Name: 다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 다능성 줄기 세포를 이용한 인간 심장 오르가노이드 생성 방법으로 심장 발달 및 선천성 심장 결함 연구에 활용하세요. 이 기술은 약물 스크리닝에도 적합합니다.

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이 작품은 수여 번호 K01HL135464 및 R01HL151505 및 수상 번호 19IPLOI34660342에서 미국 심장 협회에 의해 국립 건강 연구소의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 MSU 고급 현미경 검사법과 공초점 현미경, IQ 현미경 코어 및 시퀀싱 서비스에 대한 MSU 유전체학 코어에 대한 액세스에 대한 약리학 및 독성학의 MSU 부서에서 박사 윌리엄 잭슨에게 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 귀중한 의견과 조언에 대한 Aguirre 연구소의 모든 구성원에게 감사드립니다.

1. hPSC 문화 및 유지 보수
참고: 인간 유도 된 PSC (hiPSCs) 또는 인간 배아 줄기 세포 (hESC)는 분화 또는 추가 극저온 보존을 위해 EB를 생성하는 데 사용되기 전에 해동 후 적어도 2 개의 연속 된 구절을 배양해야합니다. hPSC는 지하 막 세포 매트릭스 (BM-ECM)-코팅 된 6 웰 배양 판에 PSC 배지 ( 재료의 표 참조)에서 배양된다. 6웰 플레이트에서 hPSC에 대한 중간 변화를 수행할 때, 원치 않는 세포 분리 또는 스트레스를 방지하기 위해 세포 위에 직접 붙이지 않고 우물 의 내부 측면에 직접 배지를 추가합니다. 사용자는 37 °C에서 따뜻하게해서는 안되는 사전 온난화 PSC 미디어를 주의해야합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 PSC 미디어는 열불안정이었습니다.
<ol><li>BM-ECM로 잘 플레이트를 코팅하려면 BM-ECM의 알리쿼트 1개(제조업체의 지침에 따라 -20°C에 저장됨)를 얼음에 해동하고 BM-ECM의 0.5 mg을 12mL의 콜드 덜벡코의 수정된 이글 매체(DMEM)/F12 매체(4°C에 저장)로 혼합한다. DMEM/F12-BM-ECM 혼합물을 6웰 플레이트의 각 웰에 분배하고 37°C에서 적어도 2시간 동안 배양한다.</li>
	<li>세포를 해동하려면 먼저, 소량의 얼음만 보일 때까지 37°C 비드 또는 수조에서 hPSC 극저온을 1-2분 동안 해동한다. 해동된 세포를 원심분리기 튜브로 옮기고 록 억제제, 티아조빈(Thiaz) 및 원심분리기를 5분 × 300g 에 2μM로 보충된 PSC 배지의 8-9mL를 천천히 첨가한다. 상체를 제거하고 티아즈의 2 μM으로 보충된 PSC 배지의 세포 펠릿을 다시 분리한다. 배양 배지내의 세포를 37°C에서 극저온 세포 농도 및 배양에 따라 1-2 웰로 분배하고, PSC 배지를 변경하기 전에 24시간 동안 5% CO2 를 한다.</li>
	<li>세포의 배지를 48시간 간격으로 변경합니다. DMEM/F12(1mL/웰) 및 PSC 배지(2mL/웰)를 사용하여 세서및 중간 변화를 각각 수행합니다. 참고: 세싱은 세포 폐기물과 이물질을 제거하는 데 도움이 되며 신선한 미디어 변화는 세포에 영양분을 새롭게 공급합니다.</li>
	<li>배지를 달아서 소급(60-80% 컨서블)에 세포를 통과한 다음, 덜벡코의 인산염 완충액 1mL(칼슘 없음, 마그네슘 없음)로 각각 잘 세척합니다. DPBS). DPBS를 흡기하고 hPSC에 대한 해리 시약1mL을 추가합니다( 재료표 참조), 10s 이후 시약의 박막을 제외한 모든 사람의 포부를 포부한다.</li>
	<li>세포 간 간격이 형성될 때까지 hPSC용 해리 시약의 박막으로 2-5분 동안 배양한다. 참고: 해리를 중지하는 시간은 세포 선에 따라 다릅니다.</li>
	<li>티아즈(PSC 매체+티아즈)의 2μM로 보충된 PSC 배지 1mL을 우물에 넣고 부드럽게 플레이트를 눌러 세포 분리를 유도합니다. 배지에서 분리된 세포를 1-2배 배혈하여 임의의 큰 식민지를 분해하고, PSC 배지+티아즈에서 세포를 1:6 의 음비로 재보종(12mL에서 잘 재장매된 12mL의 세포). BM-ECM 코팅 된 우물에 세포를 다시 플레이트.</li>
</ol>2. 3D 자체 조립 인간 심장 오르가노이드의 세대
<ol><li>배아 체 (EB) 형성: 참고: 배아 체 형성 전에 관찰 가능한 분화 세포를 제한하는 것이 필수적입니다. 60-80%의 합류로 6웰 플레이트의 2~3개의 우물은 단일 96웰 의 오르가노이드 플레이트에 충분한 세포를 산출합니다. 모든 매체는 EB 또는 오르가노이드에 대한 온도 충격을 최소화하기 위해 중간 변화가 일어나기 전에 37°C 비드 또는 수조에서 알리인용 및 따뜻하게 해야 합니다(이것은 세포 해리 시약을 포함하지 않음). 그림 1A, B를 참조하십시오.<ol>
<li>일 -2<ol>
<li>EB를 만들려면- 2일째에 DPBS로 서브 컨셀릭 hPSC(60-80% 컨셀)를 세척하여 세포 잔해를 씻고 DPBS를 흡인시합니다.</li>
			<li>세포를 분리하고 단일 셀 상태로 방출하려면 실온 셀 해리 시약 1mL( 재료 표 참조)을 각 웰에 3-6분 동안 추가합니다. 부드럽게 플레이트를 ~5회 탭하여 현미경으로 검사하는 동안 분리를 유도합니다. 반응을 중지PSC 중간 + 티아즈의 1 mL을 추가합니다.</li>
			<li>세포를 수집하고 남은 골재를 분해하기 위해, 미디어를 2-3배 위아래로 피펫하여 단일 셀 서스펜션을 생성합니다. 단일 셀 서스펜션을 원심분리관으로 옮기고 300 ×g에서 5분 동안 회전 합니다.</li>
			<li>원하는 세포 농도를 얻으려면, 상체를 버리고 PSC 배지+티아즈의 1mL에서 세포를 재보선한다. 세포 카운터 또는 혈류계를 사용하여 세포를 계산하고 PSC 배지+티아즈의 세포를 100,000세포/mL 의 농도로 희석시다.</li>
			<li>EB 형성을 위해 세포를 분배하려면 멀티채널 파이펫을 사용하여 라운드 바닥 초저 부착 96웰 플레이트의 각 웰에 100 μL(10,000개의 셀)을 추가합니다. 플레이트를 100 × g 에서 3분 동안 원심분리하고 37°C, 5% CO2에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>일 -1<ol>
<li>각 우물에서 50 μL의 매체를 조심스럽게 제거하고 37°C로 데온 신선한 PSC 배지 200 μL을 추가하여 우물당 250 μL의 최종 부피를 달성합니다. 37°C, 5% CO2에서 24시간 동안 세포를 배양한다. 참고: 우물 하단의 EB가 방해되지 않도록 우물 측면에 매체를 조심스럽게 제거하고 추가합니다. EB의 섬세한 특성과 서스펜션 배양으로 인해, 심계를 변경할 때 소량의 액체를 각 우물에 두어 EB를 방해하지 않도록 해야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>인간 심장 오르가노이드 (hHO) 차별화: 참고: 모든 미디어는 미디어가 변경되기 전에 37°C 비드 또는 수조에서 데워져야 합니다. 웰 의 바닥에 개발 오르가노이드를 방해하지 않도록 우물의 측면에 배지를 조심스럽게 제거하고 추가합니다. 동요를 최소화하고 억제제와 성장 인자의 점진적 제거를 허용하기 위해 미디어 변화 사이에 는 과세가 필요하지 않습니다. 2% B-27 보충제(재료표)를 가진 RPMI는 분화 프로토콜 전반에 걸쳐 사용되었다. B-27 보충 명시 하지 않는 한 인슐린을 포함 (일 0-5 일에 인슐린 무료). 그림 1C를 참조하십시오.<ol>
<li>0일차<ol>
<li>중피 혈통을 향한 차별화를 시작하려면, 각 우물에서 166 μL의 배지를 제거하고 (총 우물 부피의 ~ 2/3rd ) 인슐린없는 B-27 보충제를 포함하는 RPMI 1640의 166 μL을 추가, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng / mL 뼈 형태 호르몬 4 (BMP4), 및 1.5 ng / mL 법 49 의 최종 CHIM 에 대한 1.5 ng / mL 1.25 ng/mL BMP4, 및 1 ng/mL 액티빈 A. 37°C에서 24시간, 5% CO2에 대한 인큐베이션.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1일차<ol>
<li>각 우물에서 166 μL의 매체를 제거하고 인슐린이없는 B-27 보충제로 신선한 RPMI 1640의 166 μL을 추가하십시오. 37°C에서 24시간, 5% CO2에 대한 배양.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2일차<ol>
<li>심장 중피 사양을 유도하기 위해 각 우물에서 166 μL의 매체를 제거하고 인슐린이 없는 B-27 보충제를 함유한 RPMI 1640의 166 μL과 3μM Wnt-C59의 최종 웰 농도를 37°C에서 48시간 동안 인큐베이트합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>4일차<ol>
<li>각 우물에서 166 μL의 매체를 제거하고 인슐린이없는 B-27 보충제로 신선한 RPMI 1640의 166 μL을 추가하십시오. 37°C에서 48시간, 5% CO2에 대한 배양.</li>
		</ol>
</li>
		<li>6일차<ol>
<li>각 우물에서 166 μL의 매체를 제거하고 B-27 보충제로 RPMI 1640의 166 μL을 추가합니다. 37°C에서 24시간, 5% CO2에 대한 배양.</li>
		</ol>
</li>
		<li>7일차<ol>
<li>미원기 분화를 유도하기 위해 각 우물에서 166 μL의 배지를 제거하고 B-27 보충제를 함유한 신선한 RPMI 1640과 3 μM CHIR99021의 최종 웰 농도2 μM CHIR99021을 추가한다. 37°C에서 1시간, 5% CO2에 대한 인큐베이션을 사용할 수 있습니다.</li>
			<li>각 우물에서 166 μL의 매체를 제거하고 B-27 보충제를 함유한 신선한 RPMI 1640의 166 μL을 추가합니다. 37°C에서 48시간, 5% CO2에 대한 배양. 참고: 오가노이드가 미디어 변경으로 인해 이동하기 쉽기 때문에 7일째에 두 번째 중간 변경사항에 주의해야 합니다.</li>
			<li>7일째부터 분석 또는 실험을 위한 수집 또는 전송까지 각 우물에서 166 μL의 배지를 제거하고 B-27 보충제를 함유한 166μL의 신선한 RPMI 1640을 추가하여 48시간마다 중간 변화를 수행합니다. 참고: 오르가노이드는 이전 발달 단계가 관심이 없는 한 15일째에 분석 및 실험을 할 준비가 되어 있습니다. 그들은 장기 문화 또는 성숙 실험을 위해 15 일 전을 배양 할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. 오르가노이드 분석
<ol><li>전체 오르가노이드 전송(라이브 또는 고정) 참고: 라이브 오가노이드 전송의 경우 사용되는 파이펫 팁이 멸균되었는지 확인합니다.<ol>
<li>팁 개구부에서 P200 파이펫 팁 5-10mm를 잘라 서 직경이 2~3mm 넓어지게 됩니다.</li>
		<li>파이펫이 완전히 수직(플레이트에 수직)되도록 오르가노이드를 포함하는 둥근 바닥에 팁을 직접 삽입합니다. 팁을 매체에 삽입하기 전에 파이펫 플런저가 이미 모든 방법을 누른지 확인합니다.</li>
		<li>파이펫 플런저를 천천히 방출하여 유기체를 수집하기에 충분한 매체(100-200 μL)를 차지합니다.</li>
		<li>표적 대상으로 배지로 오르가노이드를 전송합니다(예: 고정, 라이브 이미징, 전기생리학 기록, 새로운 플레이트 배양).</li>
	</ol></li>
	<li>오가노이드 고정 참고: 96웰 배양판 또는 미세원심분리기 튜브에서 유기노이드를 고정하고 염색할 수 있습니다. 파라포름데히드(PFA)는 연기 후드에서만 처리해야 합니다.<ol>
<li>마이크로센티립후이 튜브의 고정을 위해 라이브 오가노이드를 튜브당 1-8개의 오르가노이드로 분리하여 이송합니다. 참고: 튜브당 8개의 오르가노이드를 초과하지 마십시오.</li>
		<li>유기체를 건드리지 않고 튜브에서 가능한 한 많은 매체를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오.</li>
		<li>각 튜브 또는 웰에 4% PFA를 추가합니다(마이크로센심분리기 튜브당 300-400 μL, 96웰 플레이트의 웰당 100-200 μL). 실온에서 30-45분 동안 배양하십시오. 참고: 1h 이상의 잠복기에는 항원 검색 단계가 필요할 수 있으며 권장되지 않습니다.</li>
		<li>유기체를 방해하지 않고 PFA를 안전하게 폐기하십시오. 1.5g/L 글리신(DPBS/Gly)으로 보충된 DPBS로 3개의 세차를 수행하여 4% PFA에 사용되는 동일한 부피를 사용하여 세차 사이에 5분 간 대기합니다. DPBS/Gly를 제거하고 면역 염색 또는 기타 분석을 진행하거나 DPBS를 추가하고 4°C에 저장하여 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. 참고: 고정 된 오르가노이드를 2 주 이상 보관하면 조직 분해 및 오염이 발생할 수 있으며 권장되지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>전산 면역형광 염색<ol>
<li>블로킹/투과성화 용액 100μL(일반 당나귀 혈청 + 0.5% 소 세럼 알부민(BSA) + 1x DPBS에 0.5% 트리톤 X-100을 각각 웰 또는 고정 오르간로이드를 함유한 튜브에 추가합니다. 셰이커에서 하룻밤 동안 실온에서 배양하십시오. 참고: 튜브당 8개의 오르가노이드를 초과하지 마십시오.</li>
		<li>오가노이드를 건드리지 않고 가능한 한 많은 차단 용액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. DPBS로 3번 의 헤이시를 수행하여 5분 간 세동을 대기합니다.</li>
		<li>권장 농도에서 원하는 1차 항체 항체와 함께 1차 항체 용액(1% 정상 당나귀 혈청 + 0.5% BSA + 0.5% Triton X-100 1x DPBS)을 준비한다. 셰이커에서 24시간 동안 4°C에서 배양합니다.</li>
		<li>유기체를 건드리지 않고 가능한 한 많은 항체 용액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. DPBS로 3번 의 헤이시를 수행하여 5분 간 세동을 대기합니다.</li>
		<li>권장 농도에서 원하는 이차 항체 항체와 함께 이차 항체 용액(일반 당나귀 혈청 + 0.5% BSA + 0.5% Triton X-100 1x DPBS)을 권장농도에서 원하는 이차 항체와 준비한다. 항체가 형광으로 표시되면, 어둠 속에서 4°C에서 배양(예를 들어, 알루미늄 호일로 덮여 있음)에 대해 셰이커에 24시간 동안 배양한다.</li>
		<li>유기체를 건드리지 않고 가능한 한 많은 항체 용액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. DPBS로 3번 의 헤이시를 수행하여 5분 간 세동을 대기합니다.</li>
		<li>비드(직경 90-300 μm)가 장착된 슬라이드를 슬라이드 가장자리 근처에 장착( 재료 표 참조)하여 오르가노이드로 커버슬립을 배치합니다. 참고: 진행 하기 전에 구슬 주위 마운팅 매체 건조 를 허용 하는 것이 좋습니다.; 이렇게 하면 구슬이 움직이지 못하게 됩니다. 그림 2를 참조하십시오.</li>
		<li>컷 파이펫 팁을 사용하여 스테인드 오르가노이드를 슬라이드에 옮기고, 비드 사이에, 슬라이드에서 오르가노이드 사이의 접촉을 피하기 위해 간격을 확보합니다. 압연 실험실 닦기의 모서리를 사용하여 유기성 주위의 과도한 액체를 조심스럽게 제거하십시오.</li>
		<li>미끄럼방지 매체(과당-글리세롤 클리어링 액은 60%(vol/vol) 글리세롤과 2.5M 과당)37 을 사용하여 슬라이드당 마운팅 클리어링 매체의 120-150 μL을 사용하여 오르가노이드를 덮는다. 참고: 매우 점성이 있기 때문에 장착 클리어링 매체로 작업할 때 절단 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>마운팅 클리어링 솔루션으로 덮인 오르가노이드로 슬라이드 위에 커버슬립을 마우스로 가져가서 슬라이드 위로 커버슬립을 천천히 눌러 오르가노이드가 장착된 구슬 사이에 있는지 확인합니다.</li>
		<li>탑 코트 네일 바니시를 사용하여 슬라이드의 커버 슬립 둘레를 밀봉하십시오. 1 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 슬라이드를 건조할 수 있습니다. 장기간 보관할 수 있는 어둠 속에서 4°C에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>살아있는 심장 오르가노이드에 있는 칼슘 과도 화상 진찰 참고: 제조업체의 지시에 따르면, 플루오4-AM은 디메틸 설산화물(DMSO)으로 재구성되어 최종 재고 용액 농도가 0.5mM로 재구성되었습니다. 플루오4-AM은 96웰 플레이트에서 오르가노이드에 직접 첨가되었다.<ol>
<li>RPMI 1640 배지를 사용하여 오르가노이드에 2개의 세차장을 수행합니다.<ol>
<li>우물에서 소비된 매체의 166μL을 제거합니다.</li>
			<li>온난한 RPMI 1640 배지 166 μL을 추가하고, 166 μL의 매체를 제거하고, 신선한 RPMI 1640 배지166 μL을 추가합니다. 참고: 세정은 폐기물과 세포 이물질을 제거하기 위해 수행됩니다. 배지의 3분의 2는 기능적 분석 전에 우물의 바닥에 있는 오르가노이드를 방해하지 않도록 세차하는 동안 우물에서 제거된다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>불소4-AM 배지를 오르가노이드에 추가합니다.<ol>
<li>1.5 μM 용액을 준비하기 위해 B-27 보충제를 함유한 RPMI 1640에 DMSO에서 재구성된 플루오4-AM을 추가합니다.</li>
			<li>우물에서 166 μL의 매체를 제거합니다.</li>
			<li>RPMI 1640에 1.5 μM 플루오4-AM의 166 μL을 추가하여 B-27 보충제를 함유하여 37°C에서 1μM. 인큐베이션, 30분 동안 5% CO2 의 최종 웰 농도를 제공합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3.4.1 단계에서와 같이 2 개의 헤이즈를 수행합니다.</li>
		<li>우물에 B-27 보충제를 함유한 RPMI 1640의 166μL을 추가합니다.</li>
		<li>P200 파이펫 팁의 컷 팁을 사용하여 오르가노이드를 유리 바닥 페트리 접시(예: #1.5 고성능 커버글래스가 있는 8웰 챔버 커버 글래스)로 전달하여 100-200μL의 중간 크기로 전달합니다. 참고: 전체 오르가노이드 를 전송할 때 섹션 3.1을 참조하십시오.</li>
		<li>이미지 오르가노이드는 37 °C, 5 % CO2에서 온도 및 CO2 제어 챔버와 현미경 아래에 살고 있습니다.</li>
		<li>오르가노이드 전역의 다양한 위치에서 10-20s 비디오를 여러 번 기록하여 칼슘이 세포로 들어오고 나갈 때 형광 강도 수준이 증가하고 감소함을 보여 주습니다. 참고: 고해상도 레코딩의 경우 10fps 이상의 속도로 기록하는 것이 좋습니다. 50 fps를 권장합니다.</li>
		<li>관심 영역을 선택하고 시간이 지남에 따라 강도 수준을 측정하여 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ)를 사용하여 비디오를 분석합니다.</li>
		<li>ΔF/F0과 밀리초 및 플롯의 시간을 사용하여 강도 레코딩을 정규화합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li>
<li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11, 94(2020).</li>
<li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion%2C+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4(2020).</li>
<li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp%2FWnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140(2018).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283(2020).</li>
<li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li>
<li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li>
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<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003(2016).</li>
<li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142(2021).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
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<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li>
<li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li>
<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
<li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cardiac+cellular+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li>
<li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538(2019).</li>
<li>Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilbert%2C+SF+%22Developmental+Biology.+6th+edition%22">Developmental Biology. 6th edition</a>. , Sinauer Associates. Sunderland (MA). 591-610 (2000).</li>
<li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li>
<li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues%3A+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li>
</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

최근 인간 줄기세포 유래 심근세포 및 심장 기원의 다른 세포에서 의기유는 인간 심장 발달을 모델링하는 데 사용되어 왔으며, 26,27,28및 치료학적 29,30및 독성제를 선별하는 도구로 사용되었습니다31,32 . 여기서는 구현하기 쉽고 재현가능한 프로토콜을 보고하여 EB를 생성하고 매우 복잡한 hHSo로 분화합니다. 이 프로토콜은 hPSC 및 hESCs23<...

선천성 심장 결함 (CHDs)은 인간에 있는 선천적인 결함의 일반적인 모형이고 모든 살아있는 출생의 대략 1%에 영향을 미칩니다1,2,3. 대부분의 상황에서 CHD의 이유는 아직 알려지지 않았습니다. 발달하는 인간 심장과 밀접하게 유사한 실험실에서 인간 심장 모델을 만드는 능력은 대리 동물 모델보다는 인간에서 CHDs의 근본 원인을 직접 연구하는 중요한 단계를 구성합니다.
실험실에서 자란 조직 모델의 전형은 세포 조성 및 생리 기능에 대한 관심기관과 유사한 오르가노이드, 3D 세포 구조입니다. 오르가노이드는 종종 줄기 세포 또는 전구 세포에서 파생되며 성공적으로 뇌4,5, 신장6,7, 장8,9, lung10,11, liver12,13 및 췌장14,15와 같은 많은 장기를 모델링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. , 그냥 몇 가지 이름을 지정합니다. 최근 연구는 체외에서 심장 발달을 연구하기 위해 자기 조립 심장 오르가노이드를 만드는 타당성을 입증 등장했다. 이러한 모델은 마우스 배아 줄기 세포 (mESC)를 사용하여 초기 심장 발달을 모델링16,17 최대 대상반성 사양18 및 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)를 사용하여 다발성 층 심장 엔데데름 오르노이드19 및 매우 복잡한 세포 구성을 가진 챔버 심장 근막 20을 생성합니다.
이 논문은 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 매우 복잡한 hHOS를 생성하는 새로운 3 단계 WNT 변조 프로토콜을 제공합니다. 오가노이드는 96웰 플레이트에서 생성되어 쉽게 자동화할 수 있는 확장 가능한 고처리량 시스템을 생성합니다. 이 방법은 hPSC 골재를 생성하고 심근 및 심장 중구 형성, 제 1 및 두 번째 심장 필드 사양, 미상동맥 기관 형성 및 대상 동맥 사양을 포함한 심장 발생의 발달 단계를 유발하는 데 의존합니다. 분화 후, hHOs는 심장에서 발견 되는 모든 주요 세포 혈통을 포함, 잘 정의 된 내부 챔버, 심방 및 심실 챔버, 그리고 오르가노이드 에 걸쳐 혈관 네트워크. 이 매우 정교하고 재현 가능한 심장 오르가노이드 시스템은 심장 발달, 질병 및 약리학적 스크리닝의 연구에서 구조적, 기능적, 분자 및 전사 적 분석을 조사할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>항체</tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 마우스</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 마우스</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 당나귀 안티 마우스</td><td>Invitrogen</td><td>A-21203</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 당나귀 안티 마우스</td><td>Invitrogen</td><td>A-21207</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 당나귀 안티 염소</td><td>Invitrogen</td><td>A32849</td><td>1:200</td></tr><tr><td>HAND1</td><td>Abcam</td><td>ab196622</td><td>토끼; 1:200</td></tr><tr><td>HAND2</td><td>Abcam</td><td>ab200040</td><td>토끼; 1:200</td></tr><tr><td>NFAT2</td><td>Abcam</td><td>ab25916</td><td>토끼; 1:100</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>DSHB</td><td>P2B1</td><td>토끼; 1:50</td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td>마우스; 1:200</td></tr><tr><td>THY1</td><td>Abcam</td><td>ab133350</td><td>토끼; 1:200</td></tr><tr><td>TJP1</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-19090</td><td>염소; 1:250</td></tr><tr><td>VIM</td><td>Abcam</td><td>ab11256</td><td>염소; 1:250</td></tr><tr><td>WT1</td><td>Abcam</td><td>ab89901</td><td>토끼; 1:200</td></tr><tr><td>배지 및 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>NC9464543</td><td>세포 해리 시약</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338AC010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제(인슐린 제외)</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td>인슐린이 없는 세포 배양 보충제</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>세포 배양 보충제</td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Bioworld</td><td>50253966</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck</td><td>442310</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-과당</td><td>밀리포어 시그마</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>밀리포어 시그마</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex 배지 키트</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>만능 줄기세포(PSC) 배지 1% 함유 페니실린-스트렙토마이신</td></tr><tr><td>플루오4-AM</td><td>인비트로젠</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>밀리포어 시그마</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>밀리포어 시그마</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>마트리겔 GFR</td><td>코닝</td><td>CB40230</td><td>기저막 세포외 기질(BM-ECM)</td></tr><tr><td>노멀 당나귀 혈청</td><td>밀리포어 시그마</td><td>S30-100mL</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>MP Biomedicals</td><td>IC15014601</td><td>PBS 완충액에 용해된 분말 &ndash; 4%</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액 (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Polybead</td><td>Microspheres Polysciences, Inc.</td>에서 사용<td>73155</td><td>90 &마이크로; m</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>줄기세포</td><td>NC0729236</td>기술 <td>hPSC용 해리 시약,</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1045</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Vibrance Antifade </td><td></td><td></td> WNT-C59 Selleck NC0710557 기타 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브를 H170010 <td></td>매체 벡터 실험실 장착</tr><tr><td></td><td></td><td></td> Fisher Scientific 02682002 15 mL 팔콘 튜브 Fisher Scientific 1495970C 2 mL 극저온 바이알 Corning 13-700-500 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 시약 저장용기</td><td>Fisherbrand</td><td>13681502</td><td></td></tr><tr><td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td><td>Corning</td><td>0720083</td><td></td></tr><tr><td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td><td>Costar</td><td>07201680</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>06-666</td><td>실험실 물티슈</td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>24 x 50 mm No. 1.5</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Moxi 세포 카운터</td><td>Orflo Technologies</td><td>&nbsp; MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z 셀 카운트 카세트 &ndash; 타입 M</td><td>Orflo&nbsp; 기술</td><td>MXC001</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>FBE1200300</td><td>30-300 &마이크로; L</td></tr><tr><td>올림푸스 cellVivo</td><td>Olympus</td><td></td><td>Caclium 이미징, Imagej</td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1 원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004261</td><td></td></tr><tr><td>써멀 믹서</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-687-717</td><td></td></tr><tr><td>탑 코트 네일 Varish</td><td>Seche Vite</td><td></td><td>모든 슈퍼마켓에서 구입할 수 있습니다</td>.</tr></tbody></table>

다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

건강과 질병에서 인간의 심장 발달을 연구하는 능력은 체외에서 인간의 심장의 복잡성을 모델링하는 능력에 의해 매우 제한됩니다. 오르가노이드 및 장기 온 칩과 같은 생체 내 표현형에서 복합체를 모델링할 수 있는 보다 효율적인 장기 와 같은 플랫폼을 개발하면 인간의 심장 발달과 질병을 연구하는 능력이 향상됩니다. 이 논문은 인간 만능 줄기 세포를 사용하여 자기 조직에 의해 매우 복잡한 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 생성하고 작은 분자 억제제를 사용하여 단계별 발달 경로 활성화를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 배아 체(EB)는 둥근 바닥, 초저 부착 우물이 있는 96웰 플레이트에서 생성되어 개별화된 구조의 현탁액 배양을 용이하게 합니다.
EB는 심장 중피 운명을 유도하기 위한 초기 Wnt 통로 활성화, 결정적인 심장 혈통을 만들기 위한 Wnt 억제의 두 번째 단계, 그리고 미원성 장기 조직을 유도하는 세 번째 Wnt 활성화 단계를 포함하는 3단계 Wnt 신호 변조 전략에 의해 hHOs로 분화를 거칩니다. 96웰 형식으로 수행되는 이 단계는 매우 효율적이고 재현 가능하며 실행당 다량의 오르가노이드를 생성합니다. 3일부터 11일까지 11일째에 면역형광 영상에 의한 분석은 심방 및 심실 심근세포의 영역을 가진 심근 조직뿐만 아니라 내시경 조직으로 늘어선 내부 챔버를 포함하여 15일째에 hHOs 내부의 첫 번째 및 두 번째 심장 장 사양 및 매우 복잡한 조직을 보여줍니다. 오르가노이드는 또한 구조 전반에 걸쳐 복잡한 혈관 네트워크와 상피 조직의 외부 안대기를 나타낸다. 기능적 관점에서 hHSo는 플루오-4 라이브 이미징에 의해 결정된 정상 칼슘 활성을 견고하게 이길 수 있습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 인간 장기 같이 심장 조직에 있는 체외 연구를 위한 단단한 플랫폼을 구성합니다.

시험관 내 자가 조직 hHO를 달성하기 위해, 우리는 이전에 Wnt 통로 변조기를 사용하여 심근 세포21 및 상복부 세포의 2D 단층 분화에 대해 설명된 2D 단층 분화 프로토콜을 수정하고 결합하고 성장 인자 BMP4 및 Activin A. 96 웰 플레이트 EB 및 hHOi 프로토콜을 사용하여 여기에 설명된 피규어 1을 사용하여 설명된 피규어 1 , Wnt 통로 활성제 CHIR99021의 농도 및 노출 지속 시간은 인간 PsC에서 파생된 매우 재현 가능하고 복잡한 hHSo를 산출하도록 최적화되었습니다.
EB는 0일째에 차별화를 시작하기 전에 24시간 이후에 중간 변경으로 48h에 대한 배양이 허용되었습니다. 0일째에, EB는 빛 ...

여기서, 우리는 자기 조직에 의하여 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 발달적으로 관련있는 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 만드는 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 발달 단서의 순차적 활성화에 의존하고 매우 복잡하고 기능적으로 관련된 인간 심장 조직을 생성합니다.

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

이 프로토콜을 사용하면 세포주 전체에서 재현 가능한 간단한 비용 효율적인 방법으로 발달하는 인간의 심장과 밀접하게 유사한 복잡한 3D 구조를 만들 수 있습니다. 그것은 분화의 3 단계를 가진 단일 프로토콜로 구성, 이는 심장의 모든 세포 유형을 초래, 챔버와 혈관 네트워크를 포함. 이 기술은 우리가 인간의 심장 혈관 질병의 넓은 범위를 모델링하고 효과적인 약리학적 치료를 선별 할 수 있습니다.디자인의 높은 처리량 특성 덕분에. 이 방법은 일반적으로 그와 관련된 질병뿐만 아니라 개발 인간의 심장을 조사하는 데 유용합니다. 그 중 하나는 선천성 심장 결함입니다.이 프로토콜에는 기본적인 세포 배양 기술이 필요합니다. 우리는 오가노이드의 세심하고 섬세한 피펫팅뿐만 아니라 부드러운 취급을 권장합니다. 분화 이틀 전에 배아 체 나 EB를 만드는 것으로 시작합니다.DBPS로 서브컨블아웃 HPSC를 10초 이상 세척합니다. 그런 다음 DPBS를 흡인합니다. 실온 ACUTA의 1 밀리리터를 추가하고 현미경으로 확인하는 동안 분리를 유도하기 위해 3~5분 동안 매 분당 약 5회 접시를 부드럽게 누릅니다.그런 다음 PSC 배지와 티아스 아빈 또는 티아스 1 밀리리터를 추가하여 반응을 중지합니다. 파이펫은 미디어를 우물에서 위아래로, 2~3회 하여 단일 세포 현탁액을 생성하고 세포를 수집한다. 그런 다음 단일 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기고 300회 G.에서 5분간 회전하여 슈퍼나탈을 흡인하고 PSC 배지 및 티아스 1밀리리터로 세포를 다시 소비한다.DPBS의 세포를 희석시. 세포 카운터 또는 헤모 낭포계를 사용하여 세포를 계산하고 밀리리터 당 100, 000 세포의 농도로 티아스와 PSC 배지에서 세포를 희석. 희석 된 셀 현탁액 100 마이크로 리터를 둥근 바닥 초저 부착 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.플레이트를 3분 동안 100배G로 원심분리하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후 조심스럽게 각 우물에서 50 마이크로리터의 마이크로리터를 제거하고 200 개의 신선한 PSC 매체를 추가하여 섭씨 37도까지 따뜻하게 하여 웰당 250 마이크로리터의 부피를 제공합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.각 우물의 한쪽에서 166 마이크로리터 또는 매질의 2/3을 제거하고, 인슐린 무료 B27 보충제를 함유한 RPMI 1640의 마이크로리터 166편, 990211 6개, 체형 유전자 단백질 의 밀리리터 당 0.875 나노그램, 액티비틴 A.Incubate 의 밀리리터 당 1.5 나노그램을 24%의 섭씨 57%에서 제거합니다. 후 24 6 각 우물의 한쪽에서 매체의 마이크로 리터166 마이크로 리터를 추가 하 고 추가 166 신선한 RPMI의 마이크로 리터 1640 인슐린 무료 B27 보충. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양하세요.둘째 날에 심장 중피 사양을 유도하기 위해 각 우물에서 166 마이크로리터를 제거하고 RPMI 1640의 166 마이크로리터를 추가하여 인슐린 무료 B27 보충제와 3개의 마이크로몰러 Wnt-C59를 함유하고 48시간 동안 배양을 계속합니다. 4일째에, 각 우물에서 166 마이크로리터의 마이크로리터를 제거하고 인슐린 무료 B27 보충제로 신선한 RPMI 1640의 166 마이크로리터를 추가한 다음, 또 다른 48시간을 배양합니다. 6일째에는 각 우물에서 166마이크로리터의 미디온을 제거하고 B27 보충제로 RPMI 1640의 마이크로리터 166마이크로리터를 추가합니다.이 모든 후속 미디어 변화에 대 한, 사용 B27 인슐린과 보충, 다른 24 시간 동안 배양. 7일째에, 세포 배양은 프로 상근 분화를 위한 준비가 되어 있습니다. 각 우물에서 166 마이크로리터의 매체를 제거하고 B27 보충제와 3개의 마이크로몰러 응원 99021을 함유한 신선한 RPMI 1640의 마이크로리터 166마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 1 시간 동안 인큐베이션에서 1 시간 동안 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 각 우물의 한쪽에서 166 마이크로 리터를 제거하고 B27 보충제를 함유 한 신선한 RPMI 1640의 마이크로 리터 166 마이크로 리터를 추가하여 다른 48 시간 동안 인큐베이션을 계속합니다. 수집 될 때까지 48 시간마다이 과정을 반복하십시오. 오르가노이드는 15일째에 분석 및 실험을 통해 전체 오르가노이드를 옮기고, P200 파이펫의 끝을 약 2~3mm의 직경으로 개구부에서 5~10mm 로 자른다.파이펫 플런저를 누르고 오간로이드와 잘 둥근 바닥에 팁을 수직으로 삽입합니다. 오르가노이드를 수집하고 대상 대상으로 전송할 수 있을 만큼 약 100~200마이크로리터의 매체를 차지합니다. 분화 EBS가 흑인 구형 덩어리로 나타나기 전에 분화 과정은 정확히 24 시간 동안 Wnt 통로 활성화 및 성장 인자 추가로 0 일째에 시작됩니다.또한 2일째에 Wnt C59의 편집은 오르가노이드를 약 200 마이크로미터에서 최대 1mm로 확대시키는 결과를 낳습니다. 인간 심장 오르가노이드는 6일째와 100%의 오르가노이드가 10일째에 눈에 보이는 박동을 보였기 때문에 일찍 부터 뛰기 시작했습니다. 7일째 의 높은 배율 이미지는 대부분의 손 발현 세포가 원점에서 심근세포이고 손 2개는 제2 하트필드, 선조 세포로부터 비심근세포였다는 것을 밝혔다.손 1과 손 2모두에 대한 RNA 전사체는 RNA 시퀀싱 데이터에서 3일째부터 발현되었다. FHF 마커는 3일과 11일 동안 높게 발현되었으며, SF 마커는 13일 이후 더 높게 표현되었다. 면역형광 얼룩은 인간의 심장을 구성하는 다양한 인간 심장 세포 형 혈통의 존재를 밝혔다.심근 및 상복부 조직, 내막 세포, 내피 세포 및 심장 섬유아세포와 같은. 상기 세포 계보를 발현하는 마커는 RNA SAC 유전자 발현 프로파일에서도 관찰되었다. 전체 오르가노이드에서 개별 세포의 살아있는 칼슘 화상 진찰은 오르가노이드의 전기 생리학적 기능을 측정하는 데 사용되었다.플루오-4 형광 강도는 정기적인 작용 잠재력을 드러내는 세포에서 칼슘 입구 출구로 인해 시간이 지남에 따라 다양합니다. 오르가노이드의 높은 배율 영역에 걸쳐 칼슘 강도를 보여주는 열지도, 칼슘 과도 및 개별 세포로 인한 증가 강도를 보여줍니다. 이 프로토콜을 시도할 때, EB와 후속 오르가노이드가 플레이트 의 바닥에 부착되지 않으며 세심한 미디어 변경이 필요한 미디어 외에도 제거와 함께 움직일 것입니다.오르가노이드는 성숙 기술에 도입된 장기간 배양또는 기계적 또는 전기 컨디셔닝과 같은 외부 자극, 독소와 같은 스트레스 요인에 노출될 수 있습니다. 이 기술은 연구에서 달리 접근 할 수없는 인간의 태아 심장 발달 단계에 대한 액세스를 허용, 심장 발달과 질병 병인학에 대한 새로운 통찰력의 길을 포장.

generating-self-assembling-human-heart-organoids-derived-from

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 전뇌형 오가노이드를 생성하는 과정을 간략하게 설명하며, 줄기 세포 응집체에서 뇌 피질을 모방하고 다양한 뉴런 유형으로 분화하는 복잡한 구조로 진행되는 과정을 보여줍니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 전뇌형 대뇌 오가노이드 생성

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

여기서 우리는 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 신장 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 주 이내에 신장 오가노이드를 생성합니다. 생성된 신장 오가노이드는 병렬 약물 테스트 접근법을 위해 대규모 스피너 플라스크 또는 다중 웰 자기 교반 플레이트에서 배양될 수 있다.

인간 다능성 줄기 세포로부터 신장 오가노이드를 생성하는 단순화된 방법

이 프로토콜의 목표는 심장 조직 공학, 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위해 심장 섬유아세포(CFs)와 공동 배양된 줄기 세포 유래 심근세포(CFs)로 구성된 고도로 정렬된 인간 심장 조직의 3차원(3D) 미세유체 모델의 개발을 설명하고 시연하는 것이다.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

여기에 제시된 것은 고처리량, 다차원 형식으로 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 스페로이드(CS)의 생성 및 냉동 보존을 위한 일련의 프로토콜입니다. 이 3차원 모델은 질병 모델링, 고처리량 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼 역할을 하며 냉동 보존 후에도 기능을 유지합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

이 프로토콜은 인간 만능 및 유도 만능 줄기 세포로부터 자가 조직화 혈관의 생성을 설명합니다. 이러한 혈관 네트워크는 혈관주위세포, 평활근 액틴 및 연속적인 기저막으로 둘러싸인 광범위하고 연결된 내피 네트워크를 나타냅니다.

만능줄기세포(Pluripotent Stem Cells)에서 인간 혈관 오가노이드(Human Blood Vessel Organoids)의 생성

이 프로토콜은 인간 만능 줄기세포를 사용하여 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제시합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

자가 조립식 인간 심장 오가노이드(hCOs)는 인간 심장 발달과 질병을 모델링하기 위한 신흥 시스템입니다. 여기서는 저산소 재산소화를 통한 hCO의 생성 및 손상 방법론과 손상 후 예상되는 조직학적 및 기능적 결과에 대한 세부 정보를 제공합니다.

자가 조립 인간 심장 세포에서의 저산소증-재산소화 손상 모델

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

배우세요 다능성 줄기 세포를 이용한 인간 심장 오르가노이드 생성 방법으로 심장 발달 및 선천성 심장 결함 연구에 활용하세요. 이 기술은 약물 스크리닝에도 적합합니다.

다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성

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