Brefeldin A Injection에 의한 신장에서 분비되는 단백질의 출처 확인

우리의 기술을 통해 손상된 신장에서 사이토카인 생성 세포의 출처와 상대적 기여도를 식별할 수 있습니다. Brefeldin A를 사용하여 단백질 분비를 방지하면 세포 유형 및 이러한 세포의 상태와 같은 고형 기관에서 사이토카인을 생성하는 세포에 대한 더 많은 정보를 수집할 수 있습니다.

우리의 프로토콜은 많은 장기 시스템에 쉽게 적용할 수 있어야 합니다. Brefeldin A는 세포 투과성 소분자이기 때문에 대부분의 세포 유형에서 분비를 억제하여 사이토카인 및 기타 분비 단백질을 검출할 수 있습니다.

꼬리뼈 주사는 쥐의 꼬리뼈가 매우 작기 때문에 기술적으로 가장 어려운 단계입니다. 실험 동물에 대한 프로토콜을 수행하기 전에 이 단계를 연습하는 것이 좋습니다.

[강사] 마우스가 따뜻한지 확인하기 위해 케이지를 가열 패드에 반, 반은 10분 동안 놓는 것부터 시작합니다. 마우스를 구속 장치에 넣은 후 포비돈 요오드와 알코올 면봉을 사용하여 꼬리를 세 번 소독합니다. 꼬리를 수평으로 잡고 측면 꼬리 정맥을 시각화합니다. 그런 다음 바늘과 주사기를 머리 방향으로 정맥과 평행하게 유지하면서 28게이지 바늘을 삽입합니다. 밀리리터당 1.25밀리그램의 BFA 용액 200마이크로리터를 주입합니다. 혈액이 주사액으로 대체되면 정맥이 깨끗해져야 합니다. 그런 다음 바늘을 제거하고 출혈이 멈출 때까지 꼬리를 부드럽게 누릅니다. 쥐를 케이지로 되돌리고 추가 출혈이나 고통의 징후가 있는지 모니터링합니다. 20밀리리터 주사기를 사용하고 관류액이 투명해질 때까지 분당 2-4밀리리터의 유속으로 좌심실을 통해 10-20밀리리터의 PBS로 마우스를 관류합니다. 신장 동맥과 정맥을 유두 가까이에 대고 신장에서 멀어지는 쪽의 혈관을 절단하여 신장을 제거합니다. 그런 다음 손으로 또는 한 쌍의 미세한 멸균 겸자로 신장 캡슐을 벗겨 부드럽게 제거합니다. 소수성 장벽 마커 펜을 사용하여 조직에서 소수성 장벽 윤곽선까지 최소 5mm의 거리를 유지하면서 조직 절편의 윤곽을 그립니다. 그런 다음 섹션 위에 1% 소 혈청 알부민 TBS에 3% 당나귀 혈청과 0.1% 트리톤을 함유한 50마이크로리터의 차단 완충액을 추가합니다. 가습 챔버에서 한 시간 동안 실온을 배양합니다. 1차 항체를 적절한 농도의 PBS로 희석합니다. 사이토카인을 검출하려면 TGF 베타 1, PDGF-D 또는 CTGF에 대한 항체를 50마이크로리터의 PBS에 희석합니다. Cy3와 접합된 항-알파 SMA 1차 항체를 1차 항체 용액에 1:200 희석으로 첨가하여 근섬유아세포를 표지합니다. 차단 완충액을 제거하고 1차 항체를 절편에 추가하여 원형 소수성 윤곽선 밖으로 누출되지 않도록 합니다. 가습된 챔버에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 인큐베이터에서 가습 챔버를 제거하고 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세 번 세척합니다. 다음으로, 적절한 2차 항체를 PBS로 1에서 200으로 희석합니다. 가습 챔버에서 실온에서 1시간 동안 샘플을 50마이크로리터의 2차 항체 용액과 함께 배양합니다. 가습 챔버에서 슬라이드를 제거하고 PBS로 5분 동안 세척합니다. PBS에서 플루오레세인과 접합된 연꽃 테트라고놀로부스 렉틴을 칼슘 및 마그네슘과 밀리리터당 10마이크로그램의 농도로 희석합니다. 그런 다음 조직을 50마이크로리터의 LTL 용액과 함께 가습 챔버에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 가습 챔버에서 슬라이드를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS로 5분 동안 세척합니다. 조직을 50마이크로리터의 DAPI와 함께 배양하여 실온에서 5분 동안 DNA 핵을 염색합니다. PBS로 한 번 세탁하십시오. 20마이크로리터의 퇴색 방지 마운팅 시약을 조직에 추가하여 커버 슬립을 장착한 다음 커버 슬립을 천천히 놓습니다. 이미징하기 전에 퇴색 방지 시약이 응고될 때까지 24시간 동안 기다리십시오. 자동 XY 스테이지가 있는 도립 현미경을 켜고 20x 대물렌즈를 선택합니다. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 조직 절편을 찾습니다. 그런 다음 이미지 획득 소프트웨어를 열고 라이브를 클릭하여 라이브 뷰 창을 엽니다. 초점이 맞는지 확인하는 조직 절편을 찾으십시오. 획득 메뉴를 클릭하고 큰 이미지 스캔을 선택합니다. 조이스틱을 사용하여 스테이지를 조직 섹션의 가장 왼쪽 부분으로 이동한 다음 왼쪽 화살표를 클릭하여 스캔할 영역을 설정합니다. 맨 위, 맨 오른쪽 및 맨 아래 조직 세그먼트에 대해 이 작업을 반복합니다. 획득 메뉴를 클릭하고 다중 채널 캡처 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다. 다중 채널 이미지를 캡처하려면 람다 탭을 클릭하고 각 채널을 클릭한 다음 노출 시간을 이미지의 어떤 부분도 포화시키지 않고 얼룩이 분명한 수준으로 설정합니다. 수집할 각 채널에 대해 이 작업을 반복합니다. 그런 다음 스캔을 클릭합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 열고 파일을 클릭합니다. 그런 다음 열기를 클릭하고 이미지를 선택합니다. 이미지 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 다각형 ROI를 선택합니다. 자유형 도구로 ROI를 개략적으로 설명하세요. 그런 다음 LTL 양성 세뇨관 세포 또는 알파 SMA 양성 간질 세포의 윤곽을 그립니다. 측정 탭을 클릭한 다음 임계값을 클릭합니다. 양극 신호 영역의 양쪽으로 슬라이더를 조정하여 임계값 상한과 하한을 설정합니다. 그런 다음 ROI 탭을 클릭합니다. 마지막으로 내보내기 아이콘을 클릭하여 값을 저장합니다. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 ROI 영역별 양의 신호 영역의 백분율을 계산합니다.

[발표자] 시스플라틴 또는 식염수 투여 후 3일째의 TGF 베타 양성 소포가 대표 이미지에 표시됩니다. TGF 베타 양성 소포는 BFA가 있는 시스플라틴 처리 신장에서 LTL로 표지된 PTC에서 관찰됩니다. 그러나 이러한 소포는 손상되지 않았거나 BFA가 치료되지 않은 신장에서는 관찰되지 않았습니다.

[강사] 수정은 시스플라틴 유발 급성 신장 손상에서 BFA 치료로 TGF 베타 양성 영역의 증가를 보여주었습니다. TGF 베타와 유사하게 PTGF-D 양성 또는 CTGF 양성 소포도 시스플라틴 유도 AKI에서 BFA 치료로 축적되었습니다. 정량화는 PDGF-D 양성 및 CTGF 양성 영역도 BFA로 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. LTL 양성 근위 세뇨관 세포에서 BFA 주사는 시스플라틴 주사 후 3일째에 혈장 BUN 수치를 유의하게 증가시키지 않았습니다. TGF 베타 양성 소포는 BFA 처리를 받은 시스플라틴 AKI의 알파 SMA 표지 간질 세포에서 관찰되었습니다. 수정 결과 알파 SMA 양성 영역의 TGF 베타 양성 영역이 시스플라틴 AKI에서 BFA 치료로 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. TGF 베타 양성 소포와 유사하게 CTGF 양성 소포도 BFA 치료로 증가했습니다. 정량화는 BFA 치료가 시스플라틴 유도 AKI에서 알파 SMA 양성 면적에 대한 CTGF 양성 면적의 비율을 향상시킨다는 것을 입증했습니다. 시스플라틴 유발 손상과 비교하여 PTC의 TGF-베타 양성 소포는 AA의 만성기에서 훨씬 작았습니다. LTL 양성 PTC에서는 최소한의 양성 염색이 있었습니다. 그러나 신장 손상 분자 1 양성 PTC에서 TGF 베타의 신호 강도는 BFA 치료로 증가했습니다. TGF 베타의 평균 강도 수준은 BFA가 없는 경우보다 BFA 주사를 맞이한 경우 3배 더 높았습니다.

가장 중요한 단계는 꼬리 정맥 주사가 성공적인지 확인하는 것입니다. 주입에 실패하면 결과가 흐트러질 수 있습니다. 그러니 주사로 정맥이 맑아지는 것과 같은 성공의 징후를 찾고, 꼬리 위로 부어오르는 것과 같은 실패의 징후를 찾아보세요.

Brefeldin A 주사는 장기 또는 단일 세포 규모에서 사이토카인 생산을 평가하기 위해 웨스턴 블롯 또는 유세포 분석을 포함한 여러 분석과 결합될 수 있습니다.

이 기술을 사용하여 이전에는 다른 세포 유형에서 유래하는 것으로 생각되었던 신장 상피 세포에서 분비되는 새로운 사이토카인을 식별할 수 있었습니다. 이는 특정 세포 유형의 손상 기여에 대한 오랜 논쟁을 해결하는 데 사용될 수 있습니다.