Name: 마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: 배우세요 마우스 골수에서 수지상 세포를 분리하고 배양하는 경제적이고 효율적인 방법을. GM-CSF/IL-4를 사용하여 7일간 배양하면 고순도의 면역 세포를 얻을 수 있습니다.

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이 작업은 천진 과학 기술 계획 프로그램 (20JCQNJC00550), 천진 보건 과학 기술 프로젝트 (TJWJ202021QN033 및 TJWJ202021QN034)의 지원을 받았다.

모든 절차는 난징 의과 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 골수의 분리 및 BM 세포의 준비
<ol><li>CO2 질식을 통해 C57BL/6 마우스(18-22 g, 6-8주령)를 희생시킨다. 마우스 수술대에서 마우스를 고정합니다. 표면을 70 % 에탄올로 소독하십시오.</li>
	<li>다리의 피부를 잘라 근육과 대퇴 동맥을 노출시킵니다. 두 개의 집게를 사용하여 대퇴 동맥을 클램프하고 찢어 낸 다음 근위 끝을 복부쪽으로 당깁니다. 참고 : 대퇴 동맥을 직접 자르지 마십시오. 그렇지 않으면 과도한 출혈을 일으키고 시야를 오염시킵니다.</li>
	<li>대퇴골 주변의 모든 근육을 자르십시오.</li>
	<li>고관절 탈구 소리가 들리고 대퇴골 머리 탈출증이 보일 때까지 마우스의 하지를 바깥쪽으로 천천히 뻗습니다.</li>
	<li>대퇴골 머리 안쪽을 따라 가위를 사용하여 하지를 몸에서 분리하십시오.</li>
	<li>무릎 관절 끝에서 뒷다리를 잘라 자유롭고 완전한 대퇴골을 얻으십시오.</li>
	<li>거즈를 사용하여 대퇴골에 붙어있는 근육을 제거하십시오. 참고: 근육을 직접 찢지 마십시오. 생쥐의 대퇴골은 섬세하며 무결성을 유지해야합니다.</li>
	<li>대퇴골을 75 % 알코올에 2-5 분 동안 담그십시오.</li>
</ol>2. BMDC의 유도 배양
<ol><li>잔류 알코올을 PBS로 헹구십시오. 지혈 포셉을 사용하여 대퇴골의 중간 및 하단 부분을 고정하고 다른 세트는 대퇴골의 하단을 고정시킵니다. 지혈 포셉은 대퇴골에 옆으로 적용되고, 대퇴골은 epiphyseal 라인에서 분리됩니다. 참고 : epiphyseal 라인은 대퇴골 골절까지 쉽게 볼 수 없습니다. 이 단계와 다음 단계는 모두 멸균 환경에서 수행됩니다.</li>
	<li>1 mL 주사기 (바늘 : 0.6 mm x 25 mm)를 사용하여 epiphyseal 라인 브레이크에서 골수강을 관통하고 바늘을 회전시켜 대퇴골 머리와 골수강을 관통하십시오. 맥박을 내고 뼈가 하얗게 될 때까지 GM-CSF/IL-4가 들어있는 완전한 배지 1mL를 사용하여 골수강을 플러시합니다. 참고: 완전 배양 배지: 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 55 μM β-메르캅토에탄올, 10 ng/mL GM-CSF 및 10 ng/mL IL-4.</li>
	<li>모든 세포를 24 mL의 완전한 배양 배지 (~ 5 x 105 세포 / mL)에 재현탁하십시오. 혼합 후, 모든 배지를 4 mL/웰로 6-웰 플레이트 상에 시딩한 다음, 2일 동안 5%CO2 와 함께 37°C에서 인큐베이션하였다. 참고 : 적혈구를 용해시킬 필요는 없습니다.</li>
	<li>2 일 후에 모든 배지를 GM-CSF / IL-47을 함유 한 배지로 교체하십시오. 네 번째, 여섯 번째 및 여덟 번째 날에 배지의 절반을 10 ng / mL GM-CSF / IL-4를 포함하는 완전한 배지로 교체하십시오. 참고: 이 단계에서는 적혈구 및 림프구와 같은 부유 세포가 제거됩니다.</li>
	<li>세포 성장을 기록하기 위해 매일 사진을 찍으십시오. 여섯 번째 날부터 시작하여 하루에 한 웰의 세포를 수확하여 세포 수를 계수하고 CD11c, CD80 및 MHC II 발현 6,7을 검출한다.</li>
</ol>3. CD11c, CD80, 및 MHC II의 발현의 유세포 검출
<ol><li>DCs를 PBS로 세척한 후, 1 x 106 세포를 FACS 완충액 100 μL에 재현탁시키고, 0.5 μg의 항-마우스 CD16/32 항체를 첨가하고, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션하여 비특이적 항원 부위를 차단한다.</li>
	<li>1 μg의 Percp/cy5.5-CD11c, 0.5 μg의 PE-CD80 및 0.04 μg의 APC-MHC II 항체를 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>4°C에서 3분 동안 1,000 x g에서 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 4% 파라포름알데히드 1 mL를 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 고정하고, FACS 완충액 300 μL에 재현탁시킨다.</li>
	<li>유세포 분석기를 수행합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li>
<li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786(2021).</li>
<li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+ontogeny%3A+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited%3A+both+CD8alpha%28-%29+and+CD8alpha%28%2B%29+dendritic+cells+are+generated+from+CD4%28low%29+lymphoid-committed+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).</li>
<li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%3A+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li>
<li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li>
<li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li>
<li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li>
<li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate%3A+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li>
</ol>

모든 저자는 이해 상충이 없으며 공개 할 것이 없다고 선언합니다.

인간과 마우스는 고전적 DC (cDC1 및 cDC2를 포함한 cDC) 혈장 세포질 세포 ID (pDCs) 및 단핵구 유래 DC (MoDCs) 9,10,11을 포함하여 서로 다른 DC 서브 세트를 갖는다. cDC1s는 세포내 병원체 및 암에 대한 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 조절하고, cDC2는 세포외 병원체, 기생충 및 알레르겐12에 대한 면역 반응을 조절한다는 것이 일반적으로 인정된다. 상당한 수의 DC는 GM-CSF 및 IL-4 6,13,14의 존재하에 마우스에서 BM 전구 세포 로부터 시험관내에서 생산될 수 있다. DC의 ...

Dendritic 세포 (DCs)는 나이브 T 세포를 활성화시키고 감염성 질환, 알레르기 질환 및 종양 세포 1,2,3에 대한 특이적 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 유도하는 가장 강력한 항원 제시 세포 (APCs)입니다. DC는 선천적 면역과 적응 면역 사이의 주요 연결 고리이며 면역 방어 및 면역 관용의 유지에 필수적인 역할을합니다. 지난 40 년 동안 많은 연구자들은 DC의 하위 집합과 염증과 면역에서의 기능을 정의하려고 노력해 왔습니다. 이러한 연구에 따르면, DC는 골수 세포에서 골수성 및 림프계 혈통을 따라 발달합니다. 종양 백신은 최근 몇 년 동안 중요한 이정표를 얻었으며 유망한 미래를 가지고 있습니다. 기계적으로 종양 백신은 면역 반응을 조절하고 종양 항원을 사용하여 세포독성 T 림프구를 활성화시켜 종양 성장을 방지합니다. DC를 기반으로 한 백신은 종양 면역 요법에서 중요한 역할을하며 가장 유망한 항 종양 요법 1,4 중 하나로 확인되었습니다. 또한, DC는 새로운 분자 표적 약물 및 면역 체크포인트 억제제5의 시험에 널리 사용되어 왔다.
연구자들은 DC의 역할을 더 연구하기 위해 많은 수의 고순도 DC가 시급히 필요합니다. 그러나 DC는 다양한 조직과 혈액에서 드물며 인간과 동물의 혈액 세포의 1 % 만 차지합니다. 골수 수지상 세포 (BMDC)의 시험관내 배양은 다량의 DC 세포를 얻기 위한 중요한 방법이다. 한편, 골수에서 DC를 생성하기위한 Lutz 프로토콜은 연구자6에 의해 널리 사용되었습니다. 프로토콜은 DC 세포를 얻는 데 효과적이지만, 고농도의 사이토 카인의 첨가와 적혈구의 용해를 포함하는 복잡하고 비쌉니다.
본 연구에서, 우리는 마우스 골수(BM)로부터 거의 모든 골수 세포를 단리하고 GM-CSF 및 IL-4의 더 낮은 농도로 시험관 내에서 배양한 후 7-9일 후에 BMDC로의 분화를 유도하는 방법을 보고하였다. 이 절차는 거의 모든 골수 세포를 수확하고 완전한 배지에 현탁하는 데 10 분 밖에 걸리지 않습니다. 간단히 말해서, 우리는이 연구에서 BMDC에 대한 효율적이고 비용 효율적인 배양 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>APC-MHC II</td><td>Biolegend</td><td>116417</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD80</td><td>Biolegend</td><td>104707</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>Percp/cy5.5-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117327</td><td></td></tr><tr><td>PRMI-1640</td><td>Thermo</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 GM-CSF</td><td>Solarbio</td><td>P00184</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IL-4</td><td>Solarbio</td><td>P00196</td><td></td></tr><tr><td>TruStain Fc PLUS (안티 마우스 CD16/32) 항체</td><td>Biolegend</td><td>156603</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

수지상 세포 (DCs)에 대한 수요는 면역학 연구가 진행됨에 따라 점차 증가하고 있습니다. 그러나 DC는 모든 조직에서 드뭅니다. DC를 분리하는 전통적인 방법은 주로 과립구 - 대식세포 콜로니 자극 인자 / 인터루킨 -4 (GM-CSF / IL-4)의 다량 (>10 ng / mL)을 주입하여 골수 (BM) 분화를 유도하여 절차가 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 이 프로토콜에서, 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 배지에서 배양된 모든 BM 세포를 사용하여, 3-4 반배양 교환 후, 마우스(2개의 대퇴골) 당 최대 2.7 x 107개의 CD11c+ 세포(DCs)를 80%-95%의 순도로 수확하였다. 배양 10일 후, CD11c, CD80, 및 MHC II의 발현은 증가한 반면, 세포의 수는 감소하였다. 세포의 수는 배양 7일 후에 최고조에 달했다. 더욱이, 이 방법은 모든 골수 세포를 수확하는 데 10분 밖에 걸리지 않았으며, 배양 1주일 후에 많은 수의 DC가 얻어졌다.

1 x 10 7-1.7 x 107 세포를 두 개의 대퇴골로부터 추출하고, 6-웰 플레이트에 심기 전에 24 mL의 배지에 재현탁시켰다 (도 1A). 2일 후, 비부착성 세포는 배양 배지를 완전히 변경하여 제거하였다. 배지를 변경하기 전에, 상당한 수의 현탁된 세포가 관찰되었다(도 1B). 배양 3일 후, 작은 세포 콜로니가 형성되기 시작했다. 여섯째 날, 식민지의 크기와 수가 크게 증가했다. 일곱째 날, 세포 수는 최고조에 달했고(22 x 10 6-27 x 106) 점차 떨어졌다(그림 2A). DC 세포의 표면은 더 긴 슈도포디아로 거칠어졌고, 전형적인 성숙한 DC 세포 형태를 나타내었다(도 2B). 유세포 분석 결과, 총 세포에 대한 CD...

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 프로토콜. 동물 과목과 관련된 절차는 난징 의과 대학의 기관 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.One.Introduction. 종양 면역 연구의 증가와 함께, DC 세포에 대한 수요는 점차 증가하고 있습니다.그러나 DC는 모든 조직에서 드뭅니다. 주로 골수를 DC로 분화시키는 전통적인 방법은 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 2. 골수의 분리 및 BM 세포의 준비 우리는 마우스를 희생시키고 마우스 수술대에 고정시킵니다.왼쪽 노출 된 근육과 대퇴 동맥의 피부를 자르십시오. 대퇴 동맥을 직접 자르지 마십시오. 그렇지 않으면 심한 출혈을 일으키고 시야를 오염시킵니다.대퇴골 주변의 모든 근육을 자르십시오. 대퇴골 머리가 탈출 할 때까지 마우스의 하지를 천천히 바깥쪽으로 뻗어 관찰 할 수 있습니다. 몸에서 하지를 분리하십시오.자유롭고 완전한 대퇴골을 얻기 위해 뒷다리를 자르십시오. 거즈를 사용하여 근육을 제거하십시오. 근육을 직접 찢지 마십시오.생쥐의 대퇴골은 깨지기 쉽습니다. 대퇴골을 75 % 알코올에 두 분에서 5 분 동안 넣으십시오. 3. BMDC의 주입 배양은 잔류 알코올을 PBS로 헹구었다.지혈 포셉으로 대퇴골의 중간 및 하단 부분을 클램프하고 대퇴골의 하단 끝을 다른 지혈 포셉으로 클램프하십시오. 지혈 포셉은 문자 그대로 대퇴골에 적용되고 대퇴골은 epiphyseal 라인에서 부서집니다. 한 ml 주사기를 사용하여 epiphyseal 라인에서 골수강을 관통하십시오.완전한 매체를 사용하여 뼈가 흰색이 될 때까지 골수강을 플러시하십시오. 플러싱 유체를 수집합니다. GM CSF/IL-4를 함유하는 완전한 배지를 24ml로 보충하고, 웰당 4ml로 6-웰 플레이트에 시드한다. 네 가지.결과.이틀 후, GM-CSF/IL-4를 함유하는 모든 배지를 교체한다. 절반은 네 번째와 여섯 번째와 여덟 번째 날에 GM-CSF / IL-4를 포함하는 완전한 배지를 대체했습니다. 세포의 수는 일곱째 날에 절정에 도달했다가 점차 감소했다.DC 세포는 전형적인 성숙 DC 세포 형태를 나타내는 다수의 시냅스를 형성하였다. 유동 서브 메트릭 분석은 CD11c의 비율이 6일째 날에 71%를 부과하고, 넓은 비율이 10일째에 96.1%로 증가한다는 것을 보여준다. CD11c, CD80 및 MSC2의 발현은, 배양 시간 증가에 따라 점차적으로 증가하였다. 다섯.결론.요컨대, 우리는 쥐로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하기위한 경제적이고 효율적인 프로토콜을 수립했으며, 골수 세포를 분리하는 데 10 분 밖에 걸리지 않습니다. 많은 수의 고순도 DCs를 ml 당 10ng, GM-CSF 및 IL-4로 6 내지 7일 배양한 후에 수확하였다.

economical-efficient-protocol-for-isolating-culturing-bone-marrow

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

이 비디오는 성체 쥐의 골수에서 수지상 세포(T 세포를 활성화하는 핵심 항원 제시 세포)를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

골수 유래 수지상 세포 생성: 마우스 골수에서 수지상 세포를 생성하는 방법

우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

여기에서는 번역 응용을 위해 이질적인 골수에서 다량의 쥐 단핵구를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 다른 방법과 비교했을 때, 이 새로운 방법은 높은 구배 자기 세포 분리(MACS)와 같은 값비싼 방법을 피함으로써 희생되는 동물의 수를 줄이고 비용을 절감하는 데 도움이 됩니다.

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

여기에서는 체외 배양 조건, 격리 및 Echinococcus granulosus의 세포외 소포체(EV) 생성 증가에 대해 설명합니다. 소형 EV는 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경이 특징이었습니다. 골수 유래 수지상 세포의 흡수와 표현형 조절은 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 연구되었습니다.

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

우리는 세포 성숙을 유발하지 않고 플라스미드 DNA 나 siRNA 중과 기본 인간 단핵구 파생 돌기 세포를 transfecting의 효율적인 방법으로서 최적화된 높은 처리량 nucleofection 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 타겟 유전자 mRNA와 단백질 수준 모두에서 릭 - 전의 성공적인 siRNA의 입을 대한 증거를 제공합니다.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

배우세요 마우스 골수에서 수지상 세포를 분리하고 배양하는 경제적이고 효율적인 방법을. GM-CSF/IL-4를 사용하여 7일간 배양하면 고순도의 면역 세포를 얻을 수 있습니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

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