Name: 차세대 염기서열분석을 위한 뮤린 망막 내피 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 배우세요 생후 쥐 망막 내피 세포 분리법으로 차세대 염기서열분석에 적합한 고수율·고순도 세포를 확보하는 방법입니다. 혈관 발달의 새로운 메커니즘 규명에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis 및 University of Virginia Genome Analysis and Technology Core에 감사드립니다. 이 연구는 NUC (T32 HL007224, T32 HL007284), SC (T32 HL007284), KW (R01 HL142650) 및 K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765)에 대한 NIH 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

예일 대학교와 버지니아 대학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회는이 프로토콜에 나열된 모든 동물 실험을 승인했습니다.
1. 망막 분리를 위한 마우스 눈 획득
<ol><li>1x 얼음처럼 차가운 PBS를 준비하고 48웰 플레이트의 각 웰에 500μL를 추가합니다.</li>
	<li>승인된 기관 지침에 따라 출생 후 6일(P6)에 신생아 마우스를 안락사시킵니다. 이 실험을 위해, 약 4-8 신생아 마우스의 새끼는 호흡 정지 후 적어도 3 분 동안 이소 플루 란 흡입을 통해 P6에서 안락사 된 후 참수된다.</li>
	<li>각 마우스에서 눈을 제거하십시오. 해부 가위를 사용하여 눈꺼풀에 수직으로 잘라 눈 위의 피부와 막을 잘라냅니다. 그런 다음 집게를 사용하여 눈 위와 아래를 부드럽게 눌러 눈이 소켓에서 나오도록 합니다.<ol><li>집게로 눈 밑을 조심스럽게 꼬집고 눈을 붙여있는 시신경을 자릅니다. 그런 다음 수확이 완료될 때까지 준비된 1x 얼음처럼 차가운 PBS의 48웰 플레이트에 각 눈을 놓습니다. 참고: 마우스당 하나의 웰을 사용하고 동일한 웰에 있는 단일 마우스의 두 눈을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 마우스 망막 조직 분리
<ol><li>바닥에 해부 패드가 늘어선 페트리 접시에 500μL의 얼음처럼 차가운 PBS 1개를 채워 눈을 담그고 4.0배 배율로 설정된 해부 현미경 아래에 놓습니다.<ol><li>눈을 손상시키지 않도록 넓은 팁이있는 이송 피펫을 사용하여 해부 패드에 눈을 매달아 놓습니다. 알림: 눈이 PBS로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>두 개의 미세 해부 집게를 사용하여 안정화를 위해 집게 중 하나로 시신경을 잡고 두 번째 집게로 각막과 공막이 연결되는 전방을 통해 구멍을 뚫습니다 (그림 1B). 각막 주위의 약 75 %를 원으로 구멍을 뚫습니다.<ol><li>집게 중 하나로 시신경을 유지하면서 두 번째 집게를 사용하여 망막 조직에서 공막을 부드럽게 찢습니다.</li>
		<li>위와 같이 두 번째 집게를 사용하여 망막 조직의 유리체를 부드럽게 찢습니다.</li>
		<li>다시, 두 번째 집게를 사용하여 유리체를 제거 할 때 벗겨지지 않은 렌즈와 히알로이드 신경총 혈관을 부드럽게 제거하십시오. 이렇게하려면 망막에 거의 닿을 때까지 열린 집게로 망막에 손을 뻗고 집게를 닫아 렌즈와 히알로이드 신경총 혈관을 잡고 망막에서 집게를 빼냅니다. 이것은 모든 혈관이 제거 될 때까지 반복 될 수 있습니다. 참고: 히알로이드 신경총은 명확하고 웹과 같은 구조와 유사합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2mL 마이크로 원심분리 튜브에 500μL의 1x 얼음처럼 차가운 PBS를 채우고 망막을 튜브에 넣습니다. 계속 진행하기 전에 눈에서 모든 망막을 분리하고 얼음처럼 차가운 PBS에 넣으십시오. 참고: 마우스당 하나의 튜브를 사용하고 동일한 마우스의 망막 두 개가 튜브를 공유합니다. 망막 조직이 찢어진 경우 여러 조각으로 옮깁니다. 쥐의 깔짚에 대한 망막 조직 해부의 총 시간은 안락사로 시작하여 최종 망막 조직 분리로 끝나는 15-60 분이 소요됩니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63133/63133fig01.jpg"> 그림 1: 격리 프로토콜 개요. (A) 각 단계에 대한 예상 시간이 포함된 분리 타임라인의 개략도: 망막 조직 분리, 분해, 항체 염색, FACS 및 세포 생존율 창. (B) 번호가 매겨진 해부 단계와 함께 눈에서 망막 조직을 분리하기위한 단계별 가이드 : 1) 각막 관통, 2) 각막 파열, 3) 눈물 공막, 4) 망막에서 공막 제거, 5) 망막에서 공막 및 연결 조직 제거, 6) 망막에서 유리체 및 유리체 혈관 제거. (C) 다양한 소화 단계 동안 망막 조직의 대표 이미지 : 사전 소화, 사후 소화, 펠렛 (검은 색 화살표는 망막 조직 또는 세포 펠릿을 강조 표시). Chavkin et al.의 허가를 받아 재출판 S. Karger AG, Basel17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63133/63133fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 망막 조직을 단일 세포 현탁액으로 소화
<ol><li>분리된 망막 2개마다 500μL 분해 용액을 준비합니다. FBS와 콜라게나제 유형 II를 DMEM에 추가하여 최종 농도 10% FBS 및 1mg/mL 콜라게나제 유형 II에 추가합니다. 혼합하고 수조를 사용하여 용액을 37°C로 가온한다.</li>
	<li>조심스럽게 피펫팅하여 2mL 미세 원심분리 튜브에서 과도한 PBS를 제거합니다. 망막 조직을 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 PBS를 각 튜브에 약 100μL씩 남겨 둡니다.</li>
	<li>망막 조직이 있는 각 튜브에 500μL의 분해 용액을 추가합니다(그림 1C).<ol><li>P1000 피펫터와 피펫 팁을 사용하여 분해 용액의 망막 조직을 위아래로 5회 피펫팅합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>소화 혼합물을 37°C 수조에서 20분 동안 배양합니다.<ol><li>P1000 피펫터와 피펫 팁을 사용하여 5분마다 분해 혼합물을 위아래로 피펫팅합니다. 배양 후 망막 조직은 단일 세포 현탁액으로 용해되므로 소화 혼합물이 흐려야 합니다(그림 1C).</li>
	</ol></li>
</ol>4. 셀 계산
<ol><li>탁상용 원심분리기를 4°C에 놓고 분해 혼합물 튜브를 내부에 넣습니다. 소화 혼합물을 375 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.</li>
	<li>피펫팅으로 상청액 소화 용액을 조심스럽게 제거합니다. 셀 펠릿을 방해하지 마십시오(그림 1C). 피펫과 위아래로 부드럽게 혼합하여 500μL의 얼음처럼 차가운 1x PBS에 펠릿을 다시 현탁합니다.</li>
	<li>현미경으로 혈구 측정기로 세포를 세십시오. 참고: 세포 수는 망막 2개당 약 1 x 106 세포입니다.</li>
	<li>세포가 온화한 혼합에 의해 적절하게 재현탁되었는지 확인한 다음, 이전에 설명되고 사용된 바와 같이 대조군 염색을 위해 20μL의 세포 현탁액을 3개의 튜브(튜브 1: IgG 대조군, 튜브 2: CD31 대조군 및 튜브 3: CD45 대조군)로 분취합니다(17,18).</li>
	<li>탁상용 원심분리기를 4°C에 놓고 내부에 셀이 들어 있는 튜브를 놓습니다. 세포를 375 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.</li>
</ol>5. 항체로 세포를 면역염색
<ol><li>염색된 망막 2개와 대조군 튜브 4개당 100μL의 염색 완충액을 준비합니다. FBS, HEPES 및 D-포도당을 HBSS 버퍼에 추가하여 최종 농도 10% FBS, 10mM hepes 및 1mg/mL D-포도당을 추가합니다.</li>
	<li>CD31 및 CD45에 대한 형광 접합 항체를 얻습니다. 항체를 1:100 희석액으로 염색 완충액에 추가합니다(튜브 1: IgG 항체만, 튜브 2: CD31 항체만, 튜브 3: CD45 항체만). 2μg/mL의 최종 항체 농도에 대해 염색 버퍼 100μL당 1μL의 항체를 추가합니다.</li>
	<li>피펫팅으로 세척된 세포 펠릿에서 PBS를 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>펠렛을 0.5 x 106 세포당 100 μL의 항체 염색 용액에 재현탁시킨다.<ol><li>단일 세포 현탁액을 항체 염색 용액과 함께 어두운 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션합니다. 10분마다 튜브를 두드려 세포를 부드럽게 섞습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 형광 활성화 세포 분류 준비
<ol><li>탁상용 원심분리기를 4°C로 설정하고 내부에 세포가 들어 있는 튜브를 놓습니다. 펠렛 세포를 375 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.<ol><li>상청액을 제거하고 이들 세포를 500 μL의 1x PBS에 재현탁시켜 세척한다.</li>
	</ol></li>
	<li>탁상용 원심분리기를 4°C로 설정하고 내부에 세포가 들어 있는 튜브를 놓습니다. 375 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛 세포</li>
	<li>1.5mL의 FACS 버퍼(1x PBS 중 1% FBS)를 준비합니다.<ol><li>상청액을 제거하고 피펫터와 부드럽게 혼합하여 300μL의 FACS 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>FACS 버퍼가 포함된 샘플 튜브에 요오드화프로피듐(PI)을 최종 농도 0.5μg/mL로 추가합니다. PI는 생존력 마커로 사용됩니다.</li>
	<li>세포 여과기 스냅 캡을 통해 세포 현탁액을 5mL 시험관으로 옮기고 결합합니다. 셀 스트레이너 스냅 캡에는 35μm 필터가 포함되어야 하며 셀 현탁액을 필터에 직접 피펫팅할 수 있습니다.<ol><li>FACS 튜브를 어둠 속에서 얼음 위에 놓고 세포 분류기로 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
</ol>7. FACS 계측기 설정
<ol><li>FACS 기기에 100μm 노즐을 설치합니다. 알림: 이 크기의 노즐은 포집량을 최소화하고 격리된 셀 밀도를 최대화합니다.</li>
	<li>FACS 기기에 설치할 수집 튜브로 250μL의 1x PBS를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 준비합니다.</li>
</ol>8. FACS 를 통해 생존 가능한 내피 세포 분리
<ol><li>FACS 계측기와 컴퓨터를 켭니다. FACS 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 컴퓨터에서 FACS 소프트웨어를 열어 FACS 기기를 실행하고 작동합니다. 일상적인 품질 관리 테스트를 수행합니다.</li>
	<li>제어 염색 샘플을 FACS 기기에 로드하여 축을 조정합니다. IgG 항체 전용 세포로 시작하여 FSC 및 SSC를 생성 및 조정한 다음 CD31-항체만 생성하여 조정한 다음 CD45-항체만 생성하여 CD45를 생성하고 조정합니다. 대조군 샘플의 데이터를 기록합니다.</li>
	<li>염색된 샘플 셀을 FACS 기기에 로드하고 샘플을 실행합니다.</li>
	<li>전방 산란 및 측면 산란 (각각 FSC-A 및 SSC-A) 매개 변수를 기반으로 세포를 게이트합니다 (그림 2A). 참고: FSC-A 및 SSC-A 매개변수는 크기, 밀도, 입도, 표면 특성 및 굴절률을 기준으로 셀을 선택하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>FSC-A 및 FSC-H에 의한 게이트 셀은 셀 더블릿을 식별하고 단일 셀만 수집합니다(그림 2A). 참고: FSC-A 및 FSC-H 매개변수는 전방 산란 중에 셀 이중선이 더 큰 면적 대 높이 비율을 포함하는 액적이 된다는 원칙에 따라 단일 셀을 선택하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>생존 세포를 확인하기 위해 PI 및 SSC-A에 의한 게이트 세포(도 2A). 참고: 생존 가능한 세포는 PI 음성입니다.</li>
	<li>CD31+/CD45- 게이트를 대조군으로 만들고 CD31 및 CD45에 의해 세포를 게이트합니다(그림 2A,B).<ol><li>250μL의 FACS 버퍼가 있는 수집 튜브를 삽입합니다.</li>
		<li>CD31 양성/CD45 음성인 세포를 설치된 수집 튜브로 분류하기 시작합니다.</li>
		<li>추가 분석을 위해 수집 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 이단계 1에서 차세대 시퀀싱 애플리케이션을 위해 샘플을 처리할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>9. 생존력 분석 수행
<ol><li>10μL의 세포와 10μL의 0.4% 트리판 블루 용액을 혼합하여 세포 생존율을 평가합니다.</li>
	<li>염색된 혼합물을 혈구측정기 슬라이드에 피펫팅하여 생존 세포를 계수합니다. 정확한 생존력 계산을 위해 슬라이드를 현미경 아래에 놓습니다. 파란색 세포를 실행 불가능한 것으로 계산하고 명확한 세포를 실행 가능한 것으로 계산합니다.<ol><li>생존 가능한 세포 수를 총 세포 수로 나누어 생존율을 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>10. 유전자 발현 분석 수행
<ol><li>샘플당 10,000-20,000개의 세포를 얻고 RNA 분리를 수행하여 쥐 망막 내피 세포 유전자 발현을 분석합니다. RNA 분리는 에탄올 기반 RNA 침전을 사용하는 시판되는 키트를 사용하여 수행된 다음 원심분리 및 멤브레인 컬럼을 사용하여 세포 용해물에서 정제된 RNA를 세척하고 용리합니다. 이 단계1에서 일부 차세대 시퀀싱 애플리케이션을 위한 샘플을 처리할 수 있습니다.</li>
	<li>역전사효소 및 지지 시약을 사용하여 RNA를 cDNA로 전환시킨다19.</li>
	<li>DNA 결합 염료 및 정량 PCR(qPCR) 기계(20)를 사용하여 정량한다. 관심 유전자를 증폭하기 위해 프라이머가 있는 384웰 qPCR 플레이트에 cDNA 샘플을 로드합니다. 반응 부피는 유전자 증폭을 정량화하는 데 사용될 DNA 결합 염료를 포함하여 총 10μL여야 합니다.<ol><li>CD31, VE-Cadherin, CD45 및 β-액틴 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 유전자 발현을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>차세대 시퀀싱 어플리케이션에 샘플 사용1.</li>
</ol>

<ol><li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).</li>
<li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42(2020).</li>
<li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li>
<li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li>
<li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Single+Cell+Methods%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li>
<li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
<li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li>
<li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%3A+GEP%22%5BJournal%5D)">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li>
<li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+versus+venous+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li>
<li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366(2016).</li>
<li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149(2017).</li>
<li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li>
<li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li>
<li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+PartB%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-transcription+PCR+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbour+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li>
<li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31%3A+beyond+a+marker+for+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li>
<li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li>
<li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li>
<li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li>
<li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+is+required+for+CNS%2C+but+not+non-CNS%2C+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li>
<li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li>
<li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations%3A+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li>
<li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514(2018).</li>
<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049(2019).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li>
<li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li>
<li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li>
<li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li>
<li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).</li>
<li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li>
<li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCENIC%3A+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li>
</ol>

저자는 관련 공개가 없습니다.

이 프로토콜은 높은 세포 수, 순도 및 생존력에 최적화된 출생 후 뮤린 망막 조직으로부터 내피 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 세포 순도는 CD31+/CD45-면역염색에 의해 소화된 단일-세포 현탁액으로부터 내피 세포 집단의 FACS 단리에 의해 수득된다. 분리 품질은 트리판 블루 염색에 의한 생존력 분석 및 CD31, CD45 및 VE-카데린에 대한 qPCR에 의한 유전자 발현에 대한 분석에서 정량화됩니다(VE-카데린은 면역염색에 사용되지 않음). 이 프로토콜의 중요한 단계는 망막 조직 분리 및 조직 소화입니다. 망막 조직 분리는 세포 생존력을 유지하고 정확하게 세포 순도를 높이기 위해 신속하게 수행되어야합니다. 조직 소화는 세포 수율과 세포 생존력을 최적화하기 위해 설명 된대로 수행되어야합니다.
이 프로토콜에 대한 수정은 이 방법을 다른 시점, 트랜스제닉 변형을 갖는 마우스 또는 다른 다운스트림 애플리케이션에 적용할 때 이루어질 수 있다. 이것은 조직이 P6 망막 조직보다...

차세대 염기서열분석 접근법을 통한 핵산 염기서열분석의 높은 처리량은 분자 및 세포 생물학에 대한 연구자들의 지식을 크게 발전시켰습니다. 이러한 고급 기술에는 전체 전사체 RNA 시퀀싱, 단일 염기 다형성(SNP)을 식별하기 위한 표적 영역의 DNA 시퀀싱, 염색질 면역침전(ChIP) 시퀀싱에서 결합된 전사 인자의 DNA 시퀀싱 또는 트랜스포아제 접근 가능 염색질(ATAC) 시퀀싱을 위한 분석에서 열린 염색질 영역 및 단일 세포 RNA 시퀀싱1이 포함됩니다. . 혈관 생물학에서 이러한 발전으로 연구자들은 다양한 표현형 2,3의 연속체를 따라 유전자 발현 패턴을 구별하는 것과 함께 복잡한 발달 및 질병 메커니즘을 밝힐 수있었습니다. 향후 실험에서는 차세대 염기서열분석과 평가된 혈관 발달 모델을 결합하여 복잡한 메커니즘을 추가로 정의할 수 있지만, 시료 전처리 방법은 고급 염기서열분석 기법과 호환되어야 합니다.
차세대 염기서열분석 접근법의 품질, 정확성 및 재현성은 시료 전처리 방법에 따라 달라집니다. 세포의 하위 집합을 분리하거나 조직에서 단일 세포 현탁액을 생성할 때세포 집단의 세포 수, 생존력 및 순도를 최대화하기 위해서는 최적의 분해 및 정제 방법이 필수적입니다4,5. 이것은 소화 방법의 균형을 필요로합니다 : 조직에서 세포를 방출하고 다운 스트림 접근을위한 충분한 세포를 얻으려면 강한 소화가 필요하지만 소화가 너무 강하면 세포 생존율에 부정적인 영향을 미칩니다 6,7. 또한 FACS를 통해 달성할 수 있는 강력한 결과와 정확한 데이터 분석을 위해서는 세포 집단의 순도가 필요합니다. 이는 확립된 혈관 발달 모델에 차세대 염기서열분석을 적용하기 위해 세포 분리 방법을 최적화하는 것의 중요성을 강조합니다.
혈관 발달을 조사하기위한 잘 특성화 된 모델은 쥐 망막 혈관 발달 모델입니다. 뮤린 망막 혈관 구조는 출생 후 2 차원 표면 신경총에서 발생하며, 출생 후 일 (P) 3에 보이는 시신경에서 초기 혈관 신생 싹이 트고, 줄기 및 팁 세포가있는 혈관 신생 전선과 P6에서 볼 수있는 초기 혈관 성숙, P9 8,9 이후에 볼 수있는 혈관 신경총의 성숙. 초기 혈관 신경총의 리모델링 동안, 내피 세포는 순환 네트워크(10,11)를 생성하기 위해 상이한 혈관에서 동맥, 모세 혈관 및 정맥 표현형에 대한 사양을 거친다. 따라서, 이 방법을 통해연구자들은 발달 중 다양한 시점에서 혈관신생 혈관 신경총 형성 및 내피 동맥-정맥 사양 및 성숙을 시각화할 수 있습니다9. 또한, 이 모델은 혈관 발달, 동맥-정맥 기형 및 산소 유도 신생혈관의 조사에 적용된 혈관신생 및 혈관 신경총 발달에 대한 형질전환 조작의 효과를 조사하는 방법을 제공합니다 12,13,14,15,16 . 차세대 염기서열분석 접근법과 쥐 망막 혈관 개발 모델을 결합하려면 망막 조직에서 내피 세포를 분리하기 위한 최적화된 프로토콜이 필요합니다.
이 프로토콜은 P6에서 마우스의 망막 조직을 소화하여 세포 수율, 순도 및 생존력을 극대화하는 최적화된 방법을 설명합니다. 망막 조직을 P6 마우스로부터 분리하고, 20분 동안 소화시키고, CD31 및 CD45에 대해 면역염색하고, FACS를 통해 정제하여 약 2.5시간 내에 내피 세포의 단일 세포 현탁액을 분리한다(도 1A). 이러한 내피 세포는 분리 후 60분 동안 높은 생존력을 유지하는 것으로 밝혀졌으며17, 차세대 시퀀싱 방법을 위한 라이브러리 준비를 가능하게 합니다. 또한 FACS 게이팅 및 품질 관리 결과에 대한 대표 결과가 이 분리 프로토콜을 사용하는 두 가지 개별 차세대 시퀀싱 방법인 전체 전사체 RNA 시퀀싱 및 단일 세포 RNA 시퀀싱에서 제공됩니다. 이 방법을 사용하면 망막 혈관 형성 모델과 함께 차세대 시퀀싱 접근법을 사용하여 혈관 발달의 새로운 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2 mL 에펜도르프&nbsp; safe-lock tubes</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3352</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Non-TC-treated Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>551262</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat IgG2a &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSChorus Software</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCHORUS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSMelody Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSMELODY</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>234115</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individualped, Sterile Corning</td><td></td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>일회용 눈금 전달 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>해부 팬 왁스</td><td>캐롤라이나</td><td>629100</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>해부 실체 현미경 M165 FC</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-052</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Flex-Tubes 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22364120</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 겸자</td><td>Fine Science Tools</td><td>11250-00</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630130</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Covetrus</td><td>11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 범용 디럭스 수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD20</td><td></td></tr><tr><td>프라이머: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3'</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>프라이머: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3'</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>입문서: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttcagttt -3'</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>프라이머: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3'</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>프라이머: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3'</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: CD45_Reverse: 5'- ctggacggacacagttagca -3'</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>프라이머: VE-Cadherin_Forward: 5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3'</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>프라이머: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R 원심분리기, 냉장</td><td>ThermoFisher</td><td>75002477</td><td></td></tr><tr><td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V450 쥐 안티-마우스 CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>V450 쥐 IgG2b, &kappa; 동형(Isotype) 제어</td><td>BD 생명과학</td><td>560457</td><td></td></tr></tbody></table>

차세대 염기서열분석을 위한 뮤린 망막 내피 세포의 분리

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

차세대 시퀀싱의 최근 개선은 분자 및 세포 생물학에 대한 연구자의 지식을 향상 시켰으며 여러 연구에서 혈관 생물학의 새로운 패러다임을 밝혀 냈습니다. 이러한 방법을 혈관 발달 모델에 적용하려면 배아 및 출생 후 조직에서 세포 분리 기술을 최적화해야합니다. 세포 수율, 생존력 및 순도는 모두 차세대 염기서열분석 접근법에서 정확하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 최대여야 합니다. 신생아 마우스 망막 혈관 형성 모델은 연구자들이 혈관 발달 메커니즘을 연구하는 데 사용됩니다. 연구원들은 이 모델을 사용하여 혈관 형성 및 성숙 동안 혈관신생 및 동맥-정맥 운명 사양의 메커니즘을 조사했습니다. 망막 혈관 개발 모델을 연구하기 위해 차세대 시퀀싱 기술을 적용하려면 세포 수율, 생존력 및 순도를 극대화하는 망막 내피 세포의 분리 방법을 최적화해야 합니다. 이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 쥐 망막 조직 분리, 소화 및 정제하는 방법을 설명합니다. 상기 결과는 FACS-정제된 CD31+/CD45-내피 세포 집단이 내피 세포 유전자 발현에 대해 고도로 농축되고, FACS 후 60분 동안 생존력의 변화를 나타내지 않음을 나타낸다. 여기에는 벌크 RNA 시퀀싱 및 단일 세포 RNA 시퀀싱을 포함하여 이 방법을 사용하여 분리된 내피 세포에 대한 차세대 시퀀싱 접근법의 대표적인 결과가 포함되어 망막 내피 세포 분리를 위한 이 방법이 차세대 시퀀싱 애플리케이션과 호환됨을 보여줍니다. 이 망막 내피 세포 분리 방법은 혈관 발달의 새로운 메커니즘을 밝히는 고급 시퀀싱 기술을 허용합니다.

망막 조직의 소화 및 CD31 및 CD45에 대한 면역염색은 세포, 단일 세포 및 생존력에 대한 게이팅 후 CD31+/CD45-내피 세포의 식별 가능한 집단을 초래합니다(그림 2A). CD45 면역염색은 혈소판 및 일부 백혈구를 포함하는 CD31+/CD45+ 세포를 제거하는 데 필요합니다21. 항체 특이성을 보여주고 게이팅 전략을 안내하기 위해 각 실험에 대해 대조군을 수행해야 합니다(그림 2B). 이 비율은 소화된 단일 세포 현탁액에 있는 모든 세포의 약 0.5%-1.0%로 상대적으로 낮습니다.
생존력과 순도는 프로피듐 요오드화물 염색의 정량화 및 상이한 집단으로부터 분리된 RNA의 유전자 발현 분석을 통해 평가할 수 있다. 다양한 분해 시간은 세포 수율과 생존율에 영향을 미치며, 20분의 분해 시간은 생존할 수 없는 내피 세포의...

이 프로토콜은 세포 수율, 순도 및 생존성에 최적화된 뮤린 출생후 망막 내피 세포의 단리를 위한 방법을 설명한다. 이 세포는 차세대 시퀀싱 접근법에 적합합니다.

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

이 망막 내피 세포 분리 방법은 혈관 발달의 새로운 메커니즘을 밝히는 고급 시퀀싱 기술을 허용합니다. 설명된 프로토콜은 차세대 시퀀싱 애플리케이션에 필수적인 높은 수준의 생존력과 순도에 최적화되어 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 허쉬 연구소의 대학원생 인 셸비 케인 (Shelby Cain)이 될 것입니다.해부 가위를 사용하여 눈꺼풀에 수직으로 절개하여 눈 위의 피부와 막을 절단하여 안락사 된 신생아 마우스에서 눈을 제거하기 시작합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 눈 위와 아래를 눌러 눈이 소켓에서 나오도록합니다. 집게로 눈 아래를 조심스럽게 꼬집고 눈을 붙인 시신경을 자릅니다.그런 다음 수확이 끝날 때까지 새로 준비된 얼음처럼 차가운 PBS의 48 웰 플레이트의 웰에 마우스의 두 눈을 놓습니다. 마우스 망막 조직을 분리하려면 넓은 팁이 있는 전사 파이프 패드를 사용하여 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 페트리 접시에 해부 패드에 눈을 매달아 놓습니다. 해부 현미경으로 작업하면서 하나의 미세한 집게로 시신경을 잡고 두 번째 집게를 사용하여 각막과 공막이 연결되는 눈의 전방을 통해 구멍을 뚫습니다.그런 다음 각막 주위의 약 75 %를 원으로 구멍을 뚫습니다. 하나의 집게로 시신경을 잡고 두 번째 집게를 사용하여 망막 조직에서 공막과 유리체를 부드럽게 찢습니다. 수정체와 히알로이드 신경총 혈관을 제거하려면 거의 닿을 때까지 열린 집게로 망막에 도달 한 다음 집게를 닫아 렌즈와 히알로이드 신경총 혈관을 망막에서 잡아 당깁니다.모든 혈관이 제거되면 망막을 500 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 PBS 1 개로 채워진 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 넣습니다. 피펫으로 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에서 과도한 PBS를 제거하여 튜브에 약 100 마이크로 리터의 PBS를 남겨 망막 조직을 완전히 덮습니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 새로 준비된 소화 용액을 튜브에 첨가하십시오.P1000 피펫타와 피펫 팁을 사용하여 분해 용액의 망막 조직을 위아래로 5회 피펫팅합니다. 완료되면 소화 혼합물을 섭씨 37도의 수조에서 20분 동안 배양하고 앞서 설명한 대로 소화 혼합물을 5분마다 위아래로 피펫팅합니다. 배양 후 망막 조직은 단일 세포 현탁액으로 용해되어 소화 혼합물을 흐리게 만듭니다.다음에, 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 375g에서 원심분리하여 펠렛화한다. 원심분리 후, 세척된 세포 펠렛으로부터 PBS를 피펫팅으로 제거한 다음, 펠렛을 100 마이크로리터의 항체 염색 용액에 재현탁시켜 세포를 면역염색한 후 6번째 세포에 10회 당한다. 단일 세포 현탁액을 항체 염색 용액과 함께 10분마다 튜브를 두드리면서 어두운 얼음 위에서 30분 동안 배양하여 세포를 부드럽게 혼합합니다.형광 활성화 세포 분류를 위해, 섭씨 4도에서 5분 동안 375g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 상청액을 제거한 후, 세포를 이전에 기재된 바와 같이 500 마이크로리터의 PBS로 세척하고 펠렛화한다. 이어서 세포를 300 마이크로리터의 형광-활성화 세포 분류 또는 FACS 완충액에 재현탁시킨 후 피펫타와 부드럽게 혼합한다.다음으로, FACS 버퍼가 포함 된 샘플 튜브에 생존력 마커로 요오드화 프로피듐 또는 PI를 추가하여 밀리리터 당 0.5 마이크로 그램의 최종 농도를 얻습니다. 피펫을 사용하여 35미크론 필터가 포함된 세포 여과기 스냅 캡을 통해 세포 현탁액을 5밀리리터 시험관으로 옮깁니다. 여과 후 FACS 튜브를 어두운 곳의 얼음 위에 보관한 다음 튜브를 세포 분류기로 옮깁니다.FACS 기기와 컴퓨터를 켜고 FACS 소프트웨어를 열어 FACS 기기를 실행하고 작동합니다. 일상적인 품질 관리 테스트를 수행합니다. 제어 얼룩 샘플을 FACS 기기에 로드하여 축을 조정합니다.IgG 항체 전용 세포로 시작하여 전방 산란 및 측면 산란을 생성하고 조정합니다. 이어서 CD31 항체만 생성하고 CD31을 조정한다. 이어서 CD45 항체만을 생성하고 CD45를 조정한다.대조 샘플의 데이터를 기록합니다. 다음으로, 염색된 샘플 셀을 FACS 기기에 로드하고 샘플을 실행합니다. 전방 산란 또는 FSC 및 측면 산란 또는 SSC 매개 변수를 기반으로 세포를 보행시킵니다.FSCA 및 FSCH에 의한 보행 세포는 세포 이중선을 식별하고 단일 세포만 수집합니다. 생존 가능한 세포를 확인하기 위해 PI 및 SSCA에 의한 보행 세포. 대조군으로 CD31+CD45 보행 만들기 대조군으로 CD31+CD45-보행을 만들고 CD31 및 CD45로 세포를 보행시킵니다.기기에 250마이크로리터의 FACS 버퍼가 있는 수집 튜브를 삽입합니다. 다음으로, 설치된 수집 튜브에 CD31+CD45인 세포 분류를 시작합니다. 추가 분석을 위해 수집 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.샘플은 차세대 염기서열분석 어플리케이션을 위해 처리될 수 있습니다. 이 연구에서 소화 시간을 변화시키는 것은 세포 수율과 생존율에 영향을 미쳤습니다. 20분의 소화 시간은 생존할 수 없는 내피 세포의 낮은 비율로 최적의 수율을 가져왔습니다.후속 프로피듐 요오드화물 염색은 단리된 내피 세포가 단리 후 60분 동안 생존 가능한 상태를 유지했음을 입증했습니다. 세포 집단 순도는 CD31+CD45-집단에서 내피 세포 유전자에 대해 강한 농축을 나타내는 내피 세포 유전자의 발현에 대한 정량적 PCR 또는 qPCRR 분석에 의해 평가되었습니다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 통해 cDNA를 변환 및 증폭하는 분리된 내피 세포로부터 RNA 정제 cDNA 라이브러리는 9개의 독립적인 샘플에서 16, 000개 이상의 유전자를 확인하였다.백만 읽기 또는 TPM당 전사체의 감소가 이 임계값 미만의 유전자에서 관찰되었습니다. 10x Genomics 파이프 라인을 통해 분리 된 망막 내피 세포의 단일 세포 RNA 시퀀싱은 세포 당 1, 171 개의 유전자, 15, 247 개의 총 유전자가 검출되고 917 개의 세포에서 세포 당 2, 255 개의 고유 분자 식별자 또는 UMI 수의 중앙값을 산출했습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 망막 조직 분리 및 조직 소화이며, 세포 수율과 생존력을 최적화하기 위해 설명된 대로 정확하게 수행되어야 합니다.분리된 내피 세포는 전체 전사체 RNA 시퀀싱, 단일 세포 RNA 시퀀싱, 염색질 면역침전 시퀀싱 및 트랜스포아제 접근 가능한 염색질 시퀀싱을 위한 분석과 같은 고급 시퀀싱 기술에 사용할 수 있습니다. 이 최적화된 분석법을 차세대 염기서열분석 방법 및 전산적 접근법과 함께 사용하면 혈관 발달을 조절하는 상호 연결된 신호 경로의 메커니즘을 더욱 해명할 수 있습니다.

isolation-murine-retinal-endothelial-cells-for-next-generation

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

이 비디오는 유세포 분석을 사용하여 쥐의 원발성 망막 신경절 세포(RGC)를 분리하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 신경퇴행성 질환에서 기능적 망막 신경절 세포의 상실로 인한 시력의 주요 저하를 더 잘 이해하는 것을 목표로 망막 신경절 세포에 대한 향후 연구를 가능하게 합니다.

형광 활성화 세포 분류를 사용한 쥐 망막 신경절 세포 분리

심장 판막 내피 세포(VEC)를 분리하는 능력은 판막 발달, 유지 및 질병의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다.  여기에서는 FACS를 사용하여 배아 및 성인 Tie2-GFP 마우스에서 VEC를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 발달 및 질병 과정에서 VEC의 기여도를 결정하는 연구를 수행할 수 있습니다.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

우리는 단일 세포 체학 실험을 수행하기 위해 안정하거나 방해받는 흐름 조건에 노출 된 마우스 경동맥의 내강에서 내피 세포와 핵을 분리하는 방법을 제시합니다.

단일 세포 다중 오믹스 실험을 위한 마우스 경동맥 내강에서 내피 세포 분리

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

배우세요 생후 쥐 망막 내피 세포 분리법으로 차세대 염기서열분석에 적합한 고수율·고순도 세포를 확보하는 방법입니다. 혈관 발달의 새로운 메커니즘 규명에 활용할 수 있습니다.

차세대 염기서열분석을 위한 뮤린 망막 내피 세포의 분리

더 많은 동영상 탐색