Name: EGFR 돌연변이 NSCLC 환자 유래 오가노이드에서 표적 치료법에 대한 민감도 프로파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 EGFR 돌연변이 비소세포폐암 환자 유래 오가노이드에서 오시머티닙 민감도 프로파일링 방법을. 이 기술은 개별 맞춤 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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우리는 Jeroen P Roose (UCSF)와 Calvin J Kuo (Stanford)의 실험실에서 오가노이드 문화 및 프로토콜 개발에 관한 의견을 보내 주셔서 감사합니다. 또한 프로토콜 및 샘플 설정 입력에 대해 Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF)에게 감사드립니다. 이 연구 프로젝트는 NIH [U54CA224081]의 지원으로 수행되었습니다. F. Hadrk은 독일 암 원조의 Mildred Scheel 박사후 펠로우십의 지원을 받았다.

인간 피험자 연구를 위해, 정보에 입각한 동의를 얻었고, UCSF 내부 검토 위원회가 승인한 프로토콜(IRB, 프로토콜 번호: #13-12492 또는 CC#17-23309)에 따라 조직 수집을 수행하였다. 비확인된 임상 표본으로부터의 오가노이드 배양의 확립은 이전에 발표된 방법13,14,15,16에 따라 연구 파트너와 공동으로 수행되었다. 오가노이드 배양물을 세 번 또는 그 이후의 계대에서 유지 및 약물 에스컬레이션 실험을 위해 회수하였다. 하기 프로토콜은 모두 포유동물 조직 배양 실험실 환경에서 무균 조건 하에서 수행되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2.jpg"> 그림 1: 워크플로의 프로토콜 회로도와 기술의 중요한 단계. (A) 96-웰 포맷의 오가노이드의 시딩, 시딩 후 7일째에 약물 에스컬레이션을 이용한 치료, ELISA 플레이트 판독기를 이용한 치료 5일 후 발광 기반 세포 생존 판독을 포함하는 실험 워크플로우. (b) EGFRdel19 양성 TH107 및 EGFRL858R 양성 TH330 NSCLC 오가노이드 배양물의 예시적인 이미지. 본래의 배양은, 세포를 시딩할 때(0일째), 및 시딩 후 7일째(제7일째)에 처리 개시시에 오가노이드를 나타내었다. 스케일 바 = 100 μm. 초기 7 일 배양 기간 동안의 오가노이드 직경의 변화는 정량화되고 오가노이드 크기의 &gt;2 배 증가를 나타냅니다. 0일째의 평균 크기와 비교하여 7일째의 상대적 크기 변화는 대표적인 이미지 아래에 제시된다. TH107의 경우 7 일에 걸쳐 2.38의 배수 변화가 관찰되어 5.88 일 (141.12 h)의 두 배가 시간을 나타냅니다. TH330의 경우 7 일에 걸쳐 2.41의 폴드 변화가 관찰되어 5.81 일 (139.42 h)의 두 배가 시간을 나타냅니다. 오가노이드 크기의 변화를 정량화하고 통계적 평가가 제시됩니다 (오른쪽). 통계적 유의성은 짝을 이루지 않은 t-검정, p &lt; 0.0001에 의해 계산된다. (c) 오가노이드 96-웰 플레이트 포맷에서의 약물 에스컬레이션을 위한 치료 레이아웃. 음성 대조군을 포함하는 기술적 반복실험 및 예시적인 투여량의 수가 지시된다. 회로도는 웹 기반 일러스트 도구 인 BioRender로 만들어집니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. 실험 준비
<ol><li>이전에 보고된 바와 같이 성장 배지(GM)를 준비15: 둘베코의 변형된 이글 배지/L-알라닐-L-글루타민이 보충된 L-알라닐-L-글루타민의 영양 혼합물 F12(DMEM/F-12), 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 25 nM hRspondin, 1x B27, 5 mM 니코틴아미드, 1.25 mM N-아세틸시스테인, 500 nM A-8301, 500 nM SB202190, 50 μg/mL 프리모신, 100 ng/mL hNoggin, 100 ng/mL hFGF-10, 25 ng/mL hFGF-7 (물자의 표 참조). 주: 거품을 피하기 위해 부드럽게 혼합하고 0.22μm 필터링 시스템을 통해 여과하십시오. 사용 전 1 시간 이내에 37 °C로 매체를 따뜻하게하십시오.</li>
	<li>표피 성장 인자(EGF)를 첨가하지 않고 이전에 보고된 바와 같이 저성장 인자 배지(LGM)를 준비하십시오.16): 고급 둘베코 변형 이글 배지/햄의 영양 혼합물 F12 (DMEM/F-12), 1 mM HEPES, 1x L-알라닐-L-글루타민, 1x 페니실린-스트렙토마이신-글루타민, 10 mM 니코틴아미드, 1 mM N-아세틸시스테인, 1x B27, 500 nM A-8301, 100 ng/mL hNoggin. 참고: 거품이 발생하지 않도록 부드럽게 혼합하고 0.22μm 필터를 통해 여과하십시오. 사용 전 1 시간 이내에 37 °C로 매체를 따뜻하게하십시오.</li>
	<li>BME2 (환원 성장 인자 기저막 추출물, 유형 2, 물질 표 참조)를 얼음 상에서, 4°C에서, 밤새 해동시킨다.</li>
</ol>2. 단세포 현탁액 생성 및 세포의 시딩
<ol><li>다음 단계(2.1.1-2.1.6)에 기재된 바와 같이 침수된 BME2 오가노이드 배양물을 해리시킨다.<ol>
<li>조심스럽게 배양 플레이트에서 배지를 흡인하십시오. 침수 된 BME2 오가노이드 배양물을 만지지 마십시오. 참고 : 미디어 흡인은 연구자가 선호하는 것처럼 수행 할 수 있습니다 (예 : 기본 유체 흡인 시스템 또는 피펫 사용). BME2 임베디드 오가노이드를 만지면 오가노이드 바이오 매스가 손실 될 수 있으므로 피하십시오.</li>
		<li>침수된 BME2 오가노이드 배양물을 적합한 재조합 효소로 트립신화한다( 표 참조). 6웰 플레이트 형식으로 웰당 2mL를 추가합니다. 반복적으로 위아래로 피펫팅하여 BME2를 기계적으로 분해합니다. 플레이트를 5분 동안 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>현탁액을 15 mL 원심분리 튜브 내로 옮기고 실온에서 5분 동안 600 x g 에서 원심분리한다.</li>
		<li>재조합 효소를 오가노이드 펠릿을 건드리지 않고 조심스럽게 흡인한다. 참고: 잔류 BME2가 존재할 수 있습니다. 필요한 경우 효소 소화를 반복하십시오.</li>
		<li>오가노이드 펠릿을 GM에 재현탁시킨다(단계 1.1). DNase I 1x 100 U/mL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다( 물자표 참조).</li>
		<li>실온에서 3분 동안 600 x g 에서 원심분리한다. 오가노이드 펠릿을 만지지 않고 조심스럽게 미디어를 피펫 오프하고 버립니다. 신선한 GM에서 일시 중단하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>오가노이드 단일 세포 현탁액의 시딩<ol><li>새로운 검정색, 클리어-바텀 96-웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 10분 동안 예열한다. 참고 : 명확한 바닥 플레이트를 사용하는 것은 오가노이드 성장과 약물 반응을 모니터링하는 데 필수적입니다.</li>
		<li>계수를 위해, PBS 중의 세포 현탁액의 1:5 희석액 (총 부피: 500 μL)을 준비하고, 세포 분석기를 사용하여 세포 현탁액을 계수한다 ( 물질의 표 참조). 참고: 최종 세포 농도를 받기 위해 희석 계수(x5)를 곱해야 합니다. 혈구세포계와 같은 대안적인 계수 방법이 사용될 수 있다. 세포 생존율은 생존력 염색 검정을 사용하여 모니터링되어야 한다(예를 들어, Trypan Blue17 사용). 세포 분석기를 사용하여 생존율이 자동으로 평가됩니다. 세포 분석기에 의해 평가된 오가노이드 단세포 현탁액의 생존율은 ≥95%이어야 한다(보충 그림 1).</li>
		<li>실험을 위해 시드하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산한다. 참고: 시딩 농도는 1500 세포/μL BME2이며, 웰당 5 μL BME2가 필요합니다(총 수: 7500 세포/웰). 하나의 96웰 플레이트의 경우 6 x 10E5 셀이 필요합니다. 여기에는 오가노이드 돔 (4.5 x 10E5)이있는 60 웰의 시딩과 실험 잉여 (총 80 웰에 대한 계산)가 포함됩니다.</li>
		<li>여러 개의 96-웰 플레이트가 실험에 포함되는 경우 시딩되도록 계획된 각 96-웰 플레이트 당 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에서 세포 현탁액의 1 분취량을 준비한다. 참고: BME2 처리로 인한 증가된 실험 편향을 설명하기 위해 시드된 96웰 플레이트당 실험적 잉여와 별도의 분취량이 필요합니다.</li>
		<li>단일 세포 현탁액으로부터의 분취량을 상하로 피펫팅하여 조심스럽게 재현탁시킨 후(단계 2.2.3) 계산하였다. 펠릿 세포를 실온에서 5분 동안 600 x g 에서 수득하였다. 세포 펠릿을 건드리지 않고 P200 피펫을 사용하여 조심스럽게 배지를 제거하십시오. 세포 펠릿을 얼음 위에 잠깐(~1분) 놓고 BME2에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 참고: 잔류 매체는 BME2 구조와 강성을 손상시킬 수 있습니다. 피펫은 모든 미디어를 조심스럽게 떼어냅니다. 세포를 얼음 위에 잠시 올려 놓고 세포 펠릿을 적응시키고 세포가 뭉치지 않고 BME2에 재현탁 될 수 있도록하십시오. BME2가 액체 상태로 유지되도록 BME2를 얼음 위에 지속적으로 보관하십시오. 하나의 96-웰 플레이트의 경우, 세포 펠릿의 재현탁을 위해 400 μL BME2가 필요하다. 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁하여 거품의 도입을 피하십시오.</li>
		<li>미리 따뜻해진 검은 색, 투명한 바닥 96 웰 플레이트를 당신 쪽으로 기울이십시오. 플레이트 세포는 웰 당 5 μL의 세포 현탁액을 사용하고 각 웰의 6시 위치에 세포 돔을 시딩한다 (도 1A).  세포 돔을 나머지 내부 웰에 시드합니다 (2-10 열과 96 웰 플레이트의 B-G 행). 참고: BME2를 처리할 때는 역방향 피펫팅18 을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>96-웰 플레이트를 이동시키지 말고, 세포 배양 층류 후드에서 갓 시딩된 세포 돔을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 그 후 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮기고 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>웰당 100μL의 GM을 오가노이드를 함유하는 모든 웰(96웰 플레이트의 컬럼 2-10 및 행 B-G)에 조심스럽게 첨가한다. 100 μL의 PBS를 플레이트의 테두리에 있는 외부 웰에 첨가한다.</li>
		<li>BME2 포매된 오가노이드를 총 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 GM 배지에 배양하였다. 정기적으로 광학 현미경으로 오가노이드의 성장을 검사하십시오. 참고: 시딩으로부터 치료 당일까지 예상되는 성장 진행의 예는 그림 1B 및 보충 표 1 을 참조하십시오.</li>
		<li>배양 3-4 일 후에 배지를 한 번 변경하십시오 : 플레이트를 시계 방향으로 180 ° (현재 12시 방향의 오가노이드)로 돌리고 가능한 경우 다중 채널 장치를 사용하여 반대 위치에서 오가노이드 돔으로 GM을 조심스럽게 흡인 한 다음 신선한 GM을 추가하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 약물 치료
<ol><li>EGFR 돌연변이 NSCLC 오가노이드를 치료하기 위해 선택된 약물, 예를 들어, 오시머티닙에 대해 LGM에서 희석된 연속 약물을 제조한다. 음성 대조군(LGM 미디어 + 0.1% DMSO)을 포함한다. 시드 된 웰의 수와 실험 잉여에 따라 모든 용량의 충분한 약물 분취량을 준비하십시오. 참고: ≥8회 투여량을 포함하고 1 nM-10 μM의 범위의 희석 계열이 표적 억제제에 권장됩니다.</li>
	<li>오가노이드 플레이트를 시계 방향으로 180° 회전합니다(오가노이드는 이제 12시 위치에 있음). 바람직하게는 다중 채널 장치를 사용하여 GM을 조심스럽게 흡인한다. 참고 : GM을 흡인하는 동안 오가노이드 돔을 만지지 마십시오.이 경우 오가노이드 바이오 매스가 손실되고 결과가 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>웰 당 100 μL의 대조군 (예를 들어, LGM 배지 + 0.1% DMSO) 또는 약물 용액을 첨가한다. 참고: 96-웰 플레이트 형식의 약물 에스컬레이션 치료 회로도에 대해서는 그림 1C 를 참조하십시오.</li>
	<li>처리된 오가노이드를 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 5일 동안 인큐베이션한다.</li>
</ol>4. 발광 기반 생존 분석법에 의한 판독
<ol><li>수확 및 생존 판독<ol>
<li>Reference19에 따라 생존 검정을 수행한다.<ol>
<li>시약을 해동(표 표 참조)을 4°C에서 하룻밤 동안 해동시킨다. 시약을 사용하기 전에 실온에서 30 분 동안 수조에서 평형을 유지하고 뒤집어서 혼합하십시오.</li>
			<li>동일한 부피의 시약을 각 웰에 첨가한다(웰당 100 μL). 피펫 팁을 오르 내거나 오가노이드 돔의 위치에 놓인 상태에서 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합하십시오. 어둠 속에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.</li>
			<li>다채널 피펫을 사용하여, 용해물의 대략 75%(150 μL)를 (단계 4.1.1.2) 새로운 백색, 불투명 바닥 96-웰 플레이트로 옮긴다. 참고: 용해물의 75%를 새 플레이트로 옮기면 분석 감도에 영향을 주지 않으면서 이후 판독에서 기포가 없도록 할 수 있습니다.</li>
			<li>어둠 속에서 실온에서 추가로 25분 동안 인큐베이션한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ELISA 플레이트 리더(통합 시간 0.25-1 s/per well)를 사용하여 발광 을 기록한다(재료 표 참조).</li>
		<li>데이터를 적절한 포맷, 예를 들어, 사용된 플레이트 레이아웃 및 약물의 모든 원시 판독 및 기록을 포함하는 데이터 테이블로 저장한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>통계 분석 소프트웨어를 사용한 데이터 분석( 자료표 참조)<ol>
<li>새로운 XY 테이블을 만들고 XY 형식으로 데이터를 삽입하십시오 : 행 (X)은 음성 대조군이며 약물 복용량을 증가시키고 복용량은 몰 농도에서 로그 [억제제]로 사용됩니다. 열(Y)은 열과 함께 누적된 반복실험을 포함하는 판독 값입니다. 참고: 음성 대조군의 농도는 최소값(0이 로그 스케일에서는 가능하지 않음)으로 표시되어야 합니다(예: log [Inhibitor], M = -10).</li>
		<li>분석 &gt; 정규화를 선택하고 다음 매개 변수를 사용하여 값을 정규화합니다. 각 하위 열을 별도로 정규화하고, Y = 0을 0%로, "각 하위 열의 마지막 값(또는 첫 번째 값 중 큰 값)"을 100%로 하고, 백분율을 초래하고, 결과를 그래프로 표시합니다.</li>
		<li>비선형 회귀 &gt; 용량 반응에 대한 &gt; XY 분석 분석 분석을 선택하여 정규화된 데이터&gt; 비선형 회귀 곡선을 맞춥니다 - 억제 &gt; 로그(억제제) 대 . 정규화된 반응 -- 가변 기울기.</li>
		<li>결과를 비선형 회귀 분석 후 출력되는 IC50 값의 표와 정규화된 데이터 포인트를 평균 +/- 표준 편차 및 적합 회귀 곡선으로 포함하는 반응 곡선의 그래프로 보고합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>de Bono, J. S., Ashworth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+cancer+research+into+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translating cancer research into targeted therapeutics.</a> Nature. 467 (7315), 543-549 (2010).</li>
<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li>
<li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+establishing+pure+lung+cancer+organoids+limit+their+utility+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine.</a> Cell Reports. 31 (5), 107588(2020).</li>
<li>Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+organoids+for+cancer+biology+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Applications of organoids for cancer biology and precision medicine.</a> Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).</li>
<li>Bivona, T. G., Doebele, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+understanding+and+targeting+residual+disease+in+oncogene-driven+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A framework for understanding and targeting residual disease in oncogene-driven solid cancers.</a> Nature Medicine. 22 (5), 472-478 (2016).</li>
<li>Jabs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+drug+effects+in+patient-derived+cancer+cells+links+organoid+responses+to+genome+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations.</a> Molecular Systems Biology. 13 (11), 955(2017).</li>
<li>Tashiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+cetuximab+sensitivity+assay+using+three-dimensional+primary+culture+system+to+stratify+KRAS+mutant+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo cetuximab sensitivity assay using three-dimensional primary culture system to stratify KRAS mutant colorectal cancer.</a> PLoS One. 12 (3), 0174151(2017).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
<li>Hysenaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+studies+in+lung+organoids+identify+TSPAN8+as+novel+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection studies in lung organoids identify TSPAN8 as novel mediator.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocol in Immunology. , Appendix 3, Appendix 3B (2001).</li>
<li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences%3A+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformation%22%5BJournal%5D)">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li>
<li>Promega Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellTiter-Glo+3D+Cell+Viability+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Corporation%22%5BJournal%5D)">CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay.</a> Promega Corporation. , (2021).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+lung+cancer+organoids+as+in+vitro+cancer+models+for+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening.</a> Nature Communication. 10 (1), 3991(2019).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+organoids+analyzed+on+microwell+arrays+predict+drug+responses+of+patients+within+a+week%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week.</a> Nature Communication. 12 (1), 2581(2021).</li>
<li>Shi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+as+preclinical+models+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures as preclinical models of non-small cell lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 26 (5), 1162-1174 (2020).</li>
<li>Collisson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+profiling+of+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma.</a> Nature. 511 (7511), 543-550 (2014).</li>
<li>Ramalingam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+Survival+with+Osimertinib+in+untreated%2C+EGFR-mutated+advanced+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Overall Survival with Osimertinib in untreated, EGFR-mutated advanced NSCLC.</a> New England Journal of Medicine. 382 (1), 41-50 (2019).</li>
<li>Soria, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+in+untreated+EGFR-mutated+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 378 (2), 113-125 (2017).</li>
<li>Rotow, J., Bivona, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+targeting+resistance+mechanisms+in+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Understanding and targeting resistance mechanisms in NSCLC.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (11), 637-658 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+AXL+kinase+causes+resistance+to+EGFR-targeted+therapy+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer.</a> Nature Genetics. 44 (8), 852-860 (2012).</li>
<li>Kanda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+resistance+in+lung+cancer+cells+mediated+by+integrin+%CE%B21%2FSrc%2FAkt-driven+bypass+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Erlotinib resistance in lung cancer cells mediated by integrin β1/Src/Akt-driven bypass signaling.</a> Cancer Research. 73 (20), 6243-6253 (2013).</li>
<li>Bruun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+multiple+colorectal+cancer+liver+metastases+reveal+moderate+intra-patient+pharmacotranscriptomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from multiple colorectal cancer liver metastases reveal moderate intra-patient pharmacotranscriptomic heterogeneity.</a> Clinical Cancer Research. 26 (15), 4107-4119 (2020).</li>
<li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li>
<li>Yuki, K., Cheng, N., Nakano, M., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of tumor immunology.</a> Trends in Immunology. 41 (8), 652-664 (2020).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+therapeutic+impact+of+intratumor+heterogeneity+in+cancer+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution.</a> Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).</li>
<li>Rambow, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+minimal+residual+disease-directed+therapy+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Toward minimal residual disease-directed therapy in melanoma.</a> Cell. 174 (4), 843-855 (2018).</li>
<li>Marine, J. C., Dawson, S. J., Dawson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+mechanisms+of+therapeutic+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-genetic mechanisms of therapeutic resistance in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (12), 743-756 (2020).</li>
<li>Frismantas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+drug+response+profiling+detects+recurrent+sensitivity+patterns+in+drug-resistant+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ex vivo drug response profiling detects recurrent sensitivity patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 129 (11), 26-37 (2017).</li>
<li>Drusbosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+response+to+BET+inhibitors+using+computational+modeling%3A+A+BEAT+AML+project+study%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">Predicting response to BET inhibitors using computational modeling: A BEAT AML project study.</a> Leukemia Research. 77, 42-50 (2019).</li>
</ol>

T.G.B.는 Array Biopharma, Revolution Medicines, Novartis, AstraZeneca, Takeda, Springworks, Jazz Pharmaceuticals, Relay Therapeutics, Rain Therapeutics, Engine Biosciences의 고문이며 Novartis, Strategia, Kinnate 및 Revolution Medicines로부터 연구 자금을 받고 있습니다.

이 원고는 NSCLC 유래 3D PDO 모델에서 약물 민감도를 평가하기 위한 표준화된 프로토콜을 개발하고 설명합니다. 약물 민감성 연구 외에도 약물 민감도의 차이에 대한 근본적인 원인을 결정하기 위해 사용 가능한 오가노이드 모델의 추가 특성화가 필요합니다. 이는 오가노이드 및 환자 표본의 유전자 프로파일링 및 분화 마커 및 일반적인 세포 신호전달 바이오마커 및 생리학에 대한 면역조직화학 염색과 같은 오가노이드에 이용가능한 다른 분석을 포함할 수 있다13,29.
프로토콜의 중요한 단계 여기에 요약된 프로토콜은 신중하게 따를 때 정확하고 재현 가능한 약물 민감도 분석을 허용하는 표준화된 워크플로우를 제공합니다. 단일 세포 현탁액의 생성 동안 트립LE 및 DNAse I 소화, BME2의 단일 세포 현탁액의 시딩, 치료까지 오가노이드 성장 모니터링, 배지 변화, 발광 기반 세포 생존 판독 동안 BME2 임베디드 오가노이드의 붕괴 및 용해 등 특별한 조치를 취해야 합니다. (1) TrypLE 기반 오가노이드의 해리 후 추가적인 DNAse I 소화가 정기적 인 배양 유지 보수 중에 오가노이드 모델을 확장하는 데 필수적이지는 않지만, 약물 에스컬레이션 실험을 위해 시딩 할 때 DNAse I 소화를 생략해서는 안되며, 오가노이드 클러스터를 단일 세포 현탁액으로 더 잘 분리하고 정확한 세포 계수를 보장하므로 생략해서는 안됩니다. (2) BME2 내의 단일 세포 현탁액의 시딩은 실온에서 BME2의 응고를 주어진 중요한 단계를 나타낸다. 따라서 최대 1-2 행을 한 번에 시드해야하며 추가 행이 시드되기 전에 샘플을 얼음 위에 놓아야합니다. 참고로, 세포는 균질한 세포 현탁액을 허용하기 위해 시딩이 계속될 때 위아래로 피펫팅될 필요가 있다. (3) 오가노이드 성장은 파종에서 치료까지 7 일간의 확장 동안주의 깊게 모니터링해야합니다. 예상되는 개발의 예는 그림 1B 및 보충 표 1에 나와 있습니다. 참고로, 도 1B 에 제시된 바와 같이 브라이트필드 현미경 및 이미지 분석에 의한 오가노이드 크기의 변화를 평가하는 것은 오가노이드 성장 및 배가시간의 차이에 대한 정밀한 평가를 가능하게 할 수 있다. 두 배가 되는 시간은 최근 문헌30에서 논의된 바와 같이 약물 반응에 영향을 미칠 수 있다. 오가노이드 성장 속도가 제시된 예를 유의하게 초과하는 경우, 치료 개시까지의 더 짧은 팽창 시간 및 더 짧은 치료 기간이 고려될 수 있다. (4) 또한 흡인 오가노이드를 피하기 위해 매체를 변경할 때 특별한주의를 기울여야합니다. 6시 방향의 BME2 임베디드 오가노이드의 시딩 위치는 플레이트가 시계 방향으로 180 ° 회전하고 미디어가 오가노이드의 반대 위치에서 흡인 될 때 미디어의 안전한 흡인을 가능하게합니다. (5) 마지막으로, 생존 판독 동안 BME2 임베디드 오가노이드의 철저한 용해는 정확한 결과를 기록하는 데 필수적입니다. 제조업체의 지침에 따르면, 샘플은 적절한 용해를 보장하기 위해 여과되지 않은 팁을 사용하여 이상적으로 위아래로 반복적으로 피펫팅되어야합니다. 인큐베이션 시간은 설명된 바와 같이 뒤따라야 한다. 또한, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 최종 판독을 위해 용해물의 75%(전체 부피 대신)를 백색의 불투명 바닥 96웰 플레이트로 이송하면 각 웰에서 동일한 부피와 격렬한 피펫팅에 의해 도입될 수 있는 기포의 부재를 보장하므로 적절한 평가가 가능합니다.
참고로, BME2 포매된 오가노이드 배양물에서 약물 반응의 프로파일링은 정규 세포주 배양물에서 관찰된 것보다 더 높은 표준 편차를 나타낼 수 있다(도 2, 도 3A). 더 높은 표준 편차는 BME2로 작업 할 때 파종에 약간의 변동이 발생할 가능성이 증가하고 초기 7 일 성장 기간 동안 우물에서 개별 오가노이드 성장률의 차이를 포함하여 몇 가지 요인을 기반으로합니다. 따라서, 약물 농도 당 네 개 이상의 기술적 반복실험이 시딩되어야 한다.
가장 중요한 것은, 종양원성 동인 돌연변이를 운반하는 악성 세포의 존재와 정상 기도 상피 세포에 의한 제한된 오염이 신중하게 평가되어야 한다는 것이다. NSCLC 확립의 도전은 정상기도 상피 세포의 성장을 선호 할 수 있습니다7. 카피 수 프로파일링 또는 PCR- 및 시퀀싱-기반 접근법은 종양원성 구동기 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 NSCLC 오가노이드 배양의 품질을 보장하기 위해 선택되는 방법이다.
방법의 수정 및 문제 해결 기본 배지 솔루션에 첨가된 배지 및 각각의 성장 인자는 표적 억제제에 대한 약물 반응에 유의한 영향을 미칠 수 있다. 그들은 약물 반응에 영향을 미치고 제한하는 우회 수용체 및 신호 전달 경로를 활성화시킵니다 (예 : FGF, HGF, EGF)26. 성장 인자가 풍부하고 맞춤화 된 배지가 오가노이드 배양을 확장하는 데 최적 일 수 있지만, 약물 에스컬레이션 및 민감도 평가는 위에서 설명한 바와 같이 감소 된 성장 인자 배지에서 수행되어야합니다. 이는 다양한 배지 제형과 약물 반응 데이터를 비교한 내부 경험을 기반으로 합니다(그림 3C). 배지 용액은 특정 약물 치료에 대한 민감도에 영향을 미칠 수 있고 IC50 값을 바꿀 수 있지만, 민감도 또는 저항의 견고한 표현형은 배지 제형에 관계없이 명백합니다 (그림 3C, D). 또한, 오가노이드 배양에 걸친 배지 제형 및 프로파일링 약물 반응의 일반적인 일관성이 권장되며, 농도당 동등하거나 네 개 이상의 기술적 반복실험이 시딩되어야 한다. 이는 민감도 대 민감도의 범위를 벤치마킹하는 데 특히 중요합니다. 관심의 억제제에 대한 내성.
방법의 제한 사항 여기에 제시된 프로토콜은 환자 유래 암 세포가 배양될 때 표적 억제제에 대한 NSCLC 3D 암 오가노이드 모델의 민감도를 기술한다. 동인 종양유전자 및 이차 돌연변이의 존재에 대한 경로 억제 및 시퀀싱 분석에 관한 약력학적 분석을 포함하는 추가적인 실험은 약물 내성 및 민감성의 상세한 특성화를 위해 필요하다. 또한, 종양 미세환경에서 비암 방관자 세포에 의한 상호작용 또는 분비된 인자로부터 유래된 미세환경 자극과 같은 방관자 인자는 설명되지 않으며, 면역 또는 기질 세포와 오가노이드 모델을 공동 배양할 때 새로운 프로토콜이 필요하다. 최근의 연구는 종양 미세환경 상호작용 및 항-PD-L1 치료와 같은 면역 체크포인트 억제제에 대한 프로파일 반응을 재검토하기 위한 오가노이드 모델의 사용을 강조하였다13,31.
기존 / 대체 방법에 대한 방법의 중요성 3D 암 오가노이드 모델은 원래의 종양에 존재하는 치료 반응의 유전적 다양성 및 결정인자를 재분석한다4,5,6. 특히, 공간적 및 시간적 이질성은 종양 진화를 촉진할 수 있고, 종양 서브클론의 병행 출현 및 순차적 발달이 발생할 수 있다32,33. 종양내 이질성은 치료적 압력 하에서보다 탄력적인 종양 세포의 선택에 중요하다9,34,35. 여기에 제공된 프로토콜은 환자-근접 샘플에서 표적 억제제를 사용한 치료에 대한 민감성의 신속한 평가를 가능하게 한다. 따라서, 오가노이드 모델은 유전적 다양성이 결여된 보다 통상적인 동질적인 세포주 모델 또는 세포주 또는 환자 유래 이종이식편을 이용한 장기 연구에 비해 이점을 갖는다. 또한, 본 프로토콜은 비용 및 분석 용량에 관한 몇 가지 제한과 함께 치료 및 조합 치료 접근법의 다중 팔까지 확장할 수 있게 한다. 이와 같이, 주로 표적화된 억제제를 에스컬레이션하면서 고정된 용량으로 관심있는 두 번째 약물을 첨가하고, 이를 주로 표적화된 억제제 단독의 에스컬레이션과 비교함으로써 잠재적인 조합 효과를 효율적으로 평가하고 필요한 최소한의 추가 바이오매스를 가능하게 한다(보충 그림 3). 오가노이드 발달 및 약물 반응을 모니터링하는 데 사용되는 이미징 기반 평가와 비교할 때, 여기에 설명된 발광 기반 세포 생존 분석은 최소한의 장비 및 훈련이 필요한 유사한 감도를 갖는다.
특정 연구 분야에서이 방법의 중요성과 잠재적 인 적용 환자 표본에서 암 오가노이드 모델을 확립하고 후속 약물 민감성 프로파일링을 가능하게 하는 표준화된 파이프라인을 개발하면 상당한 임상 적용 가능성을 보유할 수 있습니다. 생체외 약리학적 프로파일링은 종양의 취약성 및 내성-관련 특징을 검출하는 데서 인정을 받았으며, 환자의 치료 반응과 상관관계가 있다36,37. 유의하게도, 약물 민감성의 생체외 프로파일링은 클리닉에서의 치료 선택과 내성 메카니즘을 다루는 합리적 조합 치료의 설계에 도움이 될 수 있다. 전반적으로,이 접근법은 분자 치료 또는 조합 치료 요법을위한 개선 된 개인화 된 전략을 가능하게하는 데 도움이 될 수 있습니다. 후자는 약물 내성 및 내성 메커니즘을 조기에 표적화하고 향후 환자 결과를 개선하기 위해 임상 반응을 심화시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

발암 유발 운전자에 대한 맞춤형 치료법은 암 치료에 혁명을 일으켜 환자 생존을 개선하고 치료 매개 부작용을 줄였습니다1. 분자 진단 및 시퀀싱 기술의 최근 발전은 인간 종양의 복잡성을 강조했으며, 공간적 및 시간적 이질성이 치료 반응에 영향을 미쳤습니다2. 세포 배양 모델에서 이러한 아클론 차이를 되풀이하는 것은 오랫동안 달리 균일한 세포주에서 관심있는 선택된 변경을 조사하는 것으로 제한되어왔다. 종양 생검 또는 외과적 종양 절제술로부터 생성된 새로 개발된 3D PDO 모델은 환자 유래 종양 조직 내의 세포 복잡성 및 신호전달 누화의 개선된 표현을 가능하게 한다3. 이와 같이, 위장암 및 췌장암으로부터 유래된 종양 오가노이드는 성공적으로 생성되었고, 치료 반응의 유전적 다양성 및 결정인자를 재구성한다4,5,6. 비소세포 폐암(NSCLC)에서는 오가노이드 개발 및 확립 과제가 인정되며, 향후 NSCLC PDO를 보다 광범위하고 체계적으로 사용할 수 있도록 배양 기술 및 선택적 배지 인자의 최적화가 필요합니다7,8.
초기 약물 치료를 견디는 잔류 종양 세포를 표적으로 하는 조합 요법을 개발하는 것은 내성 발달을 억제하고 궁극적으로 환자 생존을 향상시키는 데 필수적입니다9. 오가노이드 배양의 구조적 복잡성을 감안할 때, 고전적인 약물 반응 파라미터는 약물 민감성에 대한 정확하고 재현 가능한 테스트를 허용하도록 최적화되어야합니다. 다른 기술들 중에서도 세포 ATP 풍부도6,12를 측정하는 영상-기반 판독값10,11 및 고전적 세포 생존력 분석이 PDO 배양물에서 약물 반응을 프로파일링하는데 이용가능하다. 여기에서, 우리는 NSCLC PDO 모델에서 알려진 임상 동인에 대한 표적 치료에 대한 약물 민감성을 평가하기 위해 표준화 된 프로토콜을 개발하고 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL 진공 필터/보관 병 시스템, 0.2 &마이크로; m Pore 33.2 cm2 두</td><td>매체 모두에 사용되는</td>나일론 멤브레인 <td>Corning</td><td>430773</td></tr><tr><td>96-Well, 세포 배양 처리, 플랫 클리어 바텀 블랙 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>96-Well, 세포 배양 처리, 솔리드 화이트 플랫 바텀 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>A-8301</td><td>Tocris Bioscience</td><td>293910</td><td>두 매체 모두에 사용</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>for LGM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>두 매체 모두에 대해</td></tr><tr><td>BioRender 2021</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>온라인 과학 일러스트레이션 소프트웨어</td></tr><tr><td>BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2)</td><td>R& D Systems</td><td>353301002</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터(37 &deg; C, 5% CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 세포 생존도 분석</td><td>Promega</td><td>G9682</td><td>3D-CTG 판독 시약</td></tr><tr><td>15mL 원심분리기</td> 튜브 Deoxyribonuclease <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>I (DNAse I)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 염 용액</td><td>Corning</td><td>MT21031CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제</td><td>GM용</td><td>Gibco</td><td>10565018</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>LGM용</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 소프트웨어(버전 9.2.0)</td><td>GraphPad</td><td></td><td>통계 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>두 매체 모두용</td></tr><tr><td>hFGF-10</td><td>PeproTech</td><td>100-26-100ug</td><td>GM용</td></tr><tr><td>hFGF-7</td><td>PeproTech</td><td>100-19-50ug</td><td>GM</td></tr><tr><td>hNoggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C-100ug</td><td>두 매체 모두</td></tr><tr><td>hRspondin</td><td>PeproTech</td><td>120-38-100ug</td><td>GM</td></tr><tr><td>저 보유 피펫 팁, 20 &micro; L (P20)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2149P-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>저잔류 피펫 팁, 200 & 마이크로; L (P200)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2069-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>레귤러 길이 피펫 팁, 1000 &마이크로; L (P1000)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2179-HR</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-424-777</td><td>두 매체 모두용</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Osimertinib</td><td>Selleck Checm</td><td>S7297</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신-글루타민</td><td></td><td>LGM 페</td><td></td></tr><tr><td>니실린/스트렙토마이</td>신용 <td>Gibco 10378016 GM</td> 피펫<td>용</td>HyClone <td>SV30010</td></tr>(<tr><td>다양한 크기)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>SpectraMax M5</td><td>장비, 대체 리더 사용 가능</td></tr> GM SB202190 Selleck Chem<tr><td>용</td><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td></tr><tr><td></td><td></td><td>S1077</td><td>GM</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프 및 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL XR 세포 분석기 Beckman</td><td>Coulter</td><td>Vi-CELL XR</td><td>세포 분석기 / 카운터</td></tr></tbody></table>

egfr 돌연변이 nsclc 환자 유래 오가노이드에서 표적 치료법에 대한 민감도 프로파일링

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

임상 환자 표본으로부터 유래된 신규한 3D 암 오가노이드 배양물은 암에서 표적 억제제에 대한 종양 내 이질성 및 치료 반응을 평가하는 중요한 모델 시스템을 나타낸다. 위장 및 췌장암의 선구적인 연구는 환자 근접 배양 시스템으로서의 환자 유래 오가노이드 (PDO)의 약속을 강조했으며 점점 더 많은 모델이 등장하고 있습니다. 마찬가지로, 다른 암 유형에서의 연구는 오가노이드 모델을 수립하고 배양 프로토콜을 최적화하는 데 중점을 두었습니다. 특히, 3D 암 오가노이드 모델은 원래의 종양 표본의 유전 적 복잡성을 유지하므로 종양 유래 시퀀싱 데이터를 실험 환경에서 유전적으로 정보에 입각 한 표적 치료법을 사용한 치료로 변환합니다. 또한, PDO는 미래에 종양의 내성 관련 적응을 극복하기 위해 합리적인 조합 치료의 평가를 촉진 할 수 있습니다. 후자는 내성 개발이 궁극적으로 표적 억제제의 치료 성공을 제한하기 때문에 비 소세포 폐암 (NSCLC)에 대한 강렬한 연구 노력에 중점을 둡니다. NSCLC PDO를 이용한 치료적 표적화 가능한 기작의 조기 평가는 합리적인 조합 치료를 알리는 데 도움이 될 수 있다. 이 원고는 NSCLC 유래 3D PDO의 표적 억제제에 대한 약물 민감성의 세포 배양 플레이트 기반 평가를위한 표준화 된 프로토콜을 설명하며, 병용 치료 및 기타 치료 양식에 대한 잠재적 인 적응성을 설명합니다.

NSCLC 오가노이드를 확립하는 데 상당한 어려움이 지적되었습니다7. 따라서, 폐암 오가노이드를 확립하고 약물 치료 분석에 사용하는 최근의 연구를 보는 것은 흥미 진진합니다.20,21,22. EGFR-돌연변이는 NSCLC 케이스의 11.3%를 차지한다23. EGFR 억제제를 사용한 표적 치료는 EGFR 돌연변이 NSCLC에서 첫 번째 치료 옵션을 나타내며, 환자24에서 전반적인 생존 및 치료 안전성을 개선하였다. 이 연구는 EGFR 돌연변이 NSCLC 오가노이드에서 FDA 승인 EGFR 티로신 키나제 억제제 osimertinib24,25에 대한 민감성을 결정하였다. EGFR-돌연변이 NSCLC 오가노이드는 NSCLC 환자의 외과적 절제 또는 종양 생검 표본으로부터 생성되었고, DNA 시퀀싱에 의해 지시된 종양원성 돌연변이를 보유하는 것으로 확인되었다. 상기 요약된 바와 같이, EGFR-돌연변이체 NSCLC 오가노이드 모델을 에스컬레이션 투여량의 오시머티닙 및 PDO 생존력으로 처리하였고, 치료 개시 후 발광-기반 세포 생존 판독 오일에 의해 평가되었다. EGFR 변이체 (EGFRdel19) 양성 TH107 오가노이드는 56 nM의 절반 최대 억제 농도 (IC50)로 오시머티닙 처리에 대한 감수성을 보인 반면 (도 2A), EGFR 돌연변이체 (EGFRL858R) 양성 TH116 오가노이드는 1 μM 초과의 IC50을 사용한 오시머티닙 처리에 내성을 보였다 (도 2B). EGFRdel19 양성 TH107 NSCLC의 민감성은 세포 주기 관련 유전자 시그너처의 발현 감소 및 아폽토시스 관련 유전자 시그너처의 발현 증가를 포함하는 유의한 전사 변화를 수반하였다(보충 도 2A,B). 참고로, 민감한 EGFRdel19 양성 NSCLC 세포주 PC9에 대한 반응 데이터가 제시된다(도 3A, B). 후자는 2D 발광 기반 생존 분석법에 의한 오시머티닙의 투여량을 증가시키기 위한 생존 분석(도 3A) 및 웨스턴 블롯에 의한 EGFR-MAPK 신호전달의 수준에 대한 신호전달 억제에 대한 연구를 포함한다(도 3B). 전반적으로,이 데이터는 약물 반응을 결정하고 민감한 NSCLC 및 내성 NSCLC PDO 모델을 구별하기위한 현재 프로토콜의 정확성을 강조합니다. EGFRL858R 양성 TH116 오가노이드 및 이용 가능한 임상 표본에 대한 추가 분석은 가능한 내성 관련 변화를 결정하기 위해 필요하다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig02.jpg"> 도 2: 오시머티닙 에스컬레이션에 대한 EGFR 돌연변이 NSCLC 오가노이드 모델의 치료 반응 곡선. (a) EGFRdel19 양성 TH107 NSCLC 오가노이드 모델에서의 오시머티닙 반응. (b) 내성 EGFRL858R 양성 TH116 NSCLC 오가노이드 모델에서의 오시머티닙 반응. 데이터 점은 평균 +/- 표준 편차를 나타내는 정규화된 값으로 표시되며, 비선형 회귀 곡선은 데이터를 통해 적합됩니다. TH107, n = 데이터 포인트당 6개의 기술 반복실험. TH116, n = 데이터 포인트당 4개의 기술 반복실험. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig03.jpg"> 도 3: 상이한 배지에서 배양된 민감한 EGFR 돌연변이 NSCLC 세포주 및 오가노이드 모델에서 오시머티닙에 대한 치료 반응에 대한 비교 데이터. (a) EGFRdel19 양성 NSCLC 세포주 PC9에서의 오시머티닙 반응은, 표준 2D-CTG 분석법에 의해 결정된다. (b) 오시머티닙(2 μM)으로 이틀 처리시 PC9 세포에서의 신호전달 억제. (c) LGM 및 GM 배지에서 배양된 민감한 EGFRL858R 양성 TH330 NSCLC 오가노이드 모델에서의 오시머티닙 반응. (d) LGM 및 GM 배지에서 내성 AZ021 NSCLC 오가노이드 모델에서의 오시머티닙 반응. AZ021에서 발암성 EGFRL858R 돌연변이의 확인은 실패하고 오시머티닙 반응의 결핍에 대한 원인이 될 수 있다. A 및 C-D의 경우 데이터 포인트는 평균 +/- 표준 편차를 나타내는 정규화된 값으로 표시되며, 비선형 회귀 곡선은 데이터를 통해 피팅됩니다. PC9, n = 데이터 포인트당 3개의 기술 복제실험. TH330, n = 데이터 포인트당 5개의 기술 반복실험. AZ021, n = 데이터 포인트당 6개의 기술 반복실험. 통계적 유의성을 결정하기 위해 정규화된 데이터에 대해 Wilcoxon 순위 검정을 수행하였다. TH330 (C)의 경우, LGM 대 GM, ** p = 0.0078. AZ021 (D)의 경우, LGM 대 GM, ns p = 0.0742. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: EGFR 돌연변이 오가노이드 모델의 계수 및 생존력 평가를 위한 대표적인 세포 분석기 결과. TH107 및 TH107BC는 상이한 오가노이드 모델을 지칭하고, A 및 B는 생물학적 복제물을 지칭한다. 각 모델 및 생물학적 복제에 대해 세 가지 기술적 반복실험이 계산됩니다. 모두 ≥95 %의 생존력을 보여줍니다. 세포 계수 중 대표적인 이미지가 오른쪽에 제시되어 강력한 생존력과 단일 세포 해리를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig1-R2.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 2: EGFR 돌연변이체 TH107 NSCLC 오가노이드에 대해 수득된 벌크 RNA 시퀀싱 데이터를 이용한 유전자 세트 농축 분석(GSEA)을 사용하여, 미처리 대조군(DMSO)과 3일 동안 오시머티닙으로 처리된 세포를 비교(OSI_D3). (A-B) 표적 치료시, 민감한 세포는 세포주기 G1 정지를 겪고 활성 증식을 중단한다. G2M 세포 주기 유전자의 발현이 활성 증식과 관련됨에 따라, 처리되지 않은 대조군 (DMSO)에서의 발현의 명목상 농축이 예상된다. 아폽토시스 관련 유전자의 경우, 처리된 세포(OSI_D3)에서의 명목상 농축이 예상된다. 둘 다 EGFR 돌연변이체 TH107 오시머티닙으로 처리된 NSCLC 오가노이드 모델에서 확인되었다: (A) Hallmark G2M 발현 시그니처에 대한 GSEA (왼쪽)는 DMSO-처리된 세포에서의 농축을 나타낸다. 명목상 농축 점수 (NES): +1.708, FDR &lt; 0.0001. (b) 홀마크 아폽토시스 발현 시그니처에 대한 GSEA (오른쪽)는 오시메르티닙 처리된 세포에서의 농축을 나타낸다. NES : -1.075, FDR : ns, 0.3275. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig2-R2.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 3: 고정된 농도에서 두 번째 첨가제 억제제의 존재 하에 에스컬레이션된 오시메르티닙으로 처리된 EGFR 돌연변이 TH330 오가노이드 모델에서의 조합 약물 처리. EGFR 돌연변이체 NSCLC에서의 내성-관련 변경, 즉, SRC 및 AXL 활성화26,27,28, SRC 억제제 사라카티닙 (100 nM) 또는 AXL 억제제 R428 (500 nM), n=6 데이터 포인트당 기술적 반복실험과의 조합 처리에 의해 약리학적 표적화되었다. 두 조합 치료 모두 치료 반응이 증가했으며, 오시메르티닙과 SRC 억제제 사라카티닙의 조합에 유의성이 있었다. 통계적 유의성은 윌콕슨 순위 검정에 의해 평가되었다: 오시메르티닙 대 오시메르티닙 + 사라카티닙, *p=0.0195; 오시메르티닙 vs. 오시메르티닙 + R428, ns, p = 0.2500. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig3-R2.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 시딩 (d0)에서 7 일 후 처리 (d7)로 오가노이드 크기의 변화. (A) EGFRdel19 양성 NSCLC 오가노이드 TH107에서의 성장 발달. (b) EGFRL858R 양성 NSCLC 오가노이드 TH330에서의 성장 발달. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 NSCLC 환자 유래 오가노이드 모델에서 표적화된 신호전달 억제제에 대한 약물 민감성의 표준화된 평가를 기술한다.

EGFR 돌연변이 NSCLC 환자 유래 오가노이드에서 표적 치료법에 대한 민감도 프로파일링

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

이 프로토콜은 오가노이드로 성공적으로 작업하는 것이 세부 사항에 달려 있기 때문에 중요하며 현장에는 다른 사람들이 구축 할 수있는 명확한 세부 프로토콜이 누락되어 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 시간 척도, 낮은 바이오 매스 요구 사항 및 저렴한 비용 확장 성입니다. 훨씬 더 많은 연구가 필요하지만,이 기술은 임상 적으로 번역 될 수있는보다 정확한 개별 또는 조합 요법의 테스트를 허용함으로써 폐암 치료를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.가장 큰 도전은 Matrigel로 널리 알려진 BME2를 처리하는 것입니다. 소중한 오가노이드를 소개하기 전에 액체 BME2를 피펫팅하고 취급하는 것이 좋습니다. 먼저 침수된 BME2 오가노이드 배양물을 배양 플레이트에서 조심스럽게 흡인하여 배양물을 접촉시키지 않도록 분리시킨다.침수된 BME2 오가노이드 배양물을 여섯 웰 플레이트에 웰당 2밀리리터의 재조합 효소를 첨가함으로써 적합한 재조합 효소로 트립신화한다. BME2를 상하로 반복적으로 피펫팅하여 기계적으로 파쇄하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 세포 배양 배양기에서 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝나면 현탁액을 15 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 5 분 동안 600 배 G에서 원심분리한다.재조합 효소 상청액을 오가노이드 펠릿을 건드리지 않고 조심스럽게 흡인하고, 오가노이드 펠릿을 성장 배지에 재현탁시킨다. DNase 1을 첨가한 후, 현탁액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 실온에서 3분 동안 600배 G에서 원심분리한다. 오가노이드 펠릿을 만지지 않고 조심스럽게 배지를 버리고 펠렛을 신선한 성장 배지에 재현탁하십시오.새로운 검은색 투명 바닥 96웰 플레이트를 섭씨 37도에서 10분 동안 세포 배양 인큐베이터에서 예열한 다음, 세포 분석기를 사용하여 세포를 계수하기 위해 PBS에 세포 현탁액을 제조하였다. 실험에 필요한 세포 현탁액 부피를 계산한 후, 이전에 입증된 바와 같이 원심분리에 의해 단일 세포 현탁액 및 펠릿으로부터 세포를 분취한다. 배지가 폐기되면 BME2에서 재현탁하기 전에 세포를 약 1분 동안 얼음 위에 보관하십시오.미리 예열된 검은색 투명 바닥 96웰 플레이트를 몸체 쪽으로 기울이고 웰 당 다섯 마이크로리터의 세포 현탁액을 시드한 다음, 웰의 6시 위치에 세포 돔을 시딩한다. 96 웰 플레이트의 테두리에 있는 외부 웰을 PBS로 채우고 나머지 내부 웰에 세포 돔을 시드한다. 세포 배양 층류 후드에서 갓 시딩된 세포 돔을 플레이트를 이동시키지 않고 5분 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 섭씨 37도에서 10분 동안 인큐베이션한다.조심스럽게 오가노이드를 함유하는 모든 웰에 웰당 100 마이크로리터의 성장 배지를 첨가하고 100 마이크로리터의 PBS를 플레이트의 테두리에 있는 외부 웰에 첨가한다. 7 일 동안 섭씨 37도에서 오가노이드를 배양하고, 텍스트 원고에 언급 된 지시에 따라 미디어를 변경하고, 광 현미경으로 오가노이드의 성장을 정기적으로 검사합니다. EGFR 돌연변이 비소세포 폐암 오가노이드를 치료하기 위해 오시머티닙을 위한 저성장 인자 배지에서 희석된 연속 약물을 준비한다.낮은 성장 인자 배지 및 0.1%DMSO를 첨가하여 음성 대조군을 포함시킨다. 오가노이드 플레이트를 시계 방향으로 180도 회전시켜 오가노이드가 이제 12시 위치에 오도록 하고 바람직하게는 다중 채널 장치를 사용하여 성장 매체를 조심스럽게 흡인한다. 웰 당 100 마이크로 리터의 조절 또는 약물 용액을 첨가하십시오.처리된 오가노이드를 다시 섭씨 37도에서 5일 동안 세포 배양 배양기에서 배양한다. 섭씨 네 도에서 하룻밤 사이에 시약을 해동하여 생존 검정을 수행하기 시작한다. 시약을 사용 전에 실온에서 30분 동안 수조에서 평형화시키고 반전시켜 혼합한다.각 웰에 시약 100 마이크로 리터를 넣고 오르가노이드 돔의 위치에 놓인 피펫 팁으로 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합하십시오. 어둠 속에서 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 다중 채널 피펫을 사용하여, 용해물의 대략 150 마이크로리터를 새로운 백색 불투명 바닥 96 웰 플레이트로 옮긴 다음, 플레이트를 어둠 속에서 실온에서 추가로 25분 동안 인큐베이션한다.ELISA 플레이트 리더를 사용하여 발광을 기록한다. 사용된 플레이트 레이아웃 및 약물에 대한 모든 원시 읽기 및 기록을 포함하는 적절한 데이터 테이블 형식으로 데이터를 저장합니다. EGFR 돌연변이 양성 TH107 오가노이드는 56 나노몰의 절반 최대 억제 농도로 오시머티닙 처리에 대한 민감성을 보인 반면, EGFR 돌연변이 양성 TH116 오가노이드는 1 마이크로몰 초과의 절반 최대 억제 농도로 오시머티닙 처리에 내성을 보였다.EGFR 양성 TH107 비소세포 폐암 세포의 감수성은 세포 주기 관련 유전자 시그너처의 발현의 감소 및 아폽토시스 관련 유전자의 발현의 증가를 포함하는 유의한 전사 변화를 수반하였다. 표적 억제제에 대한 민감한 EGFR 돌연변이 양성 TH330의 반응은 성장 배지 대 낮은 성장 인자 배지에서 유의하게 영향을 받는다. EGFR 돌연변이 양성 TH330에서의 조합 치료는 증가된 치료 반응을 가져왔다.이 접근법은 분자 치료 또는 조합 치료 요법을위한 개인화 된 전략을 향상시킵니다. 후자는 약물 내성 및 내성 메커니즘을 조기에 표적화하여 임상 반응을 심화시키고 환자 결과를 개선하는 데 도움이됩니다.

profiling-sensitivity-to-targeted-therapies-egfr-mutant-nsclc-patient

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

여기에 제시된 것은 전립선 상피 오르가노이드의 약리학적 반응을 연구하는 프로토콜이다. 오르가노이드는 생체 생물학과 밀접하게 유사하며 환자 유전학을 재현하여 매력적인 모델 시스템을 만듭니다. 전립선 오르가노이드는 야생형 전립선, 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선암에서 확립될 수 있습니다.

약리학적 반응에 유전형과 돌연변이 단면도를 번역하는 공구로 전립선 오르가노이드 문화

시험관 내 스크리닝을 위해 환자 유래 제노이식(PDX)을 사용하여 오가노이드를 생성하여 생체내/생체 외 모델의 쌍을 매칭하는 방법을 설명합니다. PDX 종양은 기계적 또는 효소적으로 작은 조각으로 수확/처리되었으며, 원래 PDX에 대해 처리, 냉동 보존 및 특징인 종양 오르가노이드를 성장시키는 영리한 방법.

암 약리학 연구를 위한 PDX 및 PDX 유래 오르가노이드의 생체내/생체외 환자 유래 모델 쌍 생성

매우 정확한 체외 고처리량 분석 시스템은 암 조직과 유사하지만 96웰 및 384웰 플레이트를 가진 체외 고처리량 분석 시스템에 적합하지 않은 환자 유래 종양 오르가노이드(PdOs)를 사용하여 항암제를 평가하기 위해 개발되었다.

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벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

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비편평 비소세포폐암의 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석

여기에서는 유전자형-표현형 의존성을 조사하고 교모세포종 치료를 위한 잠재적 약물을 스크리닝하기 위해 실험실에서 엔지니어링한 교모세포종 오가노이드(LEGO)를 생성 및 활용하기 위한 포괄적인 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

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이 프로토콜은 간세포암 오가노이드를 생성하고, 약물 치료를 적용하며, 치료 전후로 단세포 RNA 시퀀싱을 수행하여 치료 관련 전사 변화를 특성화하는 간소화된 방법을 제시합니다.

약물 치료 후 간세포암 오르가노이드의 생성 및 단세포 전사체 분석

피하 전임상 모델에서 환자 유래 종양을 활용하여 새로운 치료법, 예측 바이오 마커의 발견 및 약제 내성 경로의 효능을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 이 모델은 신약 개발 과정에서 임상 시험에 앞서 많은 신규 항암 요법의 운명을 결정하는데 중요하다.

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

다음 프로토콜 환자 파생 된 연 조직 육 종 (STS)의 주 문화는의 설립에 집중 한다. 이 모델 분자 배경 및 약리 프로필 이러한 드문 악성 종양의 더 나은 이해를 우리를 도울 수 및 STS 관리를 개선 하기 위한 추가 연구에 대 한 출발점을 대표할 수 있었다.

환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

배우세요 EGFR 돌연변이 비소세포폐암 환자 유래 오가노이드에서 오시머티닙 민감도 프로파일링 방법을. 이 기술은 개별 맞춤 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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