Name: 인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 배우세요 인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템을 구축하는 방법을. 내피세포, 주변세포, 성상아교세포를 활용하여 약물 전달 및 나노입자 수송 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 작업은 NANOSTEM 프로젝트의 일환으로 Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi)의 보조금 계약 No 764958에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 부여됩니다. 이 연구는 'Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais'(Clémence Deligne에 대한 펠로우십), "Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l'Enfant et de l'adolescent"(SFCE), Association "l'étoile de Martin"및 Association"Cassandra contre la leucémie"에 의해 부여됩니다.

이 프로토콜은 프랑스 고등 교육 연구부 (참조 : CODECOH DC2011-1321)와 지역 조사 검토위원회 (프랑스 Beuvry의 Béthune 산부인과 병원)의 승인을 받았습니다. 내피 세포 (ECs)를 얻기 위해 프랑스 법률에 따라 제대혈을 수집하기 위해 기증자의 부모로부터 서면 및 정보에 입각 한 동의를 얻었습니다. 혈관주위세포는 Takashi Kanda 교수(일본 우베 야마구치 대학 의과대학원 신경학 및 임상 신경과학과)가 제공하며, 참고문헌19에 따라 분리되었습니다. 일차 인간 뇌 피질 성상 세포는 상업적 공급자로부터 구입합니다 ( 재료 표 참조).
1. 세포 배양
<ol><li>내피 세포의 배양 참고: 내피 세포(EC)는 Pedroso et al.20에 설명된 방법에 따라 인간 제대혈에서 분리된 CD34+ 조혈 줄기 세포에서 파생됩니다. EC의 내피 표현형은 Pedroso et al.20에 기재되어 있습니다.
	<ol><li>5%의 태아 송아지 혈청(FCS), 0.5%의 겐타마이신 및 1%의 내피 세포 성장 보충제(ECM)가 보충된 내피 세포 배지를 사용하여 인간 EC를 배양합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>계대 배양 EC의 경우 모델 설정 이틀 전에 한 접시에 2% 젤라틴 10mL를 37°C에서 15분 동안 코팅한 다음 따뜻한 ECM 20mL로 교체합니다. 100만 개의 세포를 함유하는 ECs의 바이알 1개(세포는 세포 동결 전에 단계 2.3.3에 기재된 바와 같이 수동으로 계수됨)를 사전 코팅된 세포 배양 접시에서 해동시킨다.</li>
		<li>37°C에서 3시간 후, 배지를 갱신하고, 5% CO2 및 21%O2 하에 37°C에서 인큐베이터 내부의 가습된 분위기에서 삼배양이 설정될 때까지 세포를 유지한다.</li>
	</ol></li>
	<li>혈관주위세포의 배양 참고 : pericytes는 Shimizu et al.19에 의해 발표 된 프로토콜에 따라 인간의 뇌에서 분리되며, 분리 절차는 Kanda et al.21 이 수정 한 방법을 따릅니다.<ol><li>4.5g/L의 포도당(DMEM HG), 10%의 FCS, 1%의 드 페니실린/스트렙토마이신 및 1%의 L-글루타민이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지를 사용하여 혈관주위세포를 배양합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>pericyte 계대 배양의 경우, 모델 설정 5 일 전에 실온 (RT)에서 1 시간 동안 0.02N 아세트산에서 콜라겐 유형 I 용액 100μg / mL의 8mL / dish로 두 접시를 코팅 한 다음 RT DMEM HG로 두 번 세척합니다. 10 mL의 따뜻한 배지를 함유하는 원뿔형 튜브에서 100만 개의 세포를 함유하는 혈관주위세포의 한 바이알을 해동시키고, 현탁액을 20°C에서 190 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>펠릿을 10mL의 따뜻한 배지에 재현탁하고 15mL의 따뜻한 배지/접시로 미리 채워진 미리 코팅된 세포 배양 접시에 시드합니다. 배지는 3일 후에 갱신되고, 세포는 5% CO2 및 21%O2 하에 37°C에서 가습된 배양기에서 삼배양의 세팅까지 유지된다.</li>
	</ol></li>
	<li>성상 세포의 배양<ol><li>20 %의 FCS, 1 %의 성상 세포 성장 보충제 및 1 %의 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 (AM)이 보충 된 성상 세포 배지를 사용하여 성상 세포를 배양하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
		<li>성상 세포를 계대 배양하기 위해 모델 설정 1 주일 전에 T75 세포 배양 플라스크 10mL를 2μg / cm 2 폴리 -L- 라이신 (PLL) 10mL로 37 ° C에서 1 시간 동안 코팅하고 RT 멸균 수로2 회 세척합니다. 20mL의 따뜻한 배지에 100만 개의 세포가 포함된 성상세포 바이알 하나를 해동하고 미리 코팅된 T75 세포 배양 플라스크에서 시드합니다. 참고: 상업적으로 얻은 세포 바이알은 ~100만 개의 세포의 존재를 확인하므로 여기에서 세포 계수가 수행되지 않았습니다.</li>
		<li>세포를 5% CO2 및 21%O2 하에 37°C에서 가습된 인큐베이터에 유지한다. 배지는 24 시간 후에 갱신 된 다음 삼중 재배가 설정 될 때까지 2 일마다 갱신됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 삼중 문화 모델 설정
참고: 세 가지 셀 유형의 조립은 같은 날에 수행됩니다. 삼중 배양 설정 전날, 되돌린 삽입 필터( 재료 표 참조)에서 콜라겐 유형 I 코팅을 수행하고 12웰 플레이트의 PLL 사전 코팅된 웰에 성상세포를 파종합니다.
<ol><li>우물에 성상 세포의 파종<ol><li>단계 1.3.2에 설명된 대로 2μg/cm2PLL 용액 500μL로 웰을 코팅합니다.</li>
		<li>따뜻한 인산염 완충 식염수(칼슘 및 마그네슘이 없는 1X(1X PBS-CMF)(표 1)로 세포를 한 번 세척한 후 따뜻한 20% 트립신/EDTA(T/E) 용액 10mL로 37°C에서 3분 동안 배양하고 플라스크에서 세포를 기계적으로 분리합니다. 현탁액을 5mL의 따뜻한 희석되지 않은 FCS가 들어있는 원추형 튜브로 옮깁니다. 참고 : 제공자의 프로토콜22에 따르면, 플라스크를 인큐베이터에 1 분 동안 놓고 플라스크를 두드려 분리를 완료함으로써 성상 세포 수집을 최적화 할 수 있습니다. 나머지 세포는 5mL의 T/E 중화 용액으로 수집하여 FCS 함유 원추형 튜브에 넣어야 합니다.</li>
		<li>현탁액을 190 x g에서 20°C에서 5분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>5mL의 따뜻한 AM에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 현미경 하에서 수동 계수 챔버를 사용하여 80μL의 1X PBS-CMF에 20μL의 세포 현탁액을 희석하여 세포를 계수합니다( 재료 표 참조). 각 PLL 사전 코팅된 웰에 약 40,000개의 세포/cm2 를 1.5mL의 따뜻한 AM 부피로 플레이팅합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>되돌린 삽입 필터에 혈관주위세포 파종<ol><li>뒤집힌 인서트 필터에 250μL의 콜라겐 유형 I 용액(100μg/mL)을 추가하고 멸균 핀셋을 사용하여 덮인 25mm 높이의 접시( 재료 표 참조) 주변에 놓습니다. 멸균 조건에서 RT에서 코팅을 1 시간 동안 그대로 두십시오. 알림: 사용한 접시는 후드 외부에서 멸균을 유지하고 되돌린 필터의 용액과 접시 덮개 사이의 접촉을 방지할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다.</li>
		<li>흡인 시스템에 연결된 유리 피펫으로 콜라겐 유형 I 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 250μL의 RT DMEM HG로 두 번 세척한 다음 인서트 필터에서 모든 용액을 조심스럽게 제거합니다. 코팅된 인서트 필터는 세포가 파종될 때까지 멸균 조건에서 RT에 두십시오. 알림: 코팅 절차 중에 멤브레인 손상을 방지하기 위해 필터를 만지지 않도록 주의하십시오. 콜라겐 유형 I로 코팅되면 삽입 필터를 RT에서 밤새 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>삼중 배양 설정 당일에 따뜻한 1X PBS-CMF 10mL로 주위세포를 두 번 씻고 따뜻한 트립신 2mL로 세포를 배양합니다. 현미경으로 세포를 관찰함으로써 트립신의 작용을 모니터링한다. 세포가 분리되기 시작하면 트립신을 제거하고 기계적 해리 전에 따뜻한 ECM 5mL를 추가합니다.</li>
		<li>현미경 하에서 수동 계수 챔버를 사용하여 80μL의 1X PBS-CMF에 20μL의 세포 현탁액을 희석하여 세포를 계수하고, 250μL의 부피로 사전 코팅된 되돌린 삽입 필터에 44,500 cells/cm2를 시드합니다. 인서트 필터를 37 ° C의 가습 인큐베이터에 5 % CO 2 및 21 % O2 하에서 3 시간 동안 보관하십시오.</li>
		<li>1.5mL의 따뜻한 ECM/웰이 들어 있는 12웰 플레이트에서 멸균 핀셋을 사용하여 삽입 필터를 조심스럽게 되돌립니다. 이제 인서트 필터를 반대쪽에 코팅할 준비가 되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>삽입 필터에 내피 세포 파종<ol><li>인서트 필터의 윗면을 500μL의 세포외 기질 기반 하이드로겔(1/48v/v)로 코팅합니다(재료 표 참조). 1 시간 후, 5 % CO 2 및 21 % O2 하에 37 °C의 가습 인큐베이터에서, 500 μL의 RT DMEM HG로 1 회 세척한다.</li>
		<li>따뜻한 1X PBS-CMF 10mL로 한 번 세척하고 따뜻한 트립신 2mL로 세포를 배양합니다. 세포가 분리되기 시작하면 트립신을 제거하고 기계적 해리 전에 따뜻한 ECM 5mL를 추가합니다.</li>
		<li>현미경 하에서 수동 계수 챔버를 사용하여 80μL의 1X PBS-CMF에 20μL의 세포 현탁액을 희석하여 세포를 계수하고 500μL의 따뜻한 ECM 부피로 사전 코팅된 삽입 필터에 71,500 cells/cm2 의 밀도로 EC를 시드합니다.</li>
		<li>AM을 1.5mL의 따뜻한 ECM/웰로 교체한 다음 시드된 삽입 필터(EC + pericytes)를 성상세포가 포함된 웰에 옮깁니다.</li>
		<li>삼배양 세포 시스템을 5% CO2 및 21%O2 하에 37°C의 가습 인큐베이터에 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>BBB 특성의 유도를 위한 삼중세포 배양액의 유지 참고: EC에서 BBB 속성을 유도하려면 6일간의 삼중 배양이 필요합니다.<ol><li>흡인 시스템과 연결된 유리 피펫을 사용하여 상부 및 하부 구획에서 배지를 조심스럽게 제거하고 6 일까지 격일로 배지를 갱신하십시오.</li>
		<li>상부 구획에서 500 μL 및 하부 구획에서 1.5 mL의 부피로 따뜻한 ECM으로 신속하게 교체하고, 세포를 5 % CO 2 및 21 % O2 하에서 37 °C에서 가습 인큐베이터에 다시 넣었다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. BBB 표현형 검증
참고: 6일간의 삼중 배양 후, ECs에서 BBB 표현형을 유도하는데 필요한 시간, 인간 BBB 모델은 실험을 위해 준비된다. 뇌 유사 내피 세포 (BREC)의 물리적 완전성은 BBB 완전성 마커에 대한 투과성 분석을 사용하여 평가 된 TJ 단백질의 면역 형광 염색에 의해 시각화됩니다. BBB 표현형 검증에는 Deligne et al.,23에 설명된 절차에 따라 유전자/단백질 발현 분석 및 유출 펌프 기능도 포함됩니다. Pericytes 및 Astrocytes는 Deligne et al.에 기재된 절차에 따라 각각의 염색 마커에 의해 가시화된다. 2020년23월.
<ol><li>면역형광염색<ol><li>인서트 필터와 성상 세포를 얼음처럼 차가운 메탄올 / 아세톤 (50 / 50 v / v)에 1 분 동안 고정하고 RT 1X PBS-CMF로 두 번 세척하십시오.</li>
		<li>메스를 사용하여 멤브레인을 절단하여 필터를 인서트에서 조심스럽게 분리하십시오. Deligne et al.23에 따라 멤브레인 및 바닥 웰에서 면역세포화학을 수행합니다. 알림: 블로킹 단계의 경우 RT에서 250분 동안 30μL의 SEA BLOCK 블로킹 버퍼( 재료 표 참조)를 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>BBB 무결성 분석<ol><li>나트륨 플루오레세인(NaF) 및 20kDa 덱스트란(FD20)과 같이 분자량이 다른 BBB 무결성 마커를 사용한 투과성 분석을 통해 BLEC의 물리적 무결성을 평가합니다( 재료 표 참조). 참고: 실험은 Deligne et al.23에 설명된 절차에 따라 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>유출 펌프 기능<ol><li>Elacridar, P-gp 및 BCRP 억제제의 유무에 관계없이 Rhodamine 123 (R123)의 세포 내 축적을 측정하여 P- 당 단백질 (P-gp) 및 유방암 저항성 단백질 (BCRP)의 기능을 평가합니다 ( 재료 표 참조). 참고: 실험은 Deligne et al.23에 설명된 절차에 따라 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>유전자 및 단백질 발현<ol><li>세포의 콜드 링거 헤페스(RH)(표 1)로 빠르게 세척한 후 얼음 상에서 유전자 및 단백질 샘플 수집을 수행한다. EC 샘플 수집 전에, 반전된 삽입 필터(20)로부터 혈관주위세포를 긁어낸다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 나노 겔 수송
참고: 삼중 배양 BLEC 모델의 내강에서 내강 구획으로의 고분자 나노겔(NG)의 통과를 추정하기 위해 0.1mg/mL의 NG 용액을 6일째에 내강 구획에 24시간 동안 첨가했습니다. 연구 된 NG는 평균 크기가 8-10 nm 인 형광 태그 N- 이소 프로필 아크릴 아미드 (NIPAM) 기반 하이드로 겔이었다 ( 재료 표 참조).
<ol><li>나노 겔 분말의 무게를 측정하고 1 mg / mL의 농도로 ECM에 가용화합니다. 용액을 10분 동안 초음파 처리하고 0.2μm PTFE 필터를 사용하여 필터링합니다. 참고: 실험 당일 신선한 NG 용액을 준비하십시오.</li>
	<li>내강 구획의 배지를 변경하고 최종 농도 0.1mg/mL에 대해 상부 구획에 NG 용액 50μL를 추가합니다. 참고: 원래 용액에서 1:10의 희석을 수행하십시오.</li>
	<li>24시간 배양 후 내강(20μL) 및 절강(200μL) 구획에서 분취량을 수집하여 검은색 96웰 플레이트에 넣습니다.</li>
	<li>477/540nm에서 여기/방출 파장 설정을 사용하여 검은색 96웰 플레이트가 있는 형광 멀티플레이트 리더(재료 표 참조)를 사용하여 형광을 정량화합니다. 시간 = 0 h (t0)6,15에서 추가 된 초기 작업 용액에 대한 교차 비율을 계산합니다. 참고: 형광 측정을 위해 96웰 플레이트를 준비하려면 내강 구획에서 200μL의 용액과 내강 구획에서 20μL의 용액을 추가하고 t0 준비(최종 부피 200μL에 도달하려면 ECM 180μL를 추가). 또한 판독 판에 교정 곡선과 블랭크를 포함하십시오. 기기 파라미터: 검출 방법 - 형광, 광학 위치 - 상단, 판독 유형 - 엔드포인트, 여기 파장 - 477 nm, 방출 파장 - 540 nm, 감도 - 100, 쉐이크 - 5초 동안 이중 궤도.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

뇌 질환의 치료는 약물이 뇌 실질의 세포 및 분자 표적에 도달하기 위해 BBB를 넘어 장애물을 통과하는 어려움을 고려할 때 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.
뇌 질환에 대한 약물 개발은 전임상 모델에서 유망한 결과를 나타내는 대부분의 약물이 클리닉에서 사용될 때 어떤 이점도 보여주지 못했기 때문에 현재 낮은 성공률을 보입니다. 실험에 사용되는 동물의 수를 줄이는 것을 목표로하는 "3R 규칙"에 따라, BBB의 시험관 내 모델은 뇌 병리를 연구하고 약물29의 뇌 침투를 예측하기 위해 개발된다. BBB의 시험관내 모델은 주로 동물 세포를 사용하여 개발되었으며 얻어진 결과의 관련성을 향상시키기 위해 더욱 정교해졌습니다(16). 인간 세포 사용의 중요한 발전 중 하나는 인간 질병 메커니즘을 연구하기 위해 세포 및 분자 수준에서 부인할 수없는 새로운 통찰력과 더 많은 특이성을 제공합니다16. 그러나 관련 모델의 개발은 동물 모델 덕분에 BBB in vitro 모델 설정의 개선과 발생하는 지식을 고려해야합니다. 따라서, BBB 아키텍처의 복잡성 및 생리학적 및 병리학적 조건 하에서 BBB를 연구하기 위한 세포-세포 통신의 중요성을 고려할 필요가 있다(30).
여기에 제시된 프로토콜은 뇌 조직에 대한 접근의 제한 없이 BBB의 세 가지 주요 세포 유형을 포함하는 완전한 인간 BBB 시험 관내 모델을 설정하는 방법을 기술한다. 다중 세포 시스템으로서, BBB 특성의 유도 및 유지는, 조임 화합물의 인위적인 사용 없이, 그러나 세포-세포 통신에 의해 유도되는 대신에 BBB 특성의 생체내 유도와 일치하고 보다 생리학적으로 관련된다31. 따라서 프로토콜의 연대기에 대한 존중은 프로토콜의 성공을 위해 가장 중요합니다. 더욱이, 삼중 배양의 설정 동안의 배양 시간 및 일단 3개의 세포 유형이 조립되면 프로토콜의 주요 중요 단계를 나타낸다.
ECs에서의 BBB 특성은 공동-배양 모델24에 대해 설명된 바와 같이, 주위세포와의 공동-배양에 의해 유도된다. 따라서 삽입 필터의 뒷면에서 혈관 주위 세포의 배양이 가장 중요한 지점이며 BBB 특성의 유도를 위해 충분한 주변 세포가 없을 위험이 있으므로 프로토콜을 엄격하게 따라야합니다. 우선, 코팅 절차 및 세포 파종 중에 페트리 접시의 덮개가 코팅과 접촉하지 않도록주의해야하며 세포가 파종되면 여과기의 양호한 코팅을 보장하고 세포를 잃지 않도록 배지를 넣어야합니다 (2.2.1 및 2.2.4 단계). 또한, pericytes가 파종되면, 다른 쪽에서 EC의 코팅 및 파종을 위해 삽입 필터를 되돌리기 전에 pericytes의 부착을 위해 표시된 시간 (단계 2.2.4)을 기다리는 것이 필수적입니다 (단계 2.2.5 및 2.3). 일단 파종되면, 세포-세포 통신을 통해 BBB 특성을 유도하기 위해 6일이 필요하다(단계 2.4).
삼중 배양 모델의 EC는 검증된 공동 배양 모델과 유사한 BBB 무결성 마커에 대한 투과성 값을 표시하고 검증된 동물 또는 인간 모델 16,27,32에서도 측정되기 때문에 모델은 제한된 투과성(단단한 접합부의 설정과 관련됨) 측면에서 검증됩니다. 더욱이, 시험관내 BBB 모델의 검증은 제한된 투과성 이외에, NVU의 다른 세포 유형에 대한 반응성 및 기능적 수용체 및 수송체(16)의 발현을 요구한다. 또한 이 모델은 재현 가능하며 여러 삽입 필터와 웰을 생성하여 세포 분류 방법 없이 각 세포 유형에 대해 개별적으로 수많은 분석(유전자 및 단백질 발현, 형광 염색, 독성 테스트)을 수행합니다.
이 모델은 0.4μm 공극 크기 필터를 사용하여 개발되어 삽입 필터의 각 측면에 하나의 셀 유형이 있습니다. 삽입 필터 시스템은 생리적 조건에서 세포-세포 통신을 잘 포함된 성상세포에 전달하여 연구할 수 있었습니다. 시스템 내의 성상교세포의 존재는 초기 시험관내 공동 배양 모델24와 비교하여 플러스 값을 나타낸다. 실제로, BBB의 생리학에서 성상 세포의 중요성을 고려할 때,이 세 번째 세포 유형은 BBB 내의 세포 - 세포 통신에 대한 더 깊은 이해를 가능하게합니다. 또한, 삼중 세포 배양 시스템은 성상 세포가 필수적인 역할을하는 뇌졸중과 같은 병리학 적 상태에서도 연구 될 수있다(33,34,35). 또한, 삽입 필터의 양면에 있는 BLEC/pericytes의 디자인은 뇌암(23)과 같은 병리학적 상태를 모방하기 위해 다른 세포 유형 상에 용이하게 배치될 수 있다.
삽입 필터의 기공 크기는 BBB를 가로지르는 세포 이동과 같은 일부 실험에서 제한을 가져올 수 있습니다. 그러나, 더 큰 공극 크기를 갖는 모델의 개발은 다중 층이 아닌 ECs의 생리학적 단층의 형성을 보장하기 위한 프로토콜의 적응을 필요로 하며, 이는 BBB36을 모방하는 것과 생리학적으로 관련이 없다.
이 모델의 적용 가능성은 다세포 시스템을 사용하여 수송 실험을 수행 할 수있는 가능성을 보여주는 NG 수송 실험을 사용하여 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고 각 나노 구조가 고유한 특성 세트(분자량, 전하, 모양, 물리적 특성, 단백질 코로나 형성)를 나타내기 때문에 NG와 유사한 특성을 공유하는 수송 실험을 위한 대조 화합물 또는 분자를 갖는 데 어려움이 있음을 인식해야 합니다.
상기 모델의 하나의 한계는 전단 응력의 부재이며, 이는 ECs의 분화 및 TJ 단백질37의 발현에 영향을 미치는 것으로 입증되었다. 그러나 뇌 모세관을 모방 한 유체 시스템을 개발하는 것은 다중 세포 시스템에서 특정 장치가 필요한 유체 부분을 추가하는 복잡성을 고려할 때 어렵습니다. 더욱이, 특정 장치는 일반적으로 상업적으로 이용 가능하지 않으며 많은 복제를 허용하지 않으므로 유체 시스템이 고 처리량 사용에 적합하지 않습니다.
요약하면, 인간 세포로 구성된이 삼중 배양 시스템은 BBB의 구조를 시험관 내에서 재현합니다. 화합물의 광범위한 스크리닝에 사용할 수 있는 많은 인서트를 생성할 수 있습니다.

뇌 모세 혈관 내피 세포 (EC) 수준에 국한된 BBB는 뇌 항상성과 신경 세포의 기능을 유지하는 데 중요한 뇌 실질에 대한 접근을 제어하고 조절합니다 1,2. 그러나 뇌 병리학의 경우 뇌 실질에 대한 접근 부족은 치료 전략 개발에 실질적인 장애물을 나타냅니다.
BBB EC는 세포 간 경로 1,2,3을 제어하는 유출 펌프, 특정 수송체 및 수용체 시스템과 관련된 세포 간 공간을 밀봉하는 TJ (tight junction) 단백질을 포함한 복잡한 특성 세트를 가지고 있습니다. 또한, 이러한 모든 특성은 BBB EC 기저막에 내장 된 혈관 주위 세포 및 말단이 뇌 모세 혈관 1,2,3을 둘러싸고있는 성상 세포와의 통신 덕분에 유도되고 유지됩니다. 따라서 BBB를 시험관 내에서 연구하는 것은 구조의 복잡성과 신경 혈관 단위 (NVU)를 구성하는 다양한 세포 유형 간의 통신을 고려할 때 어려운 과제입니다.2. 더욱이, 상이한 세포 유형은 BBB 특성의 유도 및 유지에 중요하며 결과적으로 BBB를 통한 교차의 예측에 영향을 미친다. 뇌로의 약물 전달을 위한 상이한 전략은 BBB제한된 특성4을 우회하기 위한 전술의 큰 패널을 사용하여 이미 테스트되었다. 보다 최근에는 나노 기술의 발전과 함께 약물 운반체 5,6으로 응용하기위한 새로운 재료가 개발되고 있습니다. 더 높은 부하, 독성 감소 및 약물의 생체 이용률 증가 외에도이 새로운 나노 물질은 BBB를 가로 지르고 실질 5,6의 세포를 특이 적으로 표적으로하는 트로이 목마 전략을 위해 기능화 될 수 있습니다. 평가되는 다양한 유형의 나노 물질 중에서 나노 젤은 주로 콜로이드 특성과 자극 반응 특성 7,8,9,10,11,12,13,14,15를 도입하기 위해 화학 구조를 조정할 수있는 능력으로 인해 상당한 관심을 끌었습니다.
시험관내 모델은 현재 약물16의 뇌 침투를 예측하기 위해 인간 세포를 사용하는 전임상 연구를 위해 개발되고 있다. 이러한 모델의 다양한 설정은, 뇌 EC의 단층으로부터 다중 셀 시스템(16)에 이르기까지 이용가능하다. BBB 유도 및 유지에서 NVU 세포의 중요성과 병리학 적 환경에 대한 조정 된 반응을 고려할 때, BBB in vitro 모델은 예측 2,17의 관련성을 향상시키기 위해 이러한 모든 주인공을 고려해야합니다.
현재의 방법은 특정 세포 및 인간 분자 메커니즘을 연구하기 위해 인간 세포와 함께 완전히 개발 된 인간 BBB의 삼중 배양 시험관 내 모델을 설정하는 것을 설명합니다. 생리학적으로 관련되기 위해, 상기 모델은 조임 화합물을 사용하지 않고 BBB 특성을 유도하고 유지하는 데 필요한 BBB의 주요 3개의 세포 행위자(EC, pericytes 및 성상세포)로 구성되며, 시험관내 BBB 모델16,18로서 고려되는 데 필요한 특성 세트를 나타낸다. 이 모델은 혈액 및 뇌 구획을 구분하는 구성으로 설정되며, 뇌 침투를 예측하기 위한 약물 및 입자 수송의 전임상 연구에 적합합니다. 모델의 유용성은 고분자 나노겔의 수송을 측정함으로써 설명된다.

<table><tbody><tr><td><강>세포 배양</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배지(AM)</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>성상세포 성장 보조제</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1852</td><td>성상세포 성장 보충제는 AM 세트로 제공됩니다.</td></tr><tr><td>세포 배양 접시 100mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430293</td><td>100 mm x 20 mm; 삼중 재배 설정 전에 EC와 PC의 해동에 사용되는 접시</td></tr><tr><td>세포 배양 접시 150 mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430599</td><td>이 접시의 높이(25mm)는 삼문화 모델의 설정을 위해 되돌려진 인서트에 PC를 파종할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>콜라겐 I&nbsp;</td><td>코닝</td><td>354236</td><td>랫 테일&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco의 수정된 독수리 중간</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td>분말</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 보충제</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1051</td><td>내피 세포 성장 보충제는 ECM 세트로 제공됩니다.</td></tr><tr><td>내피 세포 배지 (ECM)</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Sigma</td><td>G2500</td><td>돼지 피부에서 추출한 2% 젤라틴 PBS-CMF</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>BiochromA6</td><td>A-2712</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>분말</td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Merck</td><td>1002891000</td><td></td></tr><tr><td>Human Brain Cortex Astrocytes</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1800-SC</td><td></td></tr><tr><td>Malassez 세포 계수 챔버</td><td>vWR</td><td>HECH40453702</td><td>계수는 수동으로 수행되었습니다.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>세포외 매트릭스 기반 하이드로겔</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0503</td><td>페니실린/스트렙토마이신 용액은 ECM 및 AM 세트로 제공됩니다.</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Millipore 시스템</td><td>SCGPT0SRE</td><td>0.22 &마이크로; m pore size</td></tr><tr><td>트랜스웰 인서트&nbsp;</td><td>코닝</td><td>3401</td><td>0.4 &마이크로; M 기공 폴리카보네이트 필터&nbsp;</td></tr><tr><td>트립신/EDTA 중화 솔루션</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0113</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA 솔루션</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0103</td><td></td></tr><tr><td>Immunocytochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEA BLOCK 차단 버퍼</td><td>ThermoScientific</td><td>37527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-Mouse 2차 항체</td><td>Thermofisher</td><td>A11031</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-Rabbit 2차 항체</td><td>Thermofisher</td><td>A11036</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5 일차 항체</td><td>InVitrogen</td><td>34-1600</td><td>희석 1:100</td></tr><tr><td>Anti-Desmin 1차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab6322</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein 1차 항체</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>항혈소판 유래 성장 인자-&베타; 1차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab51090</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>Anti-VE-cadherin 주요 항체</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Zona Occludens-1 주요 항체</td><td>InVitrogen</td><td>61-7300</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>일반 염소 세럼</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Gene expression</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,933,250</td><td></td></tr><tr><td>96 multiplate well</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>iSCRIPT</td><td>Biorad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>Sealer sheet&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5201</td><td></td></tr><tr><td>Protein expression</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Laemli Sample Buffer</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td>Add 50 &micro; l의 bMercaptoetanol을 950 &micro로; L의 Laemmli 완충액 및 -20°C에 보관합니다.분석을 위해 단백질 샘플로 1:1로 희석합니다.</td></tr><tr><td>반대로 유방암 저항 단백질 1 차적인 항체</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>전처리 교반의 밑에 RT에 15 분; 희석 1:1000, 4&deg에 O.N. ; C</td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5 일차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>95°C에서 5분 전처리; C; 희석 1:1000, O.N. 4&deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody</td><td>Millipore</td><td>07-1401</td><td>95°C에서 5분 전처리; C; 희석 1:1000, O.N. 4&deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 2차 항체</td><td>Dako</td><td>P0447</td><td>TBS-Tween</td></tr><tr><td>Anti-P-glycoprotein 1차 항체</td><td>Genetex</td><td>GTX23364</td><td>전처리 교반 하에서 RT에서 15분; RT</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit 2차 항체</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>희석 1:8000 TBS-Tween</td></tr><tr><td>Anti-Transferrin 수용체 1차 항체</td><td>Abcam</td> 희석 1:8000<td>ab84036</td><td>95°C에서 5분 전처리; C; 희석 1:1000, O.N. 4&deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Zona occludens-1 primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab216880</td><td>95°C에서 5분 전처리; C; 희석 1:1000, O.N. 4&deg; C</td></tr><tr><td>Criterion TGX 젤&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>5678083</td><td></td></tr><tr><td>ECL 프라임 솔루션</td><td>아머샴&nbsp;</td><td></td><td>RPN2236 어둠 속에 보관하기 위한 계시 솔루션</td></tr><tr><td>Phospatase 억제제 칵테일 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Phospatase 억제제 칵테일 3</td><td>Sigma</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>단백질 표준</td><td>Biorad</td><td>161-0373</td><td>분자량 마커</td></tr><tr><td>RIPA 10x</td><td>Millipore</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>Biorad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-Glycine</td><td>Biorad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>BBB 무결성 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluorescein</td><td>Ampresco</td><td>0681</td><td>&lambda; 예= 490nm; &람다; em= 525 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Elacridar</td><td>Sigma</td><td>SML0486</td><td></td></tr><tr><td>GF120918 FITC-Dextran 20 kDa</td><td>시그마</td><td>FD-20S</td><td>&lambda; 예= 490nm; &람다; 엠=&nbsp; 525 nm의 &nbsp;</td></tr><tr><td>로다 민 123</td><td>시그마</td><td>R8004</td> <td>&lambda; 예 = 501nm; &람다; em= 538 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>시너지TM H1&nbsp;</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>형광 멀티플레이트 리더</td></tr><tr><td>Nanogel Transport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Terumo</td><td>SS+01T1</td><td>1 mL 주사기&nbsp;</td></tr><tr><td>필터</td><td>FisherScientific</td><td>15161499</td><td>0.2 &micro; m PTFE 멤브레인 필터, 15 mm 지름</td></tr><tr><td>N-이소프로필아크릴아미드 (NIPAM) 기반 하이드로겔&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>연구에 사용된 나노젤(NG)은 런던 퀸 메리 대학교 화학과의 공동 연구자가 제공합니다. NG는 형광 분자(&lambda; 예= 477nm; &람다; em= 540 nm)입니다. NG는 동결 건조되어 분말로 배송되며, 이 상태에서는 장기간 실온에서 안정적입니다.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

뇌로의 약물 전달은 뇌 실질에 대한 접근을 제어하고 제한하는 혈액-뇌 장벽(BBB)의 매우 특이적이고 제한적인 특성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 그러나 나노 기술의 발달로 약물 전달을 개선하기 위해 새로운 나노 물질의 대형 패널이 개발되어 전임상 분석 프레임에서 뇌 침투를 예측하기 위해 신뢰할 수있는 시험관 내 마이크로 시스템의 필요성이 강조되었습니다. 다음은 인간 세포만을 사용하여 BBB를 모델링하는 미세생리학적 시스템을 설정하는 간단한 방법입니다. 그 구성에서 모델은 뇌 유사 내피 세포 (BREC), 혈관 주위 세포 및 성상 세포를 포함하는 삼중 배양으로 구성되며, 세 가지 주요 BBB 세포 행위자는 화합물을 조일 필요없이 BBB 특성을보다 생리 학적 방식으로 유도하고 조절하는 데 필요합니다. 삼중 배양 6일 후 준비된 12웰 플레이트 형식으로 개발된 이 모델은 물리적 특성, 유전자 및 단백질 발현을 특징으로 하며 고분자 나노겔 수송 측정에 사용됩니다. 이 모델은 건강하고 병리학적인 조건에서 광범위한 실험에 사용할 수 있으며 분자 및 입자 수송의 전임상 평가는 물론 세포 간 및 세포 내 트래피킹에 유용한 도구입니다.

인간 삼중 문화 BBB 모델의 설정 인간 BBB in vitro 모델의 설정에 필요한 프로토콜은 그림 1 에 설명되어 있으며 순서를 엄격하게 준수해야하는 연속 단계를 포함합니다. 먼저, 세 가지 세포 유형을 삽입 필터 시스템에 조립하기 전에 세포 배양 접시(그림 1A)에서 개별적으로 배양합니다. 삼중 배양 설정은 사전 코팅된 바닥 웰에 첫 번째 세포 유형인 성상세포를 파종하는 것으로 시작됩니다. 다음 날, pericytes와 EC는 각각 삽입 필터의 사전 코팅 된 경사 및 내강 표면에 파종됩니다. 그런 다음 삽입 필터가 성상 세포 위로 옮겨집니다. 상기 모델은 ECs에서 BBB 특성을 유도하는데 필요한 시간인 6일 동안 배양물에서 유지되고, 특허받은 공동배양 모델24에 따라 격일로 배지를 갱신한다. 그런 다음 EC의 이름이 BLEC로 바뀝니다(그림 1B).
인간 BBB 모델의 특성화 삼중 세포 배양 모델은 BBB 특이적 특성의 세트의 존재에 대해 특성화되었다. 우선, 면역 세포 화학 데이터는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β (PDGFR-β) 25,26 및 pericytes에 대한 desmin 및 성상 세포에 대한 glial 섬유소 산성 단백질 (GFAP) 26과 같은 기존의 마커의 발현을 확인했습니다 (그림 2A). 따라서, pericytes 및 성상 세포와 함께 6 일간의 배양 후, VE-Cadherin의 부착 접합 염색으로 시각화 된 BLECs의 단층은 세포 경계에서 TJ 단백질 Claudin-5 및 ZO-1의 지속적인 국소화를 나타냅니다 (그림 2A). TJ의 설정은 도 2B에 도시된 바와 같이, 저분자량, 즉 NaF(376 Da)16,27 및 고분자량, 즉 FD20(20 kDa)27의 BBB 완전성 마커를 사용하여 측정된 낮은 반세포 투과성 계수와 상관관계가 있다. 측정된 값은 ECs23,24,28의 정확한 소스를 사용하여 검증된 BBB in vitro 모델과 비교할 수 있습니다. 전체적으로, 이러한 결과는 생체 내 BBB의 특징 인 삼중 배양 BLEC 단층의 낮은 paracellular 투과성을 강조합니다. 또한, BLECs에서의 R123 세포 내 축적은 유출 펌프 억제제 Elacridar 23,24의 존재가 부재 한 대조군 조건에 비해 현저한 증가를 나타냈다 (그림 2C). 이것은 BLEC에서 활성 유출 펌프 분자, 즉 P-gp 및 BCRP의 존재를 나타냅니다.
BLECs를 추가로 특성화하기 위해 주요 BBB 기능의 유전자 발현 및 단백질 수준을 연구했습니다(그림 3). 삼중 배양 모델로 얻은 데이터는 대조군 모델로 사용된 ECs 및 pericytes24 로 구성된 검증되고 특허받은 공동 배양 모델과 비교되었습니다. 성상 세포는 삼중 배양 모델에서 초기 공동 배양 모델에 추가 된 세 번째 세포 유형을 나타냅니다. 따라서, 삼중 배양 BLECs의 유전자 발현 분석 (그림 3A)은 공동 배양 BLECs와 비교하여 TJ 단백질 (claudin-5 및 zonula occludens-1) 및 유출 펌프 (P-gp 및 BCRP)와 같은 주요 BBB 기능의 발현 유지와 가장 많이 연구 된 BBB 수송 체 (포도당 수송 체 1) 및 수용체 (트랜스페린 수용체). 단백질 정량 데이터(도 3B)는 전사 결과와 일치하는 것으로 확인되었다. 전반적으로, 이들 데이터는 검증된 공동배양 모델과 유사한 삼중 배양 BLEC 층에서 BBB 특성의 양성 유도를 지지한다. 전체적으로 삼중 배양 모델은 BBB를 모델링하기 위해 시험관 내 미세생리학적 시스템에 필요한 물리적 및 대사적 특성을 표시합니다.
약물 전달 전략에 대한 적용 가능성 - 나노겔 수송 측정 새로운 뇌 전달 전략을 연구하기 위해 삼중 배양 모델을 사용할 가능성을 평가하기 위해 형광 태그가 부착 된 NIPAM 기반 중성 NG의 수송이 6,15로 평가되었습니다. 시간 0에서, NG는 0.1 mg / mL의 농도로 내강 구획에 배치되었다 (그림 4A). 24 시간의 배양 후, NG의 5.82 %가 abluminal 구획 (그림 4B)에서 발견되어 BLEC를 가로 지르는 능력을 입증했습니다.
결과는 무결성 마커로 설명된 대로 작고 큰 화합물의 투과성을 측정하고 고분자 NG와 같은 나노 물질의 수송을 평가하는 모델의 적합성을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig01.jpg"> 그림 1: 인간 BBB의 삼중 배양 시험 관내 모델의 설정을 위한 중요한 단계의 표현 . (A) BBB 모델의 세 가지 세포 구성 요소 인 내피 세포 (EC), 혈관 주위 세포 (PC) 및 성상 세포 (AC)의 위상차 이미지. 스케일 바 = 250 μm. (B) 삼중 배양 인간 BBB in vitro 모델의 설정을 위한 개략도 및 예시적인 타임라인. 강조 표시된 상자는 반전된 인서트 필터의 코팅 절차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig02.jpg"> 그림 2: 삼중 배양 BBB 모델의 특성 평가. (A) BLE (Claudin-5 : CLD5, Zona Occludens-1 : ZO1 및 VE- Cadherin : Ve-Cadh), 혈관 주위 세포 (혈소판 유래 성장 인자 수용체 -β : PDGFR-β 및 데스 민) 및 성상 세포 (Glial 섬유소 산성 단백질 : GFAP)에 대한 고유 한 마커의 대표적인 면역 염색 이미지. 스케일 바 = 10 μm. (B) 형광 BBB 무결성 마커, 나트륨 플루오레세인 (NaF, 376 Da, Pe : 0.61 ± 0.062) 및 FITC- 덱스 트란 (FD20, 20 kDa, Pe : 0.04 ± 0.005)에 대한 BLECs의 세포 투과성. N = 3; n = 9. 평균 ± SEM. (C) ECs에서의 P-gp 및 BCRP 기능성은 엘라크리다르가 있는 세포내 R123(124.2% ± 3.39%)과 없는 것(100% ± 8.79%)을 정량화함으로써 평가하였다. N = 4; n = 12. 평균± SEM. p = 0.017(쌍체되지 않은 t-검정 사용). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig03.jpg"> 그림 3: 공동 배양 BBB 모델과 비교한 삼중 배양 모델에서 BLEC 유전자 발현 및 특유의 마커의 단백질 수준 평가. (A) RPLP0의 발현에 의해 정규화 된 단단한 접합 단백질 (Claudin-5 : CLD5 및 Zona Occludens-1 : ZO1), 수송 체 (포도당 수송 체 -1 : GLUT1, P- 당 단백질 : PGP 및 유방암 저항성 단백질 : BCRP) 및 큰 분자 수용체 (트랜스페린 수용체 : TRFR)의 유전자 발현. N = 3; n = 9. (B) β- 액틴의 발현에 의해 표준화 된 단단한 접합 단백질 (CLD5 및 ZO1), 수송 체 (GLUT1, PGP 및 BCRP) 및 큰 분자 수용체 (TRFR)의 단백질 수준. N = 3; n = 9. SEM± 평균. (A) 및 (B)의 경우, 값 &gt;1은 삼중 배양 모델에서 더 높은 유전자 발현 또는 단백질 수준에 대응한다. 빨간색 선은 두 모델의 발현 수준(유전자 또는 단백질)이 동일한 값 1에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig04.jpg"> 그림 4: 삼중 배양 모델에서 나노겔 수송 측정. (A) 나노겔 수송 분석의 개략적 표현. (B) 삼중 배양 모델에서 배양 24시간 후 나노겔 수송 비율(5.82% ± 0.09%). N = 2; n = 6. SEM± 의미합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2" rowspan="2">버퍼의 이름</td>
			<td colspan="3">구성</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">메모</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>분자량</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">인산염 완충 식염수, 칼슘 마그네슘 프리</td>
			<td rowspan="5">PBS-CMF</td>
			<td>나트륨</td>
			<td>8 g / L</td>
			<td>58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="5">모든 화합물을 멸균 수에 넣고 완전히 용해 될 때까지 기다리십시오. 수득된 용액의 pH는 7.3-7.4의 범위여야 한다. 0.22 μm 멤브레인을 사용하여 용액을 여과하고 멸균 용액을 4°C에서 보관한다.</td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>0.2 g / L</td>
			<td>74.55</td>
		</tr><tr><td>KH2PO4</td>
			<td>0.2 g / L</td>
			<td>136.09</td>
		</tr><tr><td>NaHPO4-12 H2O</td>
			<td>2.87 g / L</td>
			<td>358.14</td>
		</tr><tr><td>물</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="8">링거 헤페스</td>
			<td rowspan="8">상대습도</td>
			<td>나트륨</td>
			<td>8.8 g / 리터</td>
			<td>58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="8">모든 화합물을 멸균 수에 첨가하고 완전히 용해 될 때까지 기다리십시오. pH를 7.4로 조정합니다(시작 용액 pH 약 6.8). 0.22 μm 멤브레인을 사용하여 용액을 여과하고 멸균 용액을 4°C에서 보관한다.</td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>0.387 g / L</td>
			<td>74.55</td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>0.244 g / L</td>
			<td>110.99</td>
		</tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td>
			<td>0.0406 g / L</td>
			<td>203.3</td>
		</tr><tr><td>나HCO3</td>
			<td>0.504 g / L</td>
			<td>84.1</td>
		</tr><tr><td>헤페스</td>
			<td>1.19 g / L</td>
			<td>238.3</td>
		</tr><tr><td>포도당</td>
			<td>0.504 g / L</td>
			<td>180.16</td>
		</tr><tr><td>물</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>표 1: 프로토콜에 사용된 다양한 버퍼의 조성.

이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

뇌로의 약물 전달은 여전히 어려운 과제였습니다. 뇌로의 전달을 개선하기 위한 새로운 나노 물질의 대형 패널의 개발은 전임상 분석 프레임에서 뇌 침투를 예측하기 위한 실제 시험관 내 마이크로시스템의 필요성을 강조합니다. 이 기술의 주요 이점은 혈액 뇌 장벽 표현형의 유도에 필요한 세포 통신을 허용하는 동일한 시스템 내부의 혈액 뇌 장벽의 자유 통증 세포 실제를 얼음으로 만드는 것입니다.또한 각 세포 유형을 별도로 분리하여 추가 분자 분석을 수행할 수 있습니다. 이 모델은 건강 및 병리학 적 조건에서 광범위한 실험에 사용될 수 있으며 분자 및 입자 수송의 전임상 평가뿐만 아니라 세포 간 및 세포 내 트래피킹에 유용한 도구를 나타냅니다. 절차를 시연하는 것은 Dr.Clemence Deligne과 Dr.Eleonora Rizzi입니다.평방 센티미터 당 2 마이크로 그램의 500 마이크로 리터 Poly-L- 라이신 용액으로 웰을 코딩하여 시작하십시오. 밤새 또는 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 배양하고 흡인 시스템에 연결된 유리 피펫으로 Poly-L-Lysine 용액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 멸균 된 물로 두 번 헹굽니다.성상 세포를 수집하려면 먼저 10 밀리리터의 따뜻한 1X PBS CMF로 성상 세포를 한 번 씻으십시오. 5 % 이산화탄소와 21 % 산소 하에서 섭씨 37도에서 따뜻한 20 % 트립신 EDTA 용액 10 밀리리터로 3 분 동안 배양하십시오. 플라스크에서 세포를 기계적으로 분리하고 현탁액을 5 밀리리터의 따뜻한 희석되지 않은 FCS가 들어있는 원추형 튜브로 옮깁니다.현탁액을 섭씨 20도에서 5분 동안 190배 G로 원심분리합니다. 5 밀리리터의 따뜻한 성상 세포 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁 한 다음 20 마이크로 리터의 세포 현탁액을 80 마이크로 리터의 1X PBS CMF로 희석합니다. 현미경 하에서 수동 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.각 Poly-L-Lysine에서 평방 센티미터 당 약 40, 000 개의 세포를 1.5 밀리리터의 따뜻한 성상 세포 배지로 미리 코딩 된 상태로 플레이트합니다. 되돌린 인서트 필터를 덮은 25mm 높이의 접시 주변에 놓고 인서트 필터에 250마이크로리터의 콜라겐 유형 1 용액을 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.그런 다음 흡인 시스템에 연결된 유리 피펫으로 콜라겐 유형 1 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 실온에서 250 마이크로 리터의 DMEM 고혈당으로 두 번 세척하고 삽입 필터에서 모든 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 10 밀리리터의 따뜻한 1X PBS CMF로 pericytes를 두 번 씻고 2 밀리리터의 따뜻한 트립신으로 세포를 배양하십시오.트립신의 작용을 모니터링하기 위해 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 세포가 분리되기 시작하면 트립신을 제거한 다음 5 밀리리터의 따뜻한 내피 세포 기저 배지 또는 ECM을 세포에 추가하고 기계적 해리를 시작합니다. 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 80 마이크로리터의 1X PBS CMF로 희석하고, 이전에 도시된 바와 같이 현미경 하에 수동 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수한다.시드 44, 센티미터 제곱당 500 셀을 250 마이크로리터의 부피로 미리 코딩된 되돌린 삽입 필터에 배치한다. 인서트 필터를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 5%이산화탄소와 21%산소 하에서 3시간 동안 보관하십시오. 멸균 핀셋을 사용하여 삽입 필터를 웰당 1.5ml의 따뜻한 ECM이 들어 있는 12웰 플레이트로 조심스럽게 되돌립니다.이제 인서트 필터를 반대쪽에 코팅할 준비가 되었습니다. 상부 및 삽입 필터를 500 마이크로리터의 세포외 매트릭스 기반 하이드로겔로 코팅한다. 인서트 필터를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 넣고 5%이산화탄소와 21%산소 아래에서 한 시간 동안 둡니다.실온에서 500 마이크로 리터의 DMEM 고혈당으로 한 번 씻으십시오. 내피 세포 배양액을 10 밀리리터의 따뜻한 1X PBS CMF로 한 번 세척하고 2 밀리리터의 따뜻한 트립신으로 세포를 배양합니다. 세포가 분리되기 시작하면 트립신을 제거한 다음 5 밀리리터의 따뜻한 ECM을 추가하고 기계적 해리를 시작하십시오.20 마이크로리터의 세포 현탁액을 80 마이크로리터의 1X PBS CMF로 희석하고, 수동 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수한다. 내피 세포를 500 마이크로 리터의 따뜻한 ECM의 부피로 미리 코딩 된 삽입 필터에 센티미터 당 71, 500 세포의 밀도로 시드합니다. 성상 세포 배지를 우물 당 1.5 밀리리터의 따뜻한 ECM으로 교체하십시오.그런 다음 시드 된 삽입 필터를 성상 세포가 들어있는 우물로 옮깁니다. 트라이 배양 세포 시스템을 5%이산화탄소 및 21% 산소 아래 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 넣습니다. 흡인 시스템과 연결된 유리 피펫을 사용하여 상부 및 하단 구획에서 매체를 조심스럽게 제거하십시오.매체를 상부 구획에 500 마이크로 리터, 하단 구획에 1.5 밀리리터의 따뜻한 ECM으로 교체하십시오. 동일한 절차를 반복하여 6일째까지 격일로 배지를 갱신합니다. 마지막으로 세포를 5 % 이산화탄소와 21 % 산소의 밑에 섭씨 37 도의 가습 인큐베이터로 다시 넣으십시오.면역세포화학 데이터는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 및 혈관주위세포에 대한 데스민, 성상교세포에 대한 신경교 섬유소 산성 단백질과 같은 기존 마커의 발현을 확인했습니다. 따라서 혈관주위세포 및 성상교세포와 함께 6일 동안 배양한 후 Ve-Cadherin의 부착 접합 염색으로 시각화된 뇌와 같은 내피 세포 또는 BLEC의 단층은 세포 경계에서 TJ 단백질 CLD5 및 Z-01의 연속 국소화를 표시합니다. 형광 BBB 무결성 마커, 나트륨 플루오레세인 및 FITC 덱스트란에 대한 BLECS의 세포내 투과성이 여기에 표시됩니다.BLECs에서의 R123 세포내 축적은 그의 부재를 갖는 대조군 조건과 비교하여 유출 펌프 억제제 엘라크리다르의 존재에서 유의한 증가를 나타내었다. 이것은 BLEC에서 활성 유출 펌프 분자, 즉 P 당 단백질 및 유방암 저항성 단백질 또는 BCRP의 존재를 나타냅니다. RPLP0의 발현에 의해 정규화 된 단단한 접합 단백질, 수송 체 및 큰 분자 수용체의 유전자 발현이 여기에 표시됩니다.여기서, 1보다 큰 값은 삼중 배양 모델에서 더 높은 유전자 발현에 해당한다. 빨간색 선은 두 모델의 표현식 수준이 동일한 1의 값에 해당합니다. 대표적인 이미지는 베타 액틴의 발현에 의해 정규화 된 큰 분자 수용체에서 단단한 접합 단백질, 수송 체의 단백질 수준을 보여줍니다.형광 태그된 NIPAM 기반 중성 고분자 나노겔의 수송을 평가하였다. 시간 0에서, 중합체성 나노 겔을 밀리리터당 0.1 밀리그램의 농도로 내강 구획에 배치하였다. 24 시간의 배양 후, 고분자 나노 겔의 5.82 %가 BLECs를 가로 지르는 능력을 입증하는 abluminal 구획에서 발견되었습니다.되돌린 필터에서 pericytes의 올바른 코팅 및 파종은 매우 중요합니다. 중요한 것은 세포 배양 시스템의 오염을 피하기 위해 구조물의 무균성 및 완전성을 유지하는 것이다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 인간의 뇌 주위 세포, 성상 세포 및 내피 세포의 공동 배양을 보여줍니다. 각 세포층은 개별적으로 형성된 다음 함께 배양되어 혈액-뇌 장벽의 세포 배열을 모방한 3층 시스템을...

인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 세포 배양 모델 개발

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

맥락막신경총(CP)의 상피 세포는 혈액-뇌척수액 장벽(BCSFB)을 형성합니다. BCSFB의 시험관 내 모델은 인간 맥락막 신경총 유두종(HIBCPP) 세포를 사용합니다. 이 기사에서는 세포 배양 필터 삽입 시스템을 사용한 HIBCPP 세포의 배양 및 기저측 감염에 대해 설명합니다.

인간의 혈액 - 뇌척수액 장벽의 맥락총 상피 세포 기반 모델은 기저 측면에서 세균 감염을 연구하는

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

우리는 루시퍼 옐로우 (LY)가 hCMEC/D3 세포 단층의 명백한 paracellular 투과성을 결정하는 강력한 마커, 인간 혈액 뇌 장벽의 체외 모델임을 입증하기 위해 형광 분석방법을 제시합니다. 우리는 배양 된 hCMEC / D3 세포에서 동시 단일 층 형성의 역학을 결정하기 위해이 분석기를 사용했습니다.

루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커

여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.

병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델

인간의 혈액-뇌 장벽은 선택적으로 친수성 분자와 병원체가 뇌에 침투하는 것을 방지합니다. 수막염과 수술 후 정신 착란을 포함한 여러 가지 병리는 혈액 - 뇌 장벽의 침투성 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 우리는 미생물 통과에 의한 장벽 투과성을 시험하기 위해 내피 세포 배양 모델을 기술한다.

미세 혈관 내피 세포를 통해 미생물 통과에 의해 혈액 - 뇌 장벽의 투과성 분석

여기에서는 일차 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포, 성상 세포 및 혈관 주위 세포를 기반으로 혈액 뇌 장벽의 삼중 세포 배양 모델을 구축하는 방법을 설명합니다. 이 다세포 모델은 시험관 내 허혈성 뇌졸중 중 신경 혈관 단위 기능 장애의 연구 또는 약물 후보의 스크리닝에 적합합니다.

시험관 내 허혈성 뇌졸중 연구를 위한 인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 일차 세포 배양 모델

이 보고서는 혈액-뇌 장벽 모델 구축을 위한 μSiM 플랫폼의 조립, 세포 배양 및 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

배우세요 인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템을 구축하는 방법을. 내피세포, 주변세포, 성상아교세포를 활용하여 약물 전달 및 나노입자 수송 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

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