Name: 섬모 박동 빈도의 정량화를 위한 1차 인간 비강 상피 세포 모델의 수집, 확장 및 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 비강 점막에서 기도 줄기세포를 수집하고 기도 상피 세포 모델로 분화시키는 방법을 실시간 세포 이미징을 활용하여 섬모 박동 빈도를 정량화하고 호흡기 질환의 임상 마커로 활용할 수 있습니다.

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연구 참가자와 그 가족의 기여에 감사드립니다. 환자 생체 표본의 조직 및 수집에 대한 시드니 아동 병원 (SCH) 랜드 윅 호흡기 부서의 도움에 감사드립니다 - 존 위저 박사, 이본 벨레시스 박사, 리앤 플러시, 아만다 톰슨, 론다 벨에게 특별한 감사를드립니다. 우리는 UNSW 시드니의 Mark Wainwright Analytical Centre 내의 Katharina Gaus Light Microscopy Facility의 Iveta Slapetova와 Renee Wan의 도움을 인정합니다. 이 작업은 NHMRC(National Health and Medical Research Council) Australia(GNT1188987), CF Foundation Australia 및 Sydney Children's Hospital Foundation의 지원을 받습니다. 저자는 Luminesce Alliance - 어린이 건강을위한 혁신의 기여와 지원에 대해 인정하고 싶습니다. Luminesce Alliance - 어린이 건강을위한 혁신은 시드니 어린이 병원 네트워크, 어린이 의학 연구소 및 어린이 암 연구소 간의 비영리 협력 합작 투자입니다. 소아과 연구를 조정하고 통합하기 위해 NSW 정부의 지원으로 설립되었습니다. Luminesce Alliance는 University of Sydney 및 University of New South Wales Sydney와도 제휴하고 있습니다. KMA는 호주 정부 연구 교육 프로그램 장학금의 지원을 받습니다. LKF는 시드니 코브 로타리클럽/시드니 아동 병원 재단과 UNSW 대학교 대학원 장학금의 지원을 받는다.

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저자는 공개 할 것이 없다고 선언합니다.

비강 상피 시트에서 CBF의 정량화를 모호하게 할 수있는 여러 요인이 있습니다. 상피 시트는 이 시간 동안 섬모 기능이 가장 안정적이기 때문에 샘플 수집 후 3-9시간 이내에 이미지화되어야 합니다(37). 적혈구와 파편이 적을수록 데이터 수집을 방해하기 때문에 이미징에 가장 적합합니다. 이미징을 위한 ROI를 선택할 때, 이러한 변수가 CBF5에 영향을 미치는 것으로 입증되었기 때문에 샘플 수집 중에 가장자리가 손상되거나 중단되지 않은 상피 시트를 선택하는 것이 중요하며, 부착되지 않은 단일 상피 세포가 아닙니다. 또한 움직임이 데이터 수집을 가릴 수 있기 때문에 상피 시트가 정지되어 있어야합니다. 매체의 상피 시트는 종종 다른 방향으로 향합니다27. 파괴된 상피 가장자리와 같은 샘플 품질의 차이가 CBF5에 영향을 미친다는 것이 이전에 입증되었기 때문에 상피...

섬모 박동 빈도(CBF) 및 패턴의 측정은 원발성 섬모 운동 이상증(PCD)1과 같은 호흡기 질환의 진단 도구로 확립되었습니다. 낭포 성 섬유증 (CF)에서 CF 막 횡단 전도도 조절기 (CFTR) 염화물 채널의 기능 장애는기도 표면 액체의 탈수 및 점액 섬모 클리어런스 손상2을 유발합니다. 섬모 기능은 CFTR 채널 활성의 지표로서 일차 기도 세포 모델에서 시험관내에서 조사되었다3. 그러나, 동일한 CFTR 돌연변이를 가진 환자의 경우에도, CFTR 조절 약물에 대한 반응으로 CBF에 상당한 환자 대 환자 가변성이 존재한다3. 또한, 기능 장애 CFTR 조절 염화물 분비가 섬모 기능에 미치는 영향은 잘 이해되지 않았습니다. 현재 체 외 기도 모델의 샘플 준비, 이미지 획득 및 CBF 분석을 입증하는 포괄적 인 프로토콜은 없습니다.
비강 점막 칫솔질로부터 분리 된 비강 상피 시트는 PCD 진단4을위한 섬 모체 기능의 측정에 직접 사용된다. 그러나, 수득된 비강 상피 시트의 크기 또는 품질에 대한 제어는 없지만, CBF는 단일 세포 또는 세포 시트 및 파쇄되거나 중단되지 않은 상피 시트 섬모 가장자리에서 측정되는지 여부에 따라달라집니다5. 따라서 비강 점막 칫솔질을 수집하는 동안 세포 손상으로 인한 이차성 운동 이상증은 CBF에 영향을 미칠 수 있습니다. 비강 상피 세포의 1 차 세포 배양 및 공기-액체 계면 (ALI) 또는 3 차원 기저막 매트릭스에서 섬모기도 상피 오가노이드로의 분화는 2 차 운동 이상증 4,6,7,8이없는 섬모를 생성합니다. ALI에서 분화된 기도 상피 세포(이하 ALI 모델이라고 함)는 생체 외 코 점막 칫솔질의 섬모 박동 패턴과 빈도를 복제하고6 환자 특이적 결함을 유지하면서 섬모 미세 구조, 박동 패턴 및 박동 빈도를 분석할 수 있는 중요한 2차 진단 보조제로 간주되었습니다.9 . 그러나 이러한 유사층화되고 점액섬모로 분화된 세포 모델을 만드는 데 사용되는 방법론에는 불일치가 존재합니다. 상이한 배양 확장 또는 분화 프로토콜은 뚜렷한 상피 표현형(섬모 또는 분비)10을 유도하고 CBF11에 상당한 차이를 초래할 수 있습니다. CBF 는 비강 상피 브러싱 4,6,12,13,14,15,16,기도 상피 오가노이드14,17,18 및 ALI 모델 3,4,6,13,19,20 에서 정량화되었으며, 21. 그러나 이러한 프로토콜 중에는 큰 변동성이 있으며 종종 많은 매개 변수가 제어되지 않습니다. 예를 들어, 일부 연구에서, CBF는 ALI 모델의 세포가 투과성 지지체 삽입물 3,19,20,21 상에 남아있는 동안 현장에서 이미징되지만, 다른 것들은 투과성 지지체 삽입물로부터 세포를 긁어내고 이들을 배지 4,6,13에 부유시키는 것을 이미지화한다.
또한, 섬모 기능을 측정하는 기술의 광범위한 적용은 환경 요인의 변화에 대한 섬모 기능의 극단적 인 민감성에 의해 제한됩니다. 온도 22, 습도 23,24 및 pH 25,26과 같은 환경 요인은 섬모 기능에 영향을 미치며 CBF를 정확하게 정량화하기 위해 조절되어야 합니다. 다양한 실험실에서 사용되는 다양한 생리적 매개 변수와 CBF에 미치는 영향은 이전에 검토되었습니다27.
CBF 측정에 대한 다양한 이미징 기술 및 접근법이 문헌에보고되어 있습니다. PCD 진단의 경우 비디오 현미경을 사용하여 섬모 기능28,29를 측정합니다. 최근에, 차동 동적 현미경에 기초한 비디오 분석 알고리즘이 기도 상피 세포 ALI 모델 3,30에서 CBF 및 섬모 협응을 정량화하는 데 사용되었다. 이 방법은 영역을 분할하거나 선택할 필요 없이 빠르고 완전히 자동화된 방식으로 기도 상피 세포에서 섬모 박동의 특성을 분석할 수 있습니다. CBF의 이미징 및 정량화를 위한 다양한 방법은 문헌에서 CBF에 보고된 차이점을 추가할 수 있습니다(보충 파일 1).
배양에서 정량화에 이르는 프로토콜은 기존 방법을 간소화하고, 배양 조건의 표준화 및 엄격한 환경 통제 조건에서 수행되는 이미지 획득을 통해 개인 내 및 개인 간에 CBF의 일관되고 재현 가능한 정량화를 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 비강 기원의 세 가지 다른 기도 상피 세포 모델 시스템에서 상피 세포 수집, 확장 및 분화 배양 조건, CBF의 정량화에 대한 완전한 설명을 제공합니다: 1) 네이티브 상피 시트, 2) 투과성 지지 삽입물에서 이미징된 ALI 모델 및 3) 세포외 기질(ECM) 내장 3차원 오가노이드(그림 1 ). 비강 하비갑개 칫솔질로부터 수득된 비강 상피 세포는 기관지 칫솔질 수집과 관련된 침습적 절차를 극복하면서 기관지 상피 세포(31)에 대한 효과적인 대용물이기 때문에 기도 상피의 대표자로서 사용된다. 조건부 재프로그래밍 세포(CRC) 방법은 ALI 모델 및 3차원 오가노이드 생성을 위해 일차 기도 상피 세포를 확장하는 데 사용됩니다. 줄기 세포와 유사한 상태로의 기도 상피 세포의 조건부 재프로그래밍은 성장-정지된 섬유아세포 영양세포 시스템 및 Rho-관련 키나아제 (ROCK) 억제제32와의 공동 배양에 의해 유도된다. 중요하게도, CRC 방법은 조직 특이적 분화 잠재력을 유지하면서 기도 상피 세포의 집단 배가를 증가시킵니다(33,34). 모든 기도 상피 세포 모델에서 섬모 기능은 표준화된 이미지 획득 설정을 갖춘 고속 비디오 카메라를 사용하여 온도 제어 챔버에서 캡처됩니다. 맞춤형 스크립트는 CBF의 정량화를 위해 사용됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63090/63090fig01.jpg"> 그림 1: 워크플로의 개략도. 참가자의 비강 하비갑개를 닦은 후 기도 상피 세포는 두 가지 방법 중 하나로 활용됩니다. 기도 상피 시트가 분리되고 섬모 박동 빈도가 즉시 이미지화되거나 기도 상피 세포가 조건부 재프로그래밍 세포 방법을 통해 확장됩니다. CRC-확장 기도 상피 세포는 공기-액체 계면 또는 기도 상피 오가노이드 배양에서 기도 상피 세포를 확립하기 위해 분화됩니다. 섬모 박동 주파수의 이미징은 가열 및 습도 환경 챔버와 빠른 프레임 속도(&gt;100Hz) 과학 카메라가 있는 라이브 셀 이미징 현미경을 사용하여 획득됩니다. 데이터 분석은 사용자 지정 스크립트를 사용하여 수행됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63090/63090fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>아데닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2786</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>고급 DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>알라닐-글루타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8541</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>Andor Zyla 4.2 sCMOS</td><td>옥스포드 기기</td><td></td><td>빠른 프레임 속도(>100 Hz) 과학 카메라</td></tr><tr><td>보틀탑 진공 필터 시스템</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>CLS431098</tr><tr><td>세프타지딤 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6987</td><td>50mg/mL</td></tr><tr><td>세포 배양 현미경</td><td>올림푸스</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>CFI S 계획 형광 ELWD 20XC</td><td>니콘 기기 Inc.</td><td>MRH08230</td><td>긴 작동 거리 대물 렌즈. NA0.45 WD 8.2-6.9</td></tr><tr><td>콜레라 독소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052-1MG</td><td>200 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>코닝 젤 여과기 40 UM</td><td>시그마-알드리치</td><td>CLS431750</td><td>기공 크기 40 &mu; m</td></tr><tr><td>코닝 마트리겔 매트릭스 (페놀 레드 프리)</td><td>코닝</td><td>356231</td><td>세포외 매트릭스 (ECM)</td></tr><tr><td>코닝 보틀탑 진공 필터 시스템</td><td>시그마-알드리치</td><td>CLS431098</td><td></td></tr><tr><td>코닝 쿨셀 LX 세포 냉동 용기</td><td>시그마-알드리치</td><td>CLS432002</td><td></td></tr><tr><td>코닝 트랜스웰 폴리에스테르 멤브레인 세포 배양 인서트</td><td>시그마-알드리치</td><td>CLS3470</td><td>투과성 지지대 인서트. 6.5mm 트랜스웰(0.4 &mu) M 모공 폴리 에스테르 멤브레인 인서트.</td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 자동 세포 계수기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>자동 세포 계수</td></tr>기 <tr><td>세포학 브러시</td><td>McFarlane Medical</td><td>33009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12-Ham</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12-Ham</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-High Glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>라이브 셀 이미징 현미경.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 인증, 열 비활성화, 미국</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone (Amphotericin B)</td><td>Thermo Fisher Scientific 15290018</td><td></td><td>250 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>겐타마이신 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>50 mg/mL</td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>과학 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Greiner Cryo.s 바이알</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3135</td><td>극저온 바이알</td></tr><tr><td>HEPES 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>1 M</td></tr><tr><td>HI-FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>3.6 mg/mL</td></tr><tr><td>인큐베이터 NL Ti2 BLACK 2000</td><td>PeCon</td><td></td><td>현미경 환경 챔버. 따뜻한 공기 배양 및 국소 CO2 및 O2 가스 허용</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L</td><td>John Morris Group</td><td>74220 706</td><td>Bead bath</td></tr><tr><td>Lab Armor Beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1254302</td><td>Thermal beads</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>컴퓨팅 소프트웨어</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microscoft</td><td></td><td>스프레드시트 소프트웨어</td></tr>: <tr><td>NIH/3T3</td>, <td>American Type Culture Collection</td>, <td>CRL-1658</td>, <td>방사선 조사, NIH-3T3, 마우스 배아 공급</td></tr>세포, <tr><td>NIS-Elements, AR</td>, <td>Nikon Instruments, Inc.</td><td></td><td>이미지 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4333</td><td>10,000 단위 페니실린 및 10&nbsp; mg 스트렙토마이신/mL</td></tr><tr><td>둘베코&프라임; s 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult 기도 오가노이드 키트</td><td>StemCell Technologies</td><td>5060</td><td>기도 오가노이드 키트</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 매체</td><td>StemCell Technologies</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-Ex Plus Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>PureCol-S</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5015</td><td>Type I 콜라겐 용액</td></tr><tr><td>시약팩 배양 시약</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td></td></tr><tr><td>rhEGF (표피 성장 인자, 인간)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>25 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl(ROCK 억제제)</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>10mM</td></tr><tr><td>토브라마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td>100mg/mL</td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4%</td></tr><tr><td>UNO 스테이지 상단 인큐베이터</td><td>Okolab</td><td></td><td>현미경 인큐베이터. 온도, 습도 및 CO2 조절 가능</td></tr></tbody></table>

섬모 박동 빈도의 정량화를 위한 1차 인간 비강 상피 세포 모델의 수집, 확장 및 분화

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

섬모 기능 (박동 빈도, 패턴)의 측정은 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 호흡기 질환의 진단 도구로 확립되었습니다. 그러나, 이들 기술의 더 넓은 적용은 온도, 습도 및 pH와 같은 환경 인자의 변화에 대한 섬모 기능의 극단적 인 민감성에 의해 제한된다. 낭포 성 섬유증 (CF) 환자의기도에서 점액 축적은 섬모 박동을 방해합니다. 섬모 기능은 CF 막 횡단 전도도 조절기 (CFTR) 채널 활성의 지표로서 1 차기도 세포 모델에서 조사되었습니다. 그러나 동일한 CFTR 돌연변이를 가진 환자의 경우에도 CFTR 조절 약물에 대한 반응으로 섬모 박동 빈도의 상당한 환자 간 변동성이 발견되었습니다. 또한, 기능 장애 CFTR 조절 염화물 분비가 섬모 기능에 미치는 영향은 잘 이해되지 않았습니다. 현재 체외 기도 모델의 샘플 준비, 이미지 획득 및 섬모 박동 주파수 (CBF) 분석을 입증하는 포괄적 인 프로토콜은 없습니다. 환경적으로 통제된 조건에서 수행된 표준화된 배양 조건 및 이미지 획득은 개인 간 및 CFTR 조절 약물에 대한 반응으로 CBF의 일관되고 재현 가능한 정량화를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 세 가지 다른 기도 상피 세포 모델 시스템에서 CBF의 정량화를 설명합니다: 1) 천연 상피 시트, 2) 투과성 지지 삽입물 상에서 이미징된 공기-액체 인터페이스 모델, 및 3) 세포외 기질-포매된 3차원 오가노이드. 후자의 두 가지는 생체 내 폐 생리학을 복제하여 섬모를 뛰고 점액을 생성합니다. 섬모 기능은 환경 제어 챔버에서 고속 비디오 카메라를 사용하여 캡처됩니다. 사용자 정의 스크립트는 CBF 분석에 사용됩니다. CBF 측정을 클리닉으로 번역하는 것은 환자별로 CFTR 조절 약물에 대한 반응을 예측하는 데 중요한 임상 도구로 구상됩니다.

CBF를 정량화하는 데 있어 이 프로토콜의 효율성을 입증하기 위해, CF를 가진 3명의 참가자와 3명의 건강한 대조군 참가자로부터 유래된 기도 상피 세포 ALI 모델에서 측정된 CBF의 결과가 제시된다. 배양 분화 14일째에 박동섬모가 존재했습니다(그림 6). 배양 분화 14일째부터 21일째까지, 두 코호트 모두에서 통계적으로 유의한(P &lt; 0.0345) CBF 증가가 관찰되었다. 배양 분화 21일차에 건강한 대조군 참가자(7.61 ± 0.11Hz)의 평균 CBF는 CF(6.7±5 0.17Hz)를 가진 참가자의 평균 CBF보다 유의하게 높았습니다. 점액 축적 및 제거가 CBF에 영향을 미치는 정도를 이해하기 위해, CBF는 점액 제거 후 동일한 세포 모델에서 이미징되었다. 건강한 개인과 CF를 가진 사람 모두의 ALI 모델에서 점액을 제거했을 때 CBF가 통계적으로 유의하게 증가했습니다(P &lt; 0.0001).<...

이 프로토콜은 비강 상피 세포 수집, 확장 및 기관형 기도 상피 세포 모델로의 분화와 라이브 셀 이미징 및 맞춤형 스크립트를 통한 섬모 박동 빈도의 정량화를 설명합니다.

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

우리는 코 점막에서기도 줄기 세포의 수집을 설명합니다. 이 세포는 실험실에서 유사층화된 상피로 확장되고 분화됩니다. 이것은 시험관 내 확장 및 분화이며, 이는 생체 내기도와 유사하며, 이는 섬모 박동 빈도를 정량화하는 데 사용할 수있는 섬모 세포와 같은 특수 세포가 있음을 의미합니다.서로 다른 개인과 다른 약물에 대한 반응으로 섬모 박동 빈도의 일관되고 재현 가능한 정량화를 가능하게 하기 위해 당사는 배양 조건과 이미지 획득을 표준화합니다. 섬모 박동 빈도 측정은 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 질병의 임상 도구로 사용됩니다. 우리는 이것을 낭포 성 섬유증의 임상 마커로 확립하기를 희망합니다.이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 박사 과정 학생 인 Katelin Allan과 Laura Fawcett과 내 연구실의 박사후 연구원 인 Sharon Wong 박사입니다. 참가자에게 입으로 숨을 쉬도록 요청하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 주로 사용하는 손에 세포학 브러시를 잡고 참가자의 턱에 다섯 번째 숫자를 올려 손을 고정하고 세포학 브러시를 참가자의 비강에 참가자의 얼굴과 45도 각도로 삽입하고 비강 미트를 통과시킵니다.브러시를 똑바로 회전시켜 참가자의 얼굴에 수직이되도록 한 후 브러시가 하부 비갑개의 중간에서 뒤쪽 부분이 될 때까지 하비갑개 아래 코의 측면 벽에 대해 브러시를 부드럽지만 단단히 전진시킵니다. 브러시를 360도 최대 3 번 돌립니다. 그런 다음 부드럽게 제거하고 삽입 조작을 반대로 하여 셀이 브러시에서 빠지지 않도록 합니다.브러시를 비강 세포 수집 배지가 있는 준비된 수집 튜브에 넣고 수집 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 브러시에서 세포를 제거하기 위해 부드럽게 소용돌이 한 후 얼음 위의 수집 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다. 혈청 피펫을 사용하여 수집 튜브에서 새 튜브로 배지를 옮기고 세포학 브러시를 남깁니다.그런 다음 샘플을 원심 분리하십시오. 원심분리 후, 1밀리리터의 조건부 재프로그래밍 세포 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 그런 다음 5 밀리리터의 혈청 학적 피펫을 사용하여 50 밀리리터 튜브 위에 놓인 세포 체를 원형 운동으로 통과시킵니다.단일 세포 현탁액을 얻으려면 튜브 바닥에서 현탁액을 수집하고 체를 여러 번 통과시킵니다. 그런 다음 셀 체를 폐기하십시오. 기도 상피 세포를 준비된 투과성 지지체 삽입물에 시드하려면 기포를 생성하지 않고 세포를 잘 혼합하여 균질하고 현탁 상태인지 확인합니다.그런 다음 150 마이크로 리터의 세포 현탁액을 준비된 투과성 지지 삽입물의 정점 측에 추가합니다. 공기-액체 계면에서기도 상피 세포를 분화시키기 위해, 이들을 분화 또는 ALI 배지에서 2 일 동안 배양하십시오. 그런 다음 매체를 흡입하고 750마이크로리터의 ALI 배지를 기저 구획에만 추가하여 공기-액체 인터페이스를 만듭니다.ECM 돔에기도 상피 세포를 시드하려면 해리 된기도 상피 세포를 적절한 부피의 90 % ECM으로 재현탁하십시오. 이어서 피펫을 웰의 바닥에 최대한 가깝게 90도 각도로 수직으로 잡고 50 마이크로리터의 ECM 세포 현탁액을 웰의 중앙에 분배한다. ECM이 굳을 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.ECM이 응고되는 동안 기도 오가노이드 파종 매체(AOSM)를 실온으로 따뜻하게 하여 재액화 및 추가 시 ECM 돔의 붕괴를 방지합니다. 배양 후, 우물의 벽을 분배하여 500 마이크로 리터의 온난 된 AOSM을 각 웰에 첨가하십시오. 미디어를 ECM 돔에 직접 피펫팅하지 마십시오.4-7 일 동안 2 일마다 미디어를 교체하십시오. 미디어를 흡입하려면 플레이트를 45도 각도로 기울이고 ECM 돔에서 멀리 떨어진 우물의 하단 가장자리에서 흡인합니다. 4-7일 후, 500마이크로리터의 온난화된 기도 오가노이드 분화 배지(AODM)를 각 웰에 추가하여 오가노이드 분화를 시작하고 7일 동안 이틀마다 배지를 교체합니다.기도 상피 세포 모델을 포함하는 배양 플레이트를 현미경 플레이트 삽입물에 넣고, 현미경 환경 챔버를 닫는다. 샘플이 예열된 섭씨 37도, 5%이산화탄소로 채워진 현미경 챔버에서 30분 동안 평형을 이루도록 합니다. 현미경 접안 렌즈에서 세포 모델에 초점을 맞 춥니 다.그런 다음 획득 소프트웨어를 사용하여 L100을 클릭하여 광 경로를 카메라가 장착된 포트로 전환합니다. 녹색 재생 버튼을 클릭하여 소프트웨어를 통해 현미경 시야를 시각화합니다. 섬모에 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 필요한 경우 조정하십시오.메뉴에서 타임랩스 이미지를 가져오려면 획득을 클릭한 다음 빠른 타임랩스를 클릭합니다. 팝업 창에서 저장 위치와 파일 이름을 선택하고 1, 000 프레임을 획득하십시오. 현미경 시야에서 섬모를 미리 보려면 적용을 클릭한 다음 녹색 재생 버튼을 클릭합니다.필요한 경우 Z 초점을 조정합니다. 그런 다음 지금 실행을 클릭하여 빠른 타임랩스를 캡처합니다. 필요한 소프트웨어 및 도구 상자를 설치한 후 적절한 사용자 지정 분석 스크립트와 지원 스크립트 폴더를 컴퓨터의 로컬 드라이브에 복사합니다.그런 다음 컴퓨팅 소프트웨어에서 홈 탭을 클릭 한 다음 경로 설정을 클릭하십시오. 팝업 창에서 하위 폴더와 함께 추가를 클릭합니다. MATLAB 검색 경로 아래에 표시된 폴더를 선택합니다.그런 다음 저장 후 닫기를 클릭하십시오. 분석 스크립트가 왼쪽 패널에 나타나는지 확인하여 컴퓨팅 소프트웨어에 연결되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 획득한 예제 원시 이미지 파일을 컴퓨터의 로컬 드라이브로 전송합니다.그런 다음 BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove 클릭하십시오. m 분석 스크립트 파일을 컴퓨팅 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. 스크립트를 실행하려면 편집기 탭을 클릭한 다음 녹색 재생 버튼을 클릭합니다.표시되는 프롬프트 창에서 분석할 원시 이미지 파일을 선택합니다. 프레임당 획득 시간에 대한 노출 시간을 입력합니다. 그런 다음 확인을 클릭하십시오. GetFirstAmplitude를 실행합니다.m 스크립트를 AveSpectrum 파일이 포함된 폴더에 저장합니다. 스크립트가 FirstAmplitudeStacked를 출력할 때까지 기다립니다. XLSX 파일은 가장 높은 진폭 주파수를 포함하고기도 상피 섬모 박동의 생리적 범위 내에 있습니다.FirstAmplitudeStacked에서 주파수 값을 복사합니다. XLSX 파일을 열고 과학 분석 소프트웨어를 사용하여 플롯합니다. 낭포성 섬유증이 있는 3명의 참가자와 3명의 건강한 대조군 참가자로부터 유래된 기도 상피 세포 ALI 모델에서 측정된 섬모 박동 빈도의 결과가 제시됩니다.문화 분화 14 일째에는 섬모를 때리는 것이 존재했습니다. 배양 분화 21일째인 14일째부터, 섬모 박동 빈도의 통계적으로 유의한 증가는 코호트 간에 관찰되지 않았다. 배양 분화 21일차에 건강한 대조군 참가자의 평균 섬모 박동 빈도는 낭포성 섬유증 참가자의 빈도보다 유의하게 높았습니다.또한, 점액 제거 후 동일한 세포 모델에서 섬모 박동 빈도를 이미지화했을 때 건강한 개인과 낭포성 섬유증 환자 모두의 ALI 모델에서 점액을 제거했을 때 섬모 박동 빈도가 통계적으로 유의하게 증가했습니다. 섬모 기능은 환경 요인의 변화에 매우 민감하기 때문에 이미징 환경을 엄격하게 규제해야합니다. 이 플랫폼은 CFTR 기능을 조절하는 약물을 식별 할 수 있도록 환자 별 약물 스크리닝을 위해 구축 될 가능성이 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한​​ 쉽고 안정적​​인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.

설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

이 간행물은 어린이의 코 상피 점막을 성공적으로 샘플링 및 배양하고 이러한 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다.

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

일차 섬모 신경 전구 세포의 증식, 신경 세포 분화, 성인 신경 기능에 근본적으로 중요하다. 여기서 우리는 ciliogenesis 및 기본 neurosphere 문화를 사용하여 신경 줄기 / 전구 세포 및 분화 된 신경 세포의 섬모에 신호 단백질의 인신 매매를 연구하는 방법을 설명합니다.

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

여기 우리 인간의 비 강 상피 세포의 3 차원 회전 타원 체 문화를 생성 하는 방법을 설명 합니다. Spheroids는 다음 드라이브 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 자극-종속 이온 및 액체 분 비, CFTR 함수에 대 한 프록시로 회전 타원 체 luminal 크기의 변화를 측정.

개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성

PCD 진단을 위한 성공적이고 고품질의 섬모 기능 분석을 보장하려면 호흡기 상피 샘플링 및 처리를 위한 정확하고 신중한 방법이 필수적입니다. COVID-19 팬데믹 기간 동안 PCD 진단 서비스를 계속 제공하기 위해 섬모 비디오 현미경 프로토콜이 적절한 감염 관리 조치를 포함하도록 업데이트되었습니다.

디지털 고속 섬모 비디오 현미경을 사용한 비강 칫솔질 샘플링 및 처리 – COVID-19 전염병에 대한 적응

이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 비강 상피 세포와 선천적 세포 활성화 사이의 초기 상호 작용에 대한 조사를 자세히 설명합니다. 면역 세포의 개별 서브세트는 바이러스 감염에 대한 반응에서의 그들의 활성화에 기초하여 구별될 수 있다. 그런 다음 초기 항 바이러스 반응에 미치는 영향을 결정하기 위해 더 조사 할 수 있습니다.

호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.

인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징

여기서 우리는 공기-액체 계면에서 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포의 단리, 증폭 및 분화 및 증폭 된 HNE를 성공적으로 동결 및 해동 할 수있게 해주는 바이오 뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상이한 조절제 처리시 분화된 HNE 세포의 전기생리학적 특성 및 CFTR 관련 염화물 분비 보정을 분석한다.

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

공기-액체 계면 배양은 일반적으로 폐기도의 정점 쪽을 모방하는 1차 정상 인간 기관지 상피 세포를 분화하여 가성층화 기도 상피를 개발하는 데 사용됩니다. 여기에서는 섬모 기능 및 막 무결성과 같은 생물물리학적 특성을 모니터링하여 품질을 결정하기 위한 쉬운 프로토콜에 대해 설명합니다.

Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway epithelium(가성층화된 폐 기도 상피의 섬모 기능 및 막 불투과성 측정)

배우세요 비강 점막에서 기도 줄기세포를 수집하고 기도 상피 세포 모델로 분화시키는 방법을 실시간 세포 이미징을 활용하여 섬모 박동 빈도를 정량화하고 호흡기 질환의 임상 마커로 활용할 수 있습니다.

섬모 박동 빈도의 정량화를 위한 1차 인간 비강 상피 세포 모델의 수집, 확장 및 분화

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