로트 사이의 불일치를 조사하고 해결하는 데 사용될 수 있다는 추가적인 증거를 제공합니다. 구체적으로, 우리의 기술은 1) 단백질 키나아제 C-알파 (PKCα) 이소형이 양극성 세포뿐만 아니라 뮤린 ROS 및 RIS에도 존재하며, 낮은 농도임에도 불구하고24,25, 및 2) 로돕신 키나아제 (GRK1)가 단리된 OS 샘플에 우세하게 존재한다는 것을 보여주었다. 이 데이터는 특정 막대와 망막 단백질을 분리하고 정량화하기위한 두 가지 박리 기술의 효과를 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>튜빙 캡 어댑터가 장착된 100mL 실험실 또는 미디어 병</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>100% O2 탱크</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1000mL 보틀 탑 필터, PES 필터 재료, 0.22 &mu; m</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-235</td><td></td></tr><tr><td>4X SDS 샘플 버퍼</td><td>Millipore Sigma</td><td>70607-3</td><td></td></tr><tr><td>50mL 팔콘 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>95% O2 및 5% CO2 탱크</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ames' 중탄산염 없는 L-글루타민이 포함된 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2(99%, 이수화물)</td><td>Sigma</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Drierite(무수 황산칼슘, >98% CaSO4, >2% CoCl2)</td><td>WA Hammond Drierite Co LTD</td><td>21005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Easy-Grip Petri Dish (폴리스티렌, 35 x 10 mm)</td><td>Falcon-Corning</td><td>08-757-100</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 이지 그립 티슈 배양 접시 (60 x 15mm)</td><td>팔콘코닝</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>깃털 메스 (10 호, 40mm)</td><td>VWR</td><td>100499-578</td><td></td></tr><tr><td>깃털 메스 (11 호, 40mm)</td><td>VWT</td><td>100499-580</td><td></td></tr><tr><td>KCl (99 %)</td><td>시그마</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>킴 블 콘테스 펠렛 유 봉</td><td>시그마</td><td>z359971</td><td></td></tr><tr><td>Labconco 급속 냉동 플라스크</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LN2(액체 질소) + 듀어 플라스크 또는 이와 유사한 진공 플라스크</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q/de-ionized water</td><td>EMD Millipore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4(분말)</td><td>J.T. 베이커</td><td>4062-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (결정)</td><td>EMD 밀리포어</td><td>Sx0420-3</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Amresco</td><td>0865</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur EDTA</td><td>EMD</td><td>4005</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur HEPES, Free Acid</td><td>EMD</td><td>5320</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds 랩 알루미늄 호일</td><td>Reynolds Brands</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>스카치 매직 테이프 (12.7 mm x 32.9 m)</td><td>Scotch-3M</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 데옥시콜레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D67501</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge 미니 원심분리기</td><td>Labnet International, Inc</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 챔버 (구매 또는 맞춤 제작)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>4103-02</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Signma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>VirTis 벤치탑 2K 동결건조기 또는 이와 동등한 기계</td><td>SP Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VWR 등급 413 파일러 용지 (지름 5.5 cm, 기공 크기 5 &mu; m)</td><td>VWR</td><td>28310-015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 등급 1 품질 여과지 (지름 9cm, 기공 크기 11 &mu; m)</td> <td>Whatman / GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>와이드 보어 이송 피펫, Global Scientific</td><td>VWR</td><td>76285-362</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

막대 광수용체는 뚜렷한 구획을 가진 고도로 편광 된 감각 뉴런입니다. 마우스 막대는 길고 (∼80 μm) 얇고 (~2 μm) 망막의 최외곽층, 광수용체 층에 측방으로 패킹되어, 유사한 세포 하부 구획의 정렬을 초래한다. 전통적으로, 동결된 평탄한 망막의 접선 절편은 상이한 막대 구획 내의 단백질의 이동 및 국소화를 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 막대 지배적 마우스 망막의 높은 곡률은 접선 단면화를 어렵게 만든다. 구획 사이의 단백질 수송에 대한 연구에 동기를 부여하여, 우리는 막대 외부 세그먼트 (ROS)와 서부 블로트를위한 다른 세포 하부 구획을 안정적으로 분리하는 두 가지 박리 방법을 개발했습니다. 우리의 비교적 빠르고 간단한 기술은 농축 및 아세포 특이적 분획을 제공하여 정상 막대에서 중요한 광수용체 단백질의 분포 및 재분포를 정량적으로 측정합니다. 더욱이, 이러한 분리 기술은 또한 건강한 망막 및 퇴행성 망막 내의 다른 세포층의 단백질 조성을 분리하고 정량적으로 조사하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.

본 전략은 웨스턴 블롯 분석을 위해 특정 막대 세포 구획들 사이에서 단백질을 분리하고 분석하는 비교적 빠르고 간단한 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 우리는 두 가지 순차적 박리 기술 (그림 1 및 그림 2)을 적용한 다음 면역 블롯팅을 적용하여 이러한 방법이 암흑 및 광 적응 동물 모두에서 막대 트랜스 듀신 (GNAT1) 및 어레스틴 (ARR1)의 알려진 분포를 검출하는 데 안정적으로 사용될 수 있음을 입증했습니다. 다른 세포층으로부터의 오염 없이 막대 세포 하부 구획을 정밀하게 분리하는 데 있어서 우리의 두 프로토콜의 효과를 검증하기 위해, 시토크롬 C(Cyt C), 액틴 및 Gß5S/Gß5L26에 대한 항체로 면역블롯을 조사하였다. 사용된 항체 및 희석물의 리스트가 표 1에 제시된다. Cyt C 및 액틴은 근위 망막에 풍부한 단백질이지만 ROS에...

이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

여기에서 입증 된 두 가지 필링 기술은 개별 막대 세포 하부 구획을 분리하고 건강하고 병든 막대의 각 특수 구획에서 발생하는 중요한 생리 학적 과정을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 마우스 망막에서 다른 막대 세포 구획을 분리하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 간단한 기술은 저렴하고 평범한 실험실 재료를 사용하여 단백질 분석을 위해 막대 세포 하부 구획을 안정적으로 분리합니다.시작하려면 100 % 산소로 버블 링된 Ames HEPES 버퍼로 채워진 페트리 접시에 여과지 조각을 넣으십시오. 그런 다음, 넓은 보어 전달 피펫을 사용하여, 두세 달 된 C57 Black 6J 마우스로부터 해부된 망막 사각형 하나를 옮긴다. 분할 된 망막을 오목하게 향하게하고 광수용체가 접시의 바닥을 향해 아래로 향하고 있는지 확인하십시오.그런 다음 핀셋을 사용하여 반으로 줄어든 망막의 측면을 가볍게 잡고 여과지 위로 옮깁니다. 망막이 중앙에 배치되면 여과지를 위쪽으로 움직여 반으로 줄인 망막이 여과지에 닿아 막대 외부 세그먼트를 만들거나 ROS를 필터링하여 용지 접착을 만듭니다. 부착된 망막이 있는 여과지를 조심스럽게 Ames HEPES 버퍼에서 들어올립니다.여과지의 아래쪽을 종이 타월에 놓고 두세 번 닦아 말립니다. 망막이있는 여과지 측면에 Ames HEPES 한 방울을 넣고 여과지를 종이 타월에 다시 올려 놓고 말리십시오. 그런 다음 망막이있는 여과지를 페트리 접시에 다시 넣고 핀셋을 사용하여 반으로 줄어든 망막의 모든 가장자리를 부드럽게 밀어 올리고 모든면의 여과지에서 멀리 떨어 뜨립니다.망막을 여과지에서 섬세하게 벗겨 내고 망막의 극한 둘레만 만져서 구조적 완전성을 유지합니다. 그런 다음 페트리 접시에서 여과지를 들어 올리고 종이 타월에서 과도한 액체를 제거하여 망막과 접촉하는 쪽이 종이 타월에 닿지 않도록하십시오. 부분 ROS 층이 있는 여과지를 얼음 위에 라벨이 붙은 튜브에 넣고, 껍질을 벗긴 망막을 Ames HEPES 완충액에 잠기게 유지한다.이 반으로 줄어든 망막에 대해 박리 과정을 대략 일곱 번에서 여덟 번 반복하여 전체 ROS 층을 제거한다. 각각의 껍질 후에, 여과지를 동일한 튜브에 넣어 하나의 반으로 줄어든 망막으로부터 분리된 모든 ROS를 결합시킨다. 즉시 사용할 수 있도록 분리된 ROS의 모든 여과지 껍질이 들어있는 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.핀셋을 사용하여 남은 껍질을 벗긴 망막을 적절하게 라벨이

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

해부 기술은 유리체, 망막, 그리고 마우스 눈에서 렌즈, 원심 분리에 의해 분리하고, 단백질 as​​says과 특성화의 내장 적출을 보여줍니다.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

단일 망막 세포와 그 cDNAs의 후속 증폭의 절연을위한 방법을 설명합니다. 단일 세포 transcriptomics는 조직의 세포 이질 선물의 정도를 보여 희귀 세포 집단에 대한 새로운 마커 유전자를 알게되어. 동반 프로토콜은 다양한 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

이 비디오는 유세포 분석을 사용하여 쥐의 원발성 망막 신경절 세포(RGC)를 분리하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 신경퇴행성 질환에서 기능적 망막 신경절 세포의 상실로 인한 시력의 주요 저하를 더 잘 이해하는 것을 목표로 망막 신경절 세포에 대한 향후 연구를 가능하게 합니다.

형광 활성화 세포 분류를 사용한 쥐 망막 신경절 세포 분리

팔일 세 마우스의 신경 망막은 4 % 젤라틴 블록의 상단에있다. 에 vibratome에 의한 광 수용체 층 (200 μm의)의 분리 후, 광 수용체는 문화 기계 및 효소 분해 후 씨앗을 품고있다. 감광체 층은 분자량, 생화학 적 분석 또는 이식에 사용될 수있다.

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

인간의 망막 fovea, 흑점, 그리고 주변 망막을 포함 하 여 기능 및 분자로 별개 영역 구성 됩니다. 여기, 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 사용 하 여 부하 다운스트림 proteomic 분석이 고유한 망막 영역을 수집 하는 방법을 설명 합니다.

Proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 RPE의 해 부

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

마우스 모델은 망막 색소 상피(RPE)의 생물학을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 마우스가 일련의 RPE 병리를 개발할 수 있다는 것이 확인되었습니다. 여기에서는 빛, 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 마우스의 RPE 병리를 설명하고 정량화하는 표현형 프로토콜을 설명합니다.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

배우세요 마우스 망막 광수용체 세포 구획을 단리하는 두 가지 박리 방법을 통해 단백질 분석을 수행하는 기술입니다. 이 간단한 기법은 저렴한 실험 재료를 사용하여 건강하고 질병 상태의 막대세포 생리학적 과정을 연구할 수 있습니다.

단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법

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