Name: 합성 생물학 및 천연 제품 응용 을 위한 고수성 연쇄상 구형 전사 -번역 도구 키트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 배우세요 Streptomyces venezuelae 무세포 전사-번역 시스템을 활용한 고수율 재조합 단백질 합성 방법을. 고GC 함량 유전자의 이종 발현과 생합성 경로 미세 조절이 가능한 연구 도구입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 다음과 같은 연구 지원을 인정하고 싶습니다: PSF와 PDRA로 SJM에 대한 EPSRC [EP/K038648/1]; 웰컴 트러스트는 런던 임페리얼 칼리지에서 PSF와 SJM을 위한 ISSF 펠로우십을 후원했습니다. 왕립 학회 연구 보조금 [RGS\R1\191186]; 웰컴 트러스트 시드 상 [217528/Z/19/Z] 켄트 대학에서 SJM에 대 한; 켄트 대학교에서 KC를 위한 글로벌 챌린지 연구 기금(GCRF) 박사 장학금.

참고: GYM 매체 및 한천 플레이트 및 S30A 및 S30B 세척 버퍼용 레시피는 표 1 및 표 2 를 참조하십시오.
1. 솔루션 준비 및 일반 지침
<ol><li>예외가 명시되지 않는 한 준비 후 모든 솔루션, 세포 (성장 후) 및 세포 추출물을 얼음에 보관하십시오.</li>
	<li>Mg-글루타메이트 1개, M-K-글루타메이트 4M, PEG 6000, 실온1g/mL 폴리비닐술포닉산, -80°C의 기타 모든 주식에 대한 재고를 저장합니다. 화학 적 분해를 방지하기 위해 동결 해동 주기의 수를 최소화합니다.</li>
	<li>3-PGA(pH 조정 필요)와 같은 에너지 솔루션 주식( 표 3 참조)의 준비를 위해 대장균 TX-TL 프로토콜41에 제공된 지침을 따릅니다. 참고: 모든 구성 품은 ddH2O에서 완전히 용해되고 -80 °C 냉동고에 알리쿼시로 저장됩니다.</li>
	<li>얼음에 개별 주식 또는 에너지 솔루션 (나중에 설명)을 해동. 아미노산 스톡을 42°C에서 42°C에서 15-30분 동안 소용돌이로 가열하여 모든 아미노산을 용해시합니다.</li>
	<li>일부 아미노산 (L-Cys, L-Tyr, L-Leu)은 얼음에 침전, 휴식 시간을 최소화하면서, 실온에서이 용액을 두고 용해 소용돌이를 사용합니다.</li>
	<li>스톡 솔루션과 물의 계산된 볼륨(표 3)을 추가하고 소용돌이를 사용하여 잘 섞습니다.</li>
	<li>Aliquot는 에너지 용액을 튜브 당 20-100 μL 알리쿼트또는 원하는 대로 얼음에 저장하여 추가 사용이 가능한 때까지 -80°C에 저장합니다.</li>
</ol>2 . S. 베네수엘라 ATCC 10712 셀의 준비
<ol><li>1일 미디어/버퍼 준비 및 야간 사전 배양<ol>
<li>표 1에 설명된 대로 2L 당황플라스크에 멸균 짐 액체 배지 1L을 준비한다. 장비/화학/시약 소스 에 대한 재료 표를 참조하십시오.</li>
		<li>표 1에 설명된 대로 250mL Erlenmeyer 플라스크에서 멸균 짐 액체 배지 1 x 50mL를 준비합니다.</li>
		<li>1M HEPES-KOH pH 7.5, 1M MgCl2의 100mL, 4M NH4Cl 솔루션 500mL의 100mL를 준비하여 S30A 1L및 S30B 세척 버퍼 1L을 만듭니다. 레시피에 대한 표 2 를 참조하십시오.</li>
		<li>하룻밤 사전 문화를 준비한다. 250mL 에를렌마이어 플라스크에서 30분 동안 28°C로 GYM 액체 배지의 멸균 50mL을 미리 데워보세요.</li>
		<li>S. 베네수엘라 ATCC 10712의 단일 콜로니를 실내 마가르 플레이트로부터 체육관 액체 배지의 50mL로 접종하고 28°C에서 배양하고, 16시간 동안 200rpm(야간 사전 배양)을 접종한다.</li>
	</ol></li>
	<li>2일차- 주간 전문화와 주요 성장문화를 준비한다.<ol>
<li>멸균 된 체육관 액체 배지의 사전 웜 50 mL 250 mL Erlenmeyer 플라스크에서 28 °C에서 30 분 동안.</li>
		<li>1mL의 사전 배양을 체육관 액체 배지의 50mL로 옮기고 28°C에서 배양하고, 8시간 동안 200rpm(주간 사전 배양)을 한다.</li>
		<li>이 성장 기간 후, 1mL(1cm 경로 길이) 플라스틱 큐벳에서 멸균 체육관 배지로 1:10 희석을 사용하여 분광계에서 OD600 을 확인하십시오. 참고: OD600 은 적어도 3-4에 도달했어야 합니다. 성장이 좋지 않은 경우 2.2.1-2.2 단계를 반복하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>낮 의 배양 0.25 mL의 액체 체육관 배지 1 L로 2 L 당황 플라스크.</li>
		<li>28 °C에서 하룻밤 흔들어, 14 시간 동안 200 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>일 3-수확 세포<ol>
<li>이전 잠복기(14시간)에 이어 주요 배양액의 OD600 을 기록한다. OD600 측정을 위해 신선한 GYM 배지로 하룻밤 문화를 희석1:10 . 참고: OD600 은 이 단계에서 3.0-4.0에 도달했어야 합니다.</li>
		<li>OD600<3.0의 경우 흔들림 속도를 250-300rpm으로 늘리고 OD600에 도달할 때까지 증가합니다. 추가 2 h (총 16 시간)보다 더 이상 성장하지 않습니다.</li>
		<li>OD600>3.0의 경우 배양기를 원심분리 용기로 옮기고 젖은 얼음에서 30분 동안 빠르게 식힙니다.</li>
		<li>세포 배양이 얼음위에서 냉각되기를 기다리는 동안 , 표 1에 설명된 바와 같이 신선한 1M 디티오스레이톨(DTT), S30A 및 S30B 버퍼의 4mL을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 화학/시약 소스 에 대한 재료 표를 참조하십시오.</li>
		<li>빈 50mL 원심분리기 튜브의 사전 계량및 -20°C에서 미리 냉각합니다.</li>
		<li>얼음에 S30A 버퍼 1L에 1 M DTT의 2mL를 추가하고 잘 섞습니다. 참고: S30A 및 S30B 세척 버퍼에 DTT를 추가한 경우에만 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>원심분리기 세포는 6,000× g, 4°C, 10분, 그리고 빠르고 단하나의 움직임으로 상체를 조심스럽게 폐기한다. 참고: 펠릿이 방해를 받으면 잔여 GYM 배지로 세포 보존을 최대화하고 프로토콜을 계속하십시오.</li>
		<li>S30A 버퍼 500mL를 추가하고 세포 덩어리가 균질적으로 분산될 때까지 원심분리 병을 격렬하게 흔들어 세포를 다시 분리합니다.</li>
		<li>세포를 6,000 × g, 4°C, 6분으로 원심분리하고 상체를 조심스럽게 폐기한다. 참고: 이 시점에서 세포 펠릿이 더 단단해지지만 일부 세포는 현탁액에 남아 있습니다( 그림 1 참조). 2.3.7에 설명된 대로 치료하고 가능한 한 많은 세포를 유지합니다.</li>
		<li>2.3.8-2.3.9 단계를 반복합니다.</li>
		<li>얼음에 S30B 버퍼 1L에 1 M DTT의 2mL를 추가하고 잘 섞습니다. 셀에 500mL의 S30B 버퍼를 추가합니다. 2.3.9 단계를 반복합니다.</li>
		<li>S30B 버퍼의 10mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 미리 냉각된 50mL 원심분리기 튜브로 이송한다. 필요한 경우 잔류 셀을 추가로 5-10mL의 S30B 버퍼로 전송합니다. S30B로 50mL를 채웁니다.</li>
		<li>원심분리기 세포는 6,000× g, 4°C, 10분, 상주세포를 조심스럽게 폐기한다.</li>
		<li>2.3.13 단계를 반복합니다.</li>
		<li>나머지 S30B 슈퍼네탄을 100-200 μL 파이펫으로 조심스럽게 흡인시합니다.</li>
		<li>젖은 세포 펠릿의 무게. 참고: 야간 체육관 배양(OD600 = 3.0)의 1L에 대한 전형적인 습식 셀 펠릿 중량은 ~4.5g이다.</li>
		<li>젖은 셀 1g당 S30B 버퍼 0.9mL를 추가합니다. 파스퇴르 파이펫 또는 소용돌이를 사용하여 세포를 다시 중단합니다.</li>
		<li>원심분리기는 세포를 퇴적시키기 위해 최대 500g×(~ 10초)까지 짧게(~10s). 참고: 프로토콜은 이 시점에서 일시 중지될 수 있으며, 세포는 액체 질소 또는 드라이 아이스에 고정되어 -80°C에 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 조세포 추출물을 얻기 위해 초음파 처리에 의한 세포 리시스
참고: 이 단계에서 사용자는 1mL 분획(옵션 1)에서 초음파 처리또는 50mL 튜브(옵션 2)에서 더 큰 셀 서스펜션(5mL)으로 세포를 방해하도록 선택할 수 있습니다. 두 가지 옵션은 이전 수확 및 세척 단계 동안 세포의 손실로 인해 세포 현탁액의 최종 부피가 변경 될 수 있기 때문에 재현성을 보장하기 위해 아래에 자세히 설명되어 있습니다. 새 사용자는 먼저 프로토콜을 설정하려면 옵션 2.1을 시도해야 합니다.
<ol><li>1mL 분수에서 초음파 처리하여 셀 리시스<ol>
<li>1mL 파이펫 팁(보어 크기를 늘리기 위해 팁의 끝을 잘라내기)을 사용하여 셀 서스펜션의 1mL을 2mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기습니다. 참고: 세포가 동결되면 셀 리시스 전에 미지근한 물에 펠릿을 함유한 50mL 튜브를 빠르게 해동합니다. 펠릿이 해동되기 시작하자마자 튜브를 젖은 얼음으로 옮기고 10분 동안 식힙니다.</li>
		<li>각 미세원심분리기 튜브를 얼음물 비커에 놓고 플라스틱 튜브 랙을 사용하여 튜브를 초음파 처리합니다. 참고: 과열에 세포 추출물의 감도로 인해 튜브가 단백질 강수량과 효소 활성 감소를 방지하기 위해 예열되지 않도록 하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>직경 3mm 팁이 있는 초음파 프로브를 사용하여 70% (v/v) 에탄올과 이중 증류수(ddH2O)로 청소하십시오. 초음파 처리기 팁을 액체 표면 아래 ~ 1cm가 될 때까지 셀 서스펜션으로 낮춥춥니까.</li>
		<li>초음파 처리기에 다음 설정을 입력 : 20 kHz 주파수, 65 % 진폭, 10 펄스 ON 시간, 10 펄스 오프 시간, 1 분 총 초음파 처리 시간.</li>
		<li>초음파 처리 프로토콜을 실행합니다. 처음 두 번의 휴식 주기 동안 튜브를 위/아래쪽으로 이동하여 세포가 균등하게 초음파 처리되도록 합니다. 에너지 입력을 기록합니다. 참고: 안전을 위해 초음파 처리 중에 적절한 청력 보호 기능을 착용하십시오. 세포가 중단되면 점도가 감소하고 창백한 크림 젖은 세포 펠릿은 균일한 갈색 액체로 바뀌어야합니다. 권장 에너지 입력은 젖은 세포의 mL 당 240 J입니다. 세포가 부분적으로 만 용액인 경우, 현탁액은 여전히 세포의 점성 덩어리와 크림 색으로 나타납니다, 특히 튜브의 측면에.</li>
		<li>튜브를 2-3번 반전시키고 세포가 완전히 중단될 때까지 자주 혼합하여 1~2개의 10s 사이클을 추가로 초음파 처리를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5mL 셀 서스펜션을 초음파 처리하여 세포 리시스<ol>
<li>세포가 얼어 붙으면, 세포 리시스 전에 흔들리는 미지근한 물에 펠릿을 함유한 50mL 튜브를 빠르게 해동하십시오. 펠릿이 해동되기 시작하자마자 튜브를 젖은 얼음으로 옮기고 10분 동안 식힙니다.</li>
		<li>간략하게 세포를 퇴적시키기 위하여 500 x g 에서 관을 회전합니다.</li>
		<li>50mL 튜브를 얼음 물 비커에 놓고 초음파 처리를 합니다. 참고: 과열에 세포 추출물의 감도로 인해 튜브가 단백질 강수량과 효소 활성 감소를 방지하기 위해 예열되지 않도록 하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>직경 6mm 팁이 있는 초음파 처리기 프로브를 사용하여 70% (v/v) 에탄올 및 ddH2O로 청소하십시오( 도 1에서 6mm 프로브의 시각적 회로도 참조). 초음파 처리기 팁을 액체 표면 아래 ~ 1cm가 될 때까지 셀 서스펜션 (~5 mL)으로 낮춥니다.</li>
		<li>초음파 처리기에 다음 설정을 입력 : 20 kHz 주파수, 65 % 진폭, 10 펄스 ON 시간, 10 s 펄스 오프 시간, 젖은 세포의 mL 당 1 분 총 초음파 처리 시간 (총 5 분).</li>
		<li>초음파 처리 프로토콜을 실행합니다. 처음 두 번의 휴식 주기 동안 튜브를 위/아래쪽으로 이동하여 세포가 균등하게 초음파 처리되도록 합니다. 참고: 안전을 위해 초음파 처리 중에 적절한 청력 보호 기능을 착용하십시오. 세포가 중단되면 점도가 감소하고 옅은 크림 젖은 세포 펠릿은 균일 한 갈색 액체로 바뀌어야합니다. 에너지 입력을 기록합니다. 젖은 셀의 mL 당 240 J의 최적의 에너지 입력 (~1200 J 총 5 분 초음파 처리)를 권장합니다.</li>
		<li>일부 세포가 그대로 유지되면 3.1.5 단계의 지침을 따르십시오.</li>
		<li>세포 추출물을 2mL 마이크로센심심분리기 튜브로 전달합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세포 추출물 설명 및 결선 반응
<ol><li>4°C에서 10분 동안 16,000 × g 의 리시드 세포를 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 1mL 알리쿼트로 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브로 상피체를 전송합니다.</li>
	<li>세포 추출물에 대한 런오프 반응을 수행합니다. 가열 블록 또는 인큐베이터에서 60 분 동안 30 °C에서 세포 추출물을 함유 하는 1.5 mL 튜브를 흔들어주지 않고 배양하십시오.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 16,000 × g 에서 세포 추출물을 원심분리합니다. 15mL 원심분리기 튜브에 수퍼네이너티를 풀. 동질이 될 때까지 튜브를 5 번 반전하여 상체를 혼합한 다음 얼음위에 보관하십시오. 기포의 형성을 피하기 위해 부드럽게 반전.</li>
	<li>세포 추출물의 10 μL을 S30B 버퍼로 100배 희석하고 3가지 기술적 반복으로 브래드포드 분석을 사용하여 총 단백질 농도를 측정합니다(브래드포드 분석 지침의 보충 재료 S2 참조).</li>
	<li>단백질 농도가 20-25 mg/mL인 경우, 100 μL 알리쿼트로 세포 추출물을 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 액체 질소에 플래시 프리즈를 저장하고 -80°C에 저장한다. 참고: 안전을 위해 얼굴 방패와 장갑을 포함한 액체 질소를 처리할 때 적절한 PPE를 착용하십시오.</li>
	<li>단백질 농도가 <20 mg/mL인 경우, 고품질 세포 추출물과 TX-TL 수율을 보장하기 위해 원유 추출물 준비 단계를 반복하여 이전에 발표된 work5와 유사합니다.</li>
</ol>5. 플라스미드 DNA 템플릿 준비
<ol><li>pTU1-A-SP44-mScarlet-I 플라스미드(pUC19 원산지)를 LB 배양 50mL(100 mg/mL 카베닉실)에서 재배한 신선하게 변형된 대장균 플라스미드 균주(DH10β, JM109)로부터 적절한 plasmid DNA 정화 키트를 사용하여 정제합니다.</li>
	<li>플라스미드를 2 x 300 μL의 뉴클레아제 없는 물로 엘테우하고 분획을 결합합니다.</li>
	<li>3M 아세테이트(pH 5.2)의 0.1부피(66 μL)를 추가합니다.</li>
	<li>이소프로판올의 0.7부(462 μL)를 추가합니다.</li>
	<li>DNA를 -20°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>원심분리기는 16,000 g 에서 4°C에서 30분 동안 × 상복부를 폐기한다.</li>
	<li>DNA 펠릿에 70% (v/v) 에탄올2mL를 넣습니다.</li>
	<li>플라스미드 DNA 펠릿을 재보습하기 위해 튜브를 3-4번 반전시키십시오.</li>
	<li>원심분리기는 16,000 × g 에서 4°C에서 5분 동안, 상체를 폐기한다.</li>
	<li>5.7-5.9 단계를 반복하고 보이는 모든 액체를 제거합니다.</li>
	<li>DNA 펠릿을 10-30분 동안 공기 건조시키거나 진공 원심분리기로 5분 동안 건조하십시오.</li>
	<li>말린 펠릿을 600 μL의 뉴클레아제 프리 ddH2O로 재연한다.</li>
	<li>분광계를 사용하여 DNA 농도와 순도를 측정합니다.</li>
	<li>50-100 μL 알리쿼트를 준비하고 -20 °C에 보관하십시오. 참고: 500-1000 ng/μL 범위의 높은 DNA 농도는 세포 없는 반응의 단단한 부피 제약 때문에 권장됩니다. 플라스미드 DNA 스톡을 80 nM으로 희석; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I 플라스미드는 80 nM에 해당한다. </li>
</ol>6. 연쇄상 구균 마스터 믹스 (SMM) 솔루션의 준비
<ol><li>아미노산 용액<ol>
<li>아미노산 샘플러 키트를 사용하여 수동 오류를 방지하고 준비 시간을 줄이십시오.</li>
		<li>ddH2O를 사용하여 20x 아미노산 스톡 용액을 최종 농도6mM(5mM L-Leu)로 희석한다.</li>
		<li>2.4배 SMM 솔루션 내에서 2.4mMM(2mM L-Leu)로 희석합니다(표 3 참조). 참고: TX-TL 반응의 최종 농도는 1mM 19x 아미노산과 0.83 mM L-Leu입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>에너지 솔루션 및 첨가제<ol>
<li>표 3에 설명된 레시피를 따라 2.4x SMM 솔루션의 다른 구성 요소를 준비합니다.</li>
		<li>또는 표 3에 설명된 레시피에 따라 2.4배 의 최소 에너지 솔루션(MES)을 준비합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7 . 표준 S. 베네수엘라 TX-TL 반응 설정
<ol><li>세포 추출물, SMM (또는 MES) 용액 및 얼음에 플라스미드 DNA를 해동하십시오. -20°C에서 384웰 플레이트를 미리 식힙니다.</li>
	<li>부피의 25%가 플라스미드 DNA이고, 33.33%는 세포 추출물이고, 41.67%는 SMM 용액인 TX-TL 반응을 설정; 시작 시간 편견을 피하기 위해 얼음에 보관하십시오. 참고: 반응 수에 따라 필요한 시약의 양을 계산하기 위해 표준 TX-TL 템플릿(표 4)이 제공되었습니다. 33 μL 반응에 대한 표준 부피는 다음과 같습니다: 세포 추출물의 11 μL, SMM의 13.75 μL, 플라스미드 DNA의 8.25 μL.</li>
	<li>용액이 균일하다는 것을 보장하기 위해 저속 설정에서 ~ 5 s의 혼합물을 부드럽게 소용돌이시킵니다. 발포/거품 형성을 피하십시오.</li>
	<li>기포를 도입하지 않고 기술 삼중 판으로 384웰 플레이트의 세 개의 우물에 10 μL 알리쿼트전송. 투명 커버로 플레이트를 밀봉하고 400 × g 에서 5s로 회전합니다.</li>
	<li>인큐베이터(엔드포인트 판독용) 또는 흔들림 없이 플레이트 리더기에서 28°C에서 반응을 배양한다. 참고: 반응은 일반적으로 완료에 도달하기 위해 3-4 h가 필요합니다. 플레이트 판독기 및 mScarlet-I 표준 측정에 대한 지침을 보려면 보충 재료 S2 를 참조하십시오.</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 원고에서는 고수익 S. 베네수엘라 TX-TL 프로토콜이 TX-TL 시스템의 숙련된 사용자와 신규 사용자 모두를 위해 간단하게 수행할 수 있는 상세한 단계로 설명되었습니다. 기존 연쇄상 구균45 및 대장균 TX-TL41 프로토콜의 여러 기능이 제거되어 S. 베네수엘라 TX-TL5,26에 대한 최소하면서도 고수율 프로토콜을 확립했습니다. 여기에 권장되는 워크플로우는 S. 베네수엘라가 선택한 풍부한 매체에서 빠르게 성장하고 저녁에 최종 문화를 접종할 수 있도록 하는 것입니다. 이를 통해 다음 날 아침 최대 성장시 세포 수확을 허용하고 사용자가 같은 날 활성 세포 추출물을 수확하고 준비할 수 있게 합니다. 이 간소화된 프로토콜을 따라 단일 연구원이 3일 프레임워크에...

세포 없는 전사 번역(TX-TL) 시스템은 합성 생물학을 위한 개념 엔지니어링 프레임워크인 신속한 설계-빌드-테스트 학습 주기를 구현하기 위한 합성 생물학을 위한 이상적인 프로토타이핑 플랫폼을 제공합니다1. 또한, 개방형 반응 환경에서 고부가가치 재조합 단백질 생산을 위한 TX-TL 시스템에 대한 관심이 증가하고 있다2, 예를 들어, 항체-약물 컨쥬게이트에 비표준 아미노산을 통합하는 3. 구체적으로, TX-TL은 세포 추출물, 플라스미드 또는 선형 DNA, 및 단백질 합성을 배치 또는 반연속 반응으로 촉매하는 에너지 용액을 필요로 한다. 대장균 TX-TL이 지배적인 세포 없는 시스템이지만, 다수의 신흥 비모델 TX-TL 시스템은 다양한 응용 분야에서 주목을 받고 있습니다4,5,6,7,8. TX-TL의 주요 장점은 유연한 확장성(나노리터에서 리터 스케일까지)9,10, 강력한 재현성 및 자동화된 워크플로우8,11,12를 포함합니다. 특히 TX-TL의 자동화는 유전적 부품 및 규제 요소의 가속화된 특성화를 허용합니다8,12,13.
반응 설정의 관점에서, TX-TL은 아미노산, 보조 인자, 첨가제 및 템플릿 DNA 서열뿐만 아니라 1 차 및 이차 에너지 원을 모두 필요로한다. 뉴클레오티드 트리포산염(NTP)은 초기 mRNA(ATP, GTP, CTP 및 UTP) 및 단백질 합성(ATP 및 GTP만)을 구동하는 1차 에너지원을 제공한다. TX-TL 수율을 높이기 위해 NTP는 말토세14, 말토덱스트린15, 글루코스14, 3-인지질(3-PGA) 16, 인포에놀피루바테17 및 L-글루타메이트18과 같은 이차 에너지원의 이화성을 통해 재생됩니다. 이 내재된 신진 대사 활동은 의외로 다재다능하지만, 특히 신흥 TX-TL 시스템에서 제대로 연구되지 않았습니다. 각 에너지원은 ATP 수율, 화학 적 안정성 및 비용 면에서 뚜렷한 특성과 장점을 가지고 있으며, 이는 확장 된 TX-TL 반응에 중요한 고려 사항입니다. 지금까지 , 대장균 TX-TL에 대한 현재 프로토콜은 모델 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대한 4.0 mg / mL (~157 μM)까지 도달했으며, 3-PGA (30 mMM), 말토덱스트린 (60 mMM), D-ribose (30mMM)를 이차 에너지원으로 혼합하여 19 9 9 99.
최근에는 TX-TL 시스템에서 이차 대사산물 생합성 경로 연구에 대한 관심이 높아지고 있다20,21,22. 특히, Actinobacteria는 항생제와 농업 화학 물질을 포함하여 이차 대사 산물의 주요 근원입니다23,24. 그들의 게놈은 이차 대사 산물 생합성을 위한 효소 통로를 인코딩하는 소위 생합성 유전자 클러스터 (BGCs)로 풍부합니다. Actinobacteria 유전 적 부분 및 생합성 경로의 연구를 위해, 연쇄상 구균 기지를 둔 TX-TL 시스템의 범위는 최근에 개발되었습니다5,6,25,26. 이러한 전문 연쇄상 구균 TX-TL 시스템은 다음 이유로 잠재적으로 유익하다: [1] 연쇄상 구균 spp.26에서 효소에 대한 네이티브 단백질 접이식 환경의 제공; [2] 높은 G+C(%) 유전자 발현을 위한 최적의 tRNA 풀에 대한 접근; [3] 활성 1 차 물질 대사, 잠재적으로 생합성 선구자의 공급에 대 한 납치 될 수 있는; 및 [4] 네이티브 세포 추출물에 존재하는 이차 대사로부터 효소, 전구체 또는 보조인의 제공. 따라서 최근 이러한 고유한 기능을 활용하기 위해 고수성 S.베네수엘라 TX-TL 툴킷이 설립되었습니다.
연쇄상 구균 베네수엘라는 산업 생명 공학의 풍부한 역사를 가진 합성 생물학을위한 신흥 호스트입니다5,27,28,29 및 Actinobacteria30,31,32에서 세포 분열 및 유전 규제를 연구하기위한 모델 시스템으로. 주요 형 균주, S. 베네수엘라 ATCC 10712, 72.5 % G + C 함량 (%) (가입 번호 : CP029197)와 8.22 Mb의 상대적으로 큰 게놈을 가지고, 이는 7377 코딩 서열, 21 rRNA, 67 TRNA, 30 바이오 합성 유전자 클러스터를 인코딩277. 합성 생물학에서, S. 베네수엘라 ATCC 10712생합성 경로의 이종 발현에 대한 매력적인 섀시입니다. 대부분의 다른 연쇄상 구균 얼룩과는 달리, 그것은 몇 가지 주요 장점을 제공합니다, 빠른 두 배로 시간 (~40 분), 유전 및 실험 도구의 광범위한 범위5,28, 균사 응집의 부족, 액체 media28,33에서 포자. 몇몇 연구 결과는 또한 폴리케티드, 리보소말 및 비리보소말 펩타이드34,35,36,37,38을 포함하여 이차 대사 산물의 다양한 배열의 이종생산을 위한 S. 베네수엘라의 사용을 입증했습니다. 이러한 결합된 특징은 이 균주가 합성 생물학 및 신진 대사 공학 응용을 위한 매력적인 미생물 호스트로 만듭니다. S. 베네수엘라는 이종 유전자 발현에 대한 지배적 인 연쇄상 구균 모델은 아니지만, 추가 개발과 함께 천연 제품 발견 내에서 더 넓은 사용을 위해 준비됩니다.
이 원고는 이전에 게시된 원래 프로토콜26에서 업데이트된 고수율 S. 베네수엘라 TX-TL 시스템에 대한 자세한 프로토콜(그림 1)을 제공합니다. 이 작품에서 에너지 용액 및 반응 조건은 표준 플라스미드, pTU1-A-SP44-mScarlet-I를 사용하여 4시간, 10 μL 배치 반응에서 mScarlet-I 리포터 단백질에 대해 최대 260 μg/mL 의 단백질 수율을 증가시키기 위해 최적화되었다. 이 플라스미드는 단백질 발현을 검출하는 다양한 방법을 가능하게 하기 위해 특별히 고안되었습니다. 또한 프로토콜은 간소화되고 에너지 시스템은 수율을 손상시키지 않으면서 세포 없는 반응을 설정하는 복잡성과 비용을 줄이기 위해 최적화되었습니다. 최적화된 TX-TL 시스템과 함께, 유전자 발현을 미세 조정하고 TX-TL을 실시간으로 모니터링하기 위한 형광 도구로 유전 부품 라이브러리가 개발되어 연쇄상 구균 스PP및 관련 액티노박테리아로부터 유전자 발현 및 천연 생성 물 합성 경로를 프로토타이핑할 수 있는 다목적 플랫폼을 조성하고 있습니다.
이 작품에서 권장표준 플라스미드(pTU1-A-SP44-mScarlet-I)는 새로운 실험실에서 S. 베네수엘라 TX-TL 워크플로우를 설정하는 데 사용할 수 있으며 AddGene에서 사용할 수 있습니다(보충 표 S1 참조). pTU1-A-SP44-mScarlet-I는 사용자에게 다른 개방형 읽기 프레임(ORF)을 학습할 수 있는 유연성을 제공합니다. mScarlet-I ORF는 S. 베네수엘라 유전자 발현에 최적화되어 있습니다. SP44 프로모터는 대장균과 연쇄상 구균 spp.39 모두에서 매우 활동적인 강력한 구성 프로모터입니다. 플라스미드에는 두 개의 독특한 제한 효소 사이트(NdeI, BamHI)가 있어 새로운 ORFs의 서브 클론링을 조인트 C 단말 플래그 태그와 플루오레세인 아르소네시 형 헤어핀(FlAsH) 바인더 태그 시스템으로 프레임 내의 서브 클론링을 허용합니다. 대안적으로, 두 태그는 새로운 유전자를 서브 복제 한 후 정지 코돈의 포함으로 제거 될 수있다. 이러한 염기 벡터를 통해, 다양한 단백질의 고수율 발현이 입증되었으며, 즉 옥시테트라사이클린 생합성 경로로부터의 단백질과 연쇄상구균리모서스로부터의 비리보소말 펩타이드 합성술(NRPS)이 입증되었다(도 2). mRNA 검출측면에서, pTU1-A-SP44-mScarlet-I 표준 플라스미드에는 3,5-디플루오로-4-하이드록시벤졸리덴 imidazolinone(DFHBI) 프로브를 검출하기 위한 dBroccoli aptamer(3'-untranslated region)가 포함되어 있습니다. 유연성을 높이기 위해 AddGene에서 EcoFlex40 호환 MoClo 부품의 도구 집합도 제공되었습니다. 에코플렉스 호환 연쇄상 구균 셔틀 벡터(pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) 및 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I, 및 β-글루큐론(GUS)을 발현하는 다양한 pTU1-A-SP44 변형 플라스미드를 포함한다. 특히, pSF1C-A 플라스미드는 pAV-gapdh28로부터 유래되고 MoClo 어셈블리를 위한 BsaI/BsmBI 부위의 경화된다. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP는 EcoFlex40의 pTU1-A-RFP/pTU2-RfP와 동일하지만 연쇄상 구균 스프의 융합 및 염색체 통합을 위한 추가 기능이 포함되어 있습니다. phiC31 integrase 시스템을 사용하28.
프로토콜의 첫 번째 단계는 S. 베네수엘라 ATCC 10712 또는 밀접하게 관련된 균주의 성장, 중간 지수 상에서 세포 수확, 세포 세척 단계 및 S30A 및 S30B 버퍼의 평형을 포함한다. 이 단계는 3 일이 필요하고, 세포 성장을위한 시간은 아래에 설명 된 바와 같이 나머지 구성 요소를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 수확된 세포는 초음파 처리에 의해 용해되고, 명확히 하고, 런오프 반응을 겪습니다. 준비의 이 마지막 단계에서, 세포 추출물은 활동의 손실을 최소화하기 위해 -80 °C에서 장기 저장을 위해 준비될 수 있다. 이 프로토콜을 사용하여 TX-TL 반응의 어셈블리를 위해 유사한 수율을 제공하는 최소한의 에너지 솔루션 형식(MES)의 옵션으로 연쇄상 골 수 마스터 믹스(SMM)가 제공됩니다. 또한, -80°C 글리세롤 스톡으로부터 S. 베네수엘라 ATCC 10712의 신선한 배양을 체육관 한천판에 적시고, 단일 식민지가 보일 때까지 최소 48-72h이상 28°C에서 배양하는 것이 좋습니다. 다음 단계에는 신선한 문화만 사용해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>2.5L 울트라수율 플라스크</td><td>톰슨</td><td>931136-B</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA (>93%)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>384 웰 블랙/클리어 바닥판</td><td>ThermoFisher</td><td>10692202</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄 (98%)</td><td>플루오로켐</td><td>44722</td><td></td></tr><tr><td>ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM 용액, >99%)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin (순도에 대해서는 공급업체에 문의)</td><td>Melford</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose (순도에 대해서는 공급업체에 문의)</td><td>Melford</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI (&ge; 98% - HPLC)</td><td>Sigma</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>DTT (순도는 공급업체에 문의)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>FlAsH-EDT2 (순도는 공급업체에 문의)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-363644</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-6-phosphate (>98%)</td><td>Sigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Free Acid (순도는 공급업체에 문의)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산, 헤미마그네슘염, 사수화물(>98%)</td><td>, 시그마</td><td>49605</td><td></td></tr>, <tr><td>염화마그네슘(98%)</td><td>플루오로켐</td><td>494356</td><td></td></tr><tr><td>맥아 추출물</td>, <td>시그마</td><td>70167-500G</td><td></td></tr><tr><td>, PEG-6000</td>, <td>시그마</td><td>807491</td><td></td></tr><tr><td>피어스, 96웰 미세투석 플레이트, 10K MWCO</td><td>, ThermoFisher</td><td>88260</td><td></td></tr>, <tr><td>폴리(비닐 황산염), 칼륨염</td>, <td>시그마</td><td>271969</td><td></td></tr>, <tr><td>글루타민산 칼륨(>99%)</td><td>, 시그마</td><td>G1149</td><td></td></tr>, <tr><td>RTS 아미노산 샘플러</td><td>, 5 프라임</td><td>2401530</td><td></td></tr>, <tr><td>염화나트륨(99%)</td><td>, 플루오로켐</td><td>94554</td><td></td></tr>, <tr><td>Supelclean LC-18, SPE, C-18, SPE 컬럼(1g)</td><td>, 시그마</td><td>505471</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td>, <td>Melford</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platereader</td><td>BMG</td><td>오메가</td><td></td></tr></tbody></table>

합성 생물학 및 천연 제품 응용 을 위한 고수성 연쇄상 구형 전사 -번역 도구 키트

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

연쇄상 구균 spp. 임상 항생제와 산업 화학 물질의 주요 소스. 연쇄상 구균 베네수엘라 ATCC 10712는 빠르게 성장하는 균주와 클로람페니콜, 자도마이신 및 피크로마이신의 천연 생산업체로 차세대 합성 생물학 섀시로서 매력적인 후보로 만듭니다. 따라서 S. 베네수엘라 ATCC 10712의 개발을 가속화하는 유전 적 도구뿐만 아니라 다른 연쇄상 구균 spp. 모델은 천연 제품 엔지니어링 및 발견에 매우 바람직합니다. 이를 위해, 전담 S. 베네수엘라 ATCC 10712 세포 없는 시스템은 높은 G+C(%) 유전자의 고수율 이종 발현을 가능하게 하기 위하여 이 프로토콜에 제공됩니다. 이 프로토콜은 96-well 또는 384웰 플레이트 형식으로 소규모(10-100 μL) 배치 반응에 적합하며 반응은 잠재적으로 확장 가능합니다. 세포 없는 시스템은 견고하며 최소한의 설정으로 다양한 재조합 단백질에 대해 높은 수율(~5-10 μ M)을 달성할 수 있습니다. 이 작품은 또한 mRNA와 단백질 합성의 실시간 측정을 위한 광범위한 플라스미드 툴셋뿐만 아니라 태그가 지정된 단백질의 인겔 형광 염색을 통합합니다. 이 프로토콜은 또한 액티노미세테스 게놈에 존재하는 높은 G+C(%) 유전자에서 효소 통로의 높은 처리량 유전자 발현 특성화 워크플로우 또는 연구와 통합될 수 있습니다.

이 상세한 프로토콜은 사용자가 S. 베네수엘라 ATCC 10712 모델 스트레인(그림 1)에 기초하여 연쇄상 구균 TX-TL 시스템을 설정하는 데 도움이 되는 예로 제공됩니다. 사용자는 다른 연쇄상 구균 균주를 연구하려고 할 수 있습니다; 그러나, 더 긴 두 배 또는 뚜렷한 성장 환경 설정을 가진 다른 균주의 성장/수확 단계피크 결과를 달성 하기 위해 사용자 정의 최적화 해야 합니다. 대표적인 결과를 위해, pTU1-A-SP44-mScarlet-I 표준 플라스미드(도 2 및 도 3)로부터의 mScarlet-I 형광 단백질은 다양한 검출 방법(SDS-PAGE, 형광)을 통해 S. 베네수엘라 TX-TL에서 고수율 발현을 제공하도록 최적화하였다. 또한, 이러한 표준 ...

이 프로토콜은 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사 변환(TX-TL) 시스템에서 재조합 단백질의 높은 수율을 합성하는 향상된 방법을 자세히 설명합니다.

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

당사의 프로토콜은 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사 번역을 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다. 우리의 시스템은 이 비모형 유기체에서 신진 대사 효소 그리고 통로를 이용합니다. 주요 장점은 높은 GC 함량을 가진 유전자의 이종 발현, 유리한 단백질 전달 환경의 제공 및 생합성 통로의 미세 조정을 위한 개방시스템입니다.우리의 방법은 연쇄상 구균 및 관련 높은 GC 박테리아를 공부에 새로운 기회를 열 것입니다. 그것은 이 박테리아에 있는 효소 그리고 유전자 발현을 공부할 수 있습니다. 이 기술은 새로운 사용자가 쉽게 구현할 수 있기 위해 개발되었습니다.사전 경험이나 친숙함을 필요로 하는 유일한 단계는 고활성 원유 추출물을 생산하는 초음파 처리입니다. 3일째에 배양전전을 시작하기 위해, 600나노미터에서 광학 밀도 또는 OD 측정을 위한 신선한 GYN 배지로 1대10의 비율로 야간 배양을 희석한다. 600 나노미터에서 배양의 OD가 0.3 미만인 경우, 흔들림 속도를 분당 250 내지 300회전으로 증가시키고 OD가 0.3에 도달할 때까지 성장한다.2시간 이상 더 이상 성장하지 않습니다. OD가 0.3보다 큰 경우 배양기를 원심분리 용기로 옮기고 젖은 얼음에서 30분 동안 빠르게 식힙니다. 세포 배양이 식기를 기다리는 동안, 신선한 1개의 어금니 디티오트레이톨, S30A 및 S30B 버퍼의 4밀리리터를 준비하고 얼음위에 보관하십시오.빈 50 밀리리터 원심분리기 튜브의 무게를 측정한 후 영하 20도에서 미리 식힙니다. 1개의 어금니 디티오트레이톨 2밀리리터를 얼음에 S30A 버퍼 1리터에 넣고 잘 섞습니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 6, 000배 G의 세포를 원심분리합니다.빠른 움직임으로 상체를 폐기한 후, S30A 버퍼 250밀리리터를 추가하고 세포 덩어리가 균질하게 분산될 때까지 원심 분리 병을 격렬하게 흔들어 세포를 재장판한다. 그런 다음 세포를 6 분 동안 다시 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 폐기하고 S30A 버퍼의 추가를 반복한 다음 원심 분리가 입증된 대로 진행됩니다.다음으로, 얼음에 S30B 버퍼 1리터에 1개의 어금니 DTT의 밀리리터 2밀리리터를 넣고 잘 섞습니다. 세포에 S30B 버퍼 250 밀리리터를 추가하고 원심 분리를 반복합니다. S30B 버퍼의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 전무게 가성비 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 세포 현탁액을 전달한다.필요한 경우 잔류 세포를 S30B 버퍼의 5~10밀리리터로 옮기고 튜브를 S30B로 50밀리리터 부피로 채웁니다. 세포를 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고 설명한 대로 이전 설정에서 원심 분리를 반복합니다.상체를 폐기한 후, 나머지 S30B 슈퍼팔레트를 100~200 마이크로리터 파이펫으로 흡인시키고 젖은 셀 펠릿의 무게를 측정한다. 젖은 셀 1그램당 S30B 버퍼 0.9 밀리리터를 추가합니다. 파스퇴르 파이펫 또는 소용돌이를 사용하여 세포를 다시 중단합니다.원심분리기는 세포를 퇴적시키기 위해 최대 500G까지 약 10초 동안 간략하게 한다. 팁이 액체 표면 아래 약 1센티미터가 될 때까지 초음파 처리기 팁을 셀 서스펜션으로 낮춥춥시다. 초음파 처리기 설정에서 다른 매개 변수를 입력합니다.주파수를 20킬로헤르츠로 설정하고, 진폭은 65%펄스온및 오프 시간 에서 10초로, 총 초음파 처리 시간을 1분으로 설정합니다. 초음파 처리를 시작하고 세포가 균등하게 초음파 처리되도록 처음 두 휴식 주기 동안 튜브를 위 또는 아래로 옆으로 이동합니다. 세포가 완전히 제거되지 않으면 튜브를 2~3회 반전시키고 세포가 완전히 중단될 때까지 빈번한 혼합을 통해 1~2초 주기의 초음파 처리를 반복한다.세포 잔해를 제거하기 위해 리시드 세포를 원심 분리한 다음 1밀리리터 알리쿼트로 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 상피체를 전달합니다. 세포 추출물의 유출 반응의 경우, 셀 추출물을 함유하는 세포를 30°C에서 60분간 열 블록 또는 셰이커 없이 인큐베이터에 배양한다. 전사-번역 반응의 경우, 세포 추출물 SMM 또는 MES 용액및 얼음에 플라스미드 DNA를 해동한다.영하 20도에서 384웰 플레이트를 미리 식힙니다. 부피의 25%가 플라스미드 DNA인 얼음상에 전사-번역 반응을 설정하면, 33.33%는 세포 추출물이고 41.67%는 SMM 용액이다. 발포 또는 거품 형성을 피하면서 용액이 균일하다는 것을 보장하기 위해 저속 설정에서 약 5 초 동안 혼합물을 부드럽게 소용돌이시킵니다.기포를 도입하지 않고 기술 삼중 판으로 10 마이크로 리터의 세 개의 알리쿼트3 개소로 전송합니다. 투명 커버로 플레이트를 밀봉한 후 5초 동안 400회 G로 플레이트를 회전시키고 인큐베이터 또는 플레이트 판독기에서 28도의 반응에 복유합니다. 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사-번역은 pTU1-A-SP44 표준 플라스미드로부터형 광등 단백질의 고수율 발현뿐만 아니라 겔 전기포에 의해 검출된 생합성 효소에 최적화되었다.pTU1-A-SP44-mScarlet-I 표준 플라스미드의 발현은 여러 가지 방법을 사용하여 측정되었다. dBroccoli RNA aptamer를 이용한 mRNA의 실시간 형광 측정, FlAsH 태그 시스템을 이용한 미성숙 mScarlet-I 단백질, 성숙한 mScarlet-I 단백질이 수행되었다. FlAsH 태그를 사용하여 mScarlet-I의 인겔 형광 염색은 총 세포 없는 단백질의 쿠마시 블루 염색에 더하여 수행되었다.이 절차에 따라, 활동 법은 표준 방법을 사용하여 도전적인 효소와 경로를 연구하기 위하여 수행될 수 있습니다. 그것은 또한 확대 된 생합성 및 높은 처리량 유전자 발현으로 확장. 우리는 높은 GC 박테리아에서 신진 대사 효소를 연구하기 위해이 기술을 개발하고 있습니다.우리는 세포 없는 반응에 있는 생합성을 확장한 연구하는 우리의 시스템의 잠재력을 보여주었습니다.

a-high-yield-streptomyces-transcription-translation-toolkit-for

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

을 통해 에리스로 마이신의 heterologous...

을 통해 생산 단지 항생제 에리스로 마이신을 자랑하는 논리, 실험 단계, 그리고 Heterologous 자연 제품 생합성의 잠재적<em&gt; E. 대장균</em

이 5 일간의 프로토콜은 모든 단계, 장비 및 기반의 효율적인 내생 대장균 처음부터 TX-TL의 무 세포 발현 시스템을 구축 및 실행에 필요한 추가 소프트웨어를 설명합니다. 시약, 프로토콜은 8 셋업 시간 이하의 반응, 수집, 및 프로세스 데이터를 걸린다.

구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

다음은 (A) 항균 활성을 갖는 천연 제품의 식별, (B) 화합물의 정제 (C)의 생합성의 첫 모델 (D) 게놈 시퀀싱 / -mining 및 상세한 프로토콜을 제시 ( E) 생합성 유전자 클러스터의 확인.

에서 Polyketomycin를 사용하여 데모 : 그 생합성 유전자 클러스터에 천연 제품에서 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)의 diastatochromogenes Tü6028

이 연구는 pMGX 플라스미드 시스템을 사용하여 대장균 에서 단일 플라스미드로부터 다중 유전자의 T7 매개 공동 - 발현을위한 방법을 기술한다.

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

이 원고는 미생물 배양 미디어의 맞춤형 디자인에 대 한 일반적인 접근 방식을 설명합니다. Kriging 기반 실험 설계 및 microbioreactor 기술을 결합 충분 한 재배 처리량, 안정성 및 액체 미디어 처리 속도 높이기 위해 연구소 로봇에 의해 지원 되는 워크플로 반복 하 여 사용이 준비입니다.

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

여기 우리는 초보자에 대 한 프로토콜 Streptomyces약리학 중요 한 세균 속에 대 한 형질을 시작 하는 연구원을 제시.

Streptomyces 발달 돌연변이의 영상 및 현미경 평가

이 프로토콜 세부 단계, 비용, 그리고 대장균을 생성 하는 데 필요한 장비-셀 추출 물 및 단백질 합성 반응을 시험관에서 4 일 안에 구현. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한이 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 우리는 적응 되 고 최적화 될 수 있는 반응 조건 논의.

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

여기서 우리는 대장균 또는 니코티아나 벤타미아나에서생합성 효소의 합성 발현을 통해 디테르페노이드 대사산물을 생산하고 정화하기 위한 프로토콜을 쉽게 사용하고 크로마토그라피 생성물을 제시합니다. 정화. 생성된 대사산물은 분자 구조 특성화, 효소 기능성 연구 및 생체 활성 검정을 포함한 다양한 연구에 적합합니다.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

질량 분광법 유도 게놈 마이닝 프로토콜이 확립되고 여기에 설명되어 있습니다. 그것은 게놈 순서 정보 및 LC-MS/MS 분석을 기반으로 하고 복잡한 미생물 및 식물 추출물에서 분자의 식별을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

새로운 천연 제품을 발견하는 도구로 질량 분광법 유도 게놈 채굴

이 프로토콜의 목표는 골든 게이트 복제를 기반으로 모듈형 복제 시스템을 사용하여 다중 유전자 구조를 조립하기위한 상세한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 또한 우리의 경험을 바탕으로 최적의 어셈블리를 보장하기 위한 중요한 단계에 대한 권장 사항을 제공합니다.

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

여기에 제시된 것은 대장 균 BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD 및 ΔrecB)의 엑소 뉴 클레아 제 V 녹아웃 균주로부터 세포 추출물의 제조 및 완충액 교정을위한 프로토콜입니다. 이것은 선형 DNA 주형을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에서 발현을 위한 빠르고 쉽고 직접적인 접근 방식입니다.

선형 DNA 주형을 활용한 엑소뉴클레아제 결핍 세포 추출물의 무세포 단백질 합성

배우세요 Streptomyces venezuelae 무세포 전사-번역 시스템을 활용한 고수율 재조합 단백질 합성 방법을. 고GC 함량 유전자의 이종 발현과 생합성 경로 미세 조절이 가능한 연구 도구입니다.

합성 생물학 및 천연 제품 응용 을 위한 고수성 연쇄상 구형 전사 -번역 도구 키트

더 많은 동영상 탐색