인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

뇌로의 약물 전달은 여전히 어려운 과제였습니다. 뇌로의 전달을 개선하기 위한 새로운 나노 물질의 대형 패널의 개발은 전임상 분석 프레임에서 뇌 침투를 예측하기 위한 실제 시험관 내 마이크로시스템의 필요성을 강조합니다. 이 기술의 주요 이점은 혈액 뇌 장벽 표현형의 유도에 필요한 세포 통신을 허용하는 동일한 시스템 내부의 혈액 뇌 장벽의 자유 통증 세포 실제를 얼음으로 만드는 것입니다.

또한 각 세포 유형을 별도로 분리하여 추가 분자 분석을 수행할 수 있습니다. 이 모델은 건강 및 병리학 적 조건에서 광범위한 실험에 사용될 수 있으며 분자 및 입자 수송의 전임상 평가뿐만 아니라 세포 간 및 세포 내 트래피킹에 유용한 도구를 나타냅니다. 절차를 시연하는 것은 Dr.Clemence Deligne과 Dr.Eleonora Rizzi입니다.

평방 센티미터 당 2 마이크로 그램의 500 마이크로 리터 Poly-L- 라이신 용액으로 웰을 코딩하여 시작하십시오. 밤새 또는 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 배양하고 흡인 시스템에 연결된 유리 피펫으로 Poly-L-Lysine 용액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 멸균 된 물로 두 번 헹굽니다.

성상 세포를 수집하려면 먼저 10 밀리리터의 따뜻한 1X PBS CMF로 성상 세포를 한 번 씻으십시오. 5 % 이산화탄소와 21 % 산소 하에서 섭씨 37도에서 따뜻한 20 % 트립신 EDTA 용액 10 밀리리터로 3 분 동안 배양하십시오. 플라스크에서 세포를 기계적으로 분리하고 현탁액을 5 밀리리터의 따뜻한 희석되지 않은 FCS가 들어있는 원추형 튜브로 옮깁니다.

현탁액을 섭씨 20도에서 5분 동안 190배 G로 원심분리합니다. 5 밀리리터의 따뜻한 성상 세포 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁 한 다음 20 마이크로 리터의 세포 현탁액을 80 마이크로 리터의 1X PBS CMF로 희석합니다. 현미경 하에서 수동 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.

각 Poly-L-Lysine에서 평방 센티미터 당 약 40, 000 개의 세포를 1.5 밀리리터의 따뜻한 성상 세포 배지로 미리 코딩 된 상태로 플레이트합니다. 되돌린 인서트 필터를 덮은 25mm 높이의 접시 주변에 놓고 인서트 필터에 250마이크로리터의 콜라겐 유형 1 용액을 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.

그런 다음 흡인 시스템에 연결된 유리 피펫으로 콜라겐 유형 1 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 실온에서 250 마이크로 리터의 DMEM 고혈당으로 두 번 세척하고 삽입 필터에서 모든 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 10 밀리리터의 따뜻한 1X PBS CMF로 pericytes를 두 번 씻고 2 밀리리터의 따뜻한 트립신으로 세포를 배양하십시오.

트립신의 작용을 모니터링하기 위해 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 세포가 분리되기 시작하면 트립신을 제거한 다음 5 밀리리터의 따뜻한 내피 세포 기저 배지 또는 ECM을 세포에 추가하고 기계적 해리를 시작합니다. 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 80 마이크로리터의 1X PBS CMF로 희석하고, 이전에 도시된 바와 같이 현미경 하에 수동 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수한다.

시드 44, 센티미터 제곱당 500 셀을 250 마이크로리터의 부피로 미리 코딩된 되돌린 삽입 필터에 배치한다. 인서트 필터를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 5%이산화탄소와 21%산소 하에서 3시간 동안 보관하십시오. 멸균 핀셋을 사용하여 삽입 필터를 웰당 1.5ml의 따뜻한 ECM이 들어 있는 12웰 플레이트로 조심스럽게 되돌립니다.

이제 인서트 필터를 반대쪽에 코팅할 준비가 되었습니다. 상부 및 삽입 필터를 500 마이크로리터의 세포외 매트릭스 기반 하이드로겔로 코팅한다. 인서트 필터를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 넣고 5%이산화탄소와 21%산소 아래에서 한 시간 동안 둡니다.

실온에서 500 마이크로 리터의 DMEM 고혈당으로 한 번 씻으십시오. 내피 세포 배양액을 10 밀리리터의 따뜻한 1X PBS CMF로 한 번 세척하고 2 밀리리터의 따뜻한 트립신으로 세포를 배양합니다. 세포가 분리되기 시작하면 트립신을 제거한 다음 5 밀리리터의 따뜻한 ECM을 추가하고 기계적 해리를 시작하십시오.

20 마이크로리터의 세포 현탁액을 80 마이크로리터의 1X PBS CMF로 희석하고, 수동 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수한다. 내피 세포를 500 마이크로 리터의 따뜻한 ECM의 부피로 미리 코딩 된 삽입 필터에 센티미터 당 71, 500 세포의 밀도로 시드합니다. 성상 세포 배지를 우물 당 1.5 밀리리터의 따뜻한 ECM으로 교체하십시오.

그런 다음 시드 된 삽입 필터를 성상 세포가 들어있는 우물로 옮깁니다. 트라이 배양 세포 시스템을 5%이산화탄소 및 21% 산소 아래 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 넣습니다. 흡인 시스템과 연결된 유리 피펫을 사용하여 상부 및 하단 구획에서 매체를 조심스럽게 제거하십시오.

매체를 상부 구획에 500 마이크로 리터, 하단 구획에 1.5 밀리리터의 따뜻한 ECM으로 교체하십시오. 동일한 절차를 반복하여 6일째까지 격일로 배지를 갱신합니다. 마지막으로 세포를 5 % 이산화탄소와 21 % 산소의 밑에 섭씨 37 도의 가습 인큐베이터로 다시 넣으십시오.

면역세포화학 데이터는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 및 혈관주위세포에 대한 데스민, 성상교세포에 대한 신경교 섬유소 산성 단백질과 같은 기존 마커의 발현을 확인했습니다. 따라서 혈관주위세포 및 성상교세포와 함께 6일 동안 배양한 후 Ve-Cadherin의 부착 접합 염색으로 시각화된 뇌와 같은 내피 세포 또는 BLEC의 단층은 세포 경계에서 TJ 단백질 CLD5 및 Z-01의 연속 국소화를 표시합니다. 형광 BBB 무결성 마커, 나트륨 플루오레세인 및 FITC 덱스트란에 대한 BLECS의 세포내 투과성이 여기에 표시됩니다.

BLECs에서의 R123 세포내 축적은 그의 부재를 갖는 대조군 조건과 비교하여 유출 펌프 억제제 엘라크리다르의 존재에서 유의한 증가를 나타내었다. 이것은 BLEC에서 활성 유출 펌프 분자, 즉 P 당 단백질 및 유방암 저항성 단백질 또는 BCRP의 존재를 나타냅니다. RPLP0의 발현에 의해 정규화 된 단단한 접합 단백질, 수송 체 및 큰 분자 수용체의 유전자 발현이 여기에 표시됩니다.

여기서, 1보다 큰 값은 삼중 배양 모델에서 더 높은 유전자 발현에 해당한다. 빨간색 선은 두 모델의 표현식 수준이 동일한 1의 값에 해당합니다. 대표적인 이미지는 베타 액틴의 발현에 의해 정규화 된 큰 분자 수용체에서 단단한 접합 단백질, 수송 체의 단백질 수준을 보여줍니다.

형광 태그된 NIPAM 기반 중성 고분자 나노겔의 수송을 평가하였다. 시간 0에서, 중합체성 나노 겔을 밀리리터당 0.1 밀리그램의 농도로 내강 구획에 배치하였다. 24 시간의 배양 후, 고분자 나노 겔의 5.82 %가 BLECs를 가로 지르는 능력을 입증하는 abluminal 구획에서 발견되었습니다.

되돌린 필터에서 pericytes의 올바른 코팅 및 파종은 매우 중요합니다. 중요한 것은 세포 배양 시스템의 오염을 피하기 위해 구조물의 무균성 및 완전성을 유지하는 것이다.