Name: 핵자기공명분광법에 의한 아르기닌 메틸롬 탐구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 학습하세요 핵자기공명분광법을 이용한 아르기닌 메틸화 정량 분석 방법을 세포와 조직 등 다양한 생물학적 샘플에 적용하여 질병 바이오마커 연구에 활용하는 기술입니다.

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이 연구는 오스트리아 과학 기금 (FWF) 보조금 P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (주력 프로젝트 DYNIMO), 오스트리아 연구 진흥 기관 (FFG) 보조금 864690 및 870454, 통합 대사 연구 센터 그라츠; 오스트리아 인프라 프로그램 2016/2017, 스티 리아 정부 (Zukunftsfonds) 및 복건 의과 대학의 고급 인재를위한 스타트 업 펀드 (XRCZX2021020). 세포 배양 시설에 대한 접근을 위해 의료 연구 센터에 감사드립니다. F.Z.는 그라츠 의과 대학의 분자 의학 박사 프로그램 프레임 내에서 교육을 받았습니다. Q.Z.는 그라츠 의과 대학의 대사 및 심혈관 질환 박사 프로그램의 틀 내에서 교육을 받았습니다.

효모 단백질 가수분해물을 본 연구의 대표적인 결과를 위한 샘플로 사용하였다. 전체 프로토콜은 그림 1에 요약되어 있습니다.
1. 재료 및 시약의 제조
<ol><li>메탄올 / 물 : 99 % 메탄올 (MeOH) 2 부분과 MeOH / H2O로 지정된 H 2 O 1 부분의 혼합물을 준비합니다. 알코올 증발을 최소화하고 샘플 안정성을 높이기 위해 -20 ° C에서 순수한 MeOH 및 MeOH / H2O를 보관하십시오.</li>
	<li>염산 (HCl) : 농축 HCl (12.0 mol / L 또는 37 %)과 0.1 mol / L의 HCl에서 9 mol / L를 희석하십시오. 고농축(9mol/L) 용액은 단백질 가수분해에 사용되는 반면 저농축(0.1mol/L) 용액은 고상 추출에 사용됩니다. 주의 : 흄 후드 내부에서 작업하십시오.</li>
	<li>포화 암모니아 용액 10%(재고: 암모니아 30% w/w), 메탄올 50% 및 물 40%(v/v)를 포함하는 SPE용 교체 용액을 준비합니다.</li>
	<li>NMR 완충액: 5.56g의 인산이나트륨(Na2HPO4, 0.08mol/L), 0.4g의 3-(트리메틸실릴)프로피온산-2,2,3,3-d4 나트륨염(TSP, 5mmol/L), 0.04%(w/v)의 아지드화나트륨(NaN3)을 이산화중수소(D2O) 500mL에 용해시키고 pH 7.4로 조정합니다(HCl 또는 NaOH, 각각)(재료 표 참조). 각각의 새로운 완충액 배치의 순도를 NMR 분광법으로 확인하였다. 알림: 오염 물질 (예 : 에탄올)의 양은 가능한 한 적어야합니다.</li>
	<li>펄프화 튜브를 산화 지르코늄 비드로 채웁니다(2mL 튜브 및 1.4mm 비드는 대부분의 응용 분야에 적합하지만 다양한 변형 가능)( 재료 표 참조). 손으로 약 10-20개의 구슬을 채우거나 미리 채워진 튜브를 구입하십시오.</li>
	<li>피펫과 각 팁을 10-1,000 μL 범위로 준비하십시오. 참고 : ≥18.2 MΩ · cm-1의 높은 저항으로 정의 된 H2O로 지정된 고순도의 물이 작업 전반에 걸쳐 사용되었습니다. 이중 증류수에 해당합니다.</li>
</ol>2. 샘플 수집 및 보관
<ol><li>액체 샘플(혈청/혈장, 세포 배양 상청액 등)을 액체 질소로 급속 동결하고 사용 전까지 -80°C에서 보관합니다.</li>
	<li>아래에 언급 된대로 고체 재료를 준비하십시오.<ol><li>부착 세포를 수집하거나, 차가운 인산염 완충 식염수로 세척하거나, 스크래핑 및 원심 분리하거나, 현탁액에서 성장한 세포를 직접 원심 분리하여 세포 배양 (3-5 백만 세포)에서 세포를 수집합니다.</li>
		<li>세포 상청액을 제거한 다음(추가 분석을 위해 수집될 수 있음, 연속 직접 측정, 6단계 참조 또는 가용성 단백질 침전 후 단계 3.1 참조) 펠릿을 액체 질소로 급속 동결하고 -80°C에서 저장합니다. 추가 처리는 3.2단계를 참조하십시오.</li>
		<li>연구 목적에 따라 조직을 저장하고 수집하십시오. 간이나 근육과 같은 매우 균질 한 조직의 경우 그 일부를 분석하십시오. 예를 들어, 마우스 뇌의 경우, 전체 뇌 또는 뇌 절편의 글로벌 아르기닌 메틸화를 결정한다. 알림: 처리 할 조직의 이상적인 무게는 30-60mg입니다. 뇌 전체를 동결시키고 분쇄하여 분취량을 사용하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 특정 뇌 부분(예를 들어, 전두엽, 소뇌, 후두 부위 또는 ~250mg의 한 반구)이 사용될 수 있다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 예비 샘플 준비
알림: MeOH를 차갑게 유지하면서 얼음 위에서 작업을 수행하십시오. 또한 단백질 분해를 방지하기 위해 샘플을 얼음 위에 보관해야 합니다.
<ol><li>액체 샘플의 경우 샘플 200μL에 얼음처럼 차가운 메탄올 400μL를 추가합니다. 3.3단계를 계속하십시오. 알림: 사용 가능한 샘플이 적으면 그에 따라 볼륨을 조정하십시오. NMR 감도는 일반적으로 더 적은 양의 샘플에 대해 충분히 높지만 개별적으로 테스트해야 합니다.</li>
	<li>고체 물질의 경우 용해물을 위한 충분한 1.5mL 튜브를 준비합니다(균질화 후 원심분리에 사용).<ol><li>조심스럽게, 그러나 철저하게, 600 μL의 MeOH / H2O에 세포 펠릿을 재현탁시키고 전체 액상을 펄프 화 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>조직을 펄프화 튜브에 넣고(튜브에 직접 무게를 잴 수 있음) 600μL의 MeOH/H2O를 추가합니다(30-60mg의 경우, 무게가 크게 다른 경우 조정).</li>
		<li>튜브를 조직 균질화기( 재료 표 참조)에 넣고 심하게 흔들어 20초 동안 한 번(세포 펠릿, 연조직의 경우) 또는 그 사이에 5분 간격으로 각각 20초 동안 두 번(또는 필요한 경우 더 길게) 균질화합니다(뻣뻣한 조직의 경우).</li>
		<li>균질화 후 즉시 샘플을 얼음에 다시 넣고 전체 용해물을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>추가 처리 전에 -20 ° C에서 최소 30 분 (최대 며칠) 동안 샘플을 보관하십시오.</li>
	<li>10,000 x g 에서 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리합니다. 그 동안 상청액을 수집하기에 충분한 1.5mL 튜브를 준비하십시오. 참고: 이 상청액(그림 1에서 "( 1)"로 지정됨)은 폐기, 동결건조 및 NMR을 위해 직접 처리되거나(6단계) 달리 분석될 수 있습니다.</li>
	<li>이 프로토콜에서 MeOH 침전물 (= 각각 3.1 단계 또는 3.2.2 단계 이후에 얻은 펠릿)은 핵산 및 지질, 아르기닌 메틸화 단백질과 같은 성분을 포함하는 추가 분석에 사용됩니다. 단백질 가수 분해를 계속하거나 펠릿을 -20 ° C에서 며칠 동안 보관하십시오.</li>
</ol>4. 단백질 가수 분해
<ol><li>각 샘플에 9 mol/L의 HCl 500 μL를 추가합니다. 그런 다음 가위로 각 튜브의 캡을 자르고 유리 배양 튜브에 넣습니다(그림 2A). 조심스럽게, 그러나 단단히 빨간 뚜껑을 닫으십시오 (따라서 밀봉을 점검하십시오). 알림: 사용하기 전에 항상 각 씰링(빨간색 나사 캡 내부의 회색 PTFE 호일)이 제대로 조여졌는지 확인하고 정기적으로 물로 청소하십시오.</li>
	<li>완료되면 튜브를 모래로 부분적으로 채워진 비커에 넣고 (더 나은 열 전달을 위해) 건조실에서 110 ° C에서 약 16 시간 동안 샘플을 가수 분해합니다.</li>
	<li>가수 분해 후 샘플을 냉각시킵니다 (~ 1 시간).</li>
	<li>그 후, 고진공 (100Pa 이하)의 원심 분리기를 사용하여 밤새 동결 건조한다.</li>
	<li>펠릿을 완전히 건조되면 (그렇지 않은 경우 동결 건조 계속) 1mL의 0.1 mol / L HCl에 녹이고 각 튜브에 50 μL의 클로로포름 (CHCl3)을 첨가합니다. 펠릿을 1,000 μL 피펫으로 완전히 용해시켜 액체를 혼합 한 다음 전체 부피를 새 튜브로 옮깁니다. 주의 : 광범위한 증발을 최소화하기 위해 항상 소량으로 작업하십시오.</li>
	<li>그런 다음 실온에서 10분 동안 8,000 x g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>수용성 분획 (그림 2B, 밀도가 낮은 분획)을 포함하는 이상성 액체의 상부 단계를 피펫으로 조심스럽게 수집하고 새 튜브에 채 웁니다. 수동 SPE(섹션 5.2)의 경우 1.5mL 튜브를 사용하거나 로봇 SPE의 경우 유리 바이알(섹션 5.3 및 그림 2D)을 사용하십시오. CHCl3 및 그 내용물에 유출되지 않도록 합니다(그림 2C).</li>
</ol>5. 고체상 추출 (SPE)
<ol><li>처음 사용하기 전에 1mL의 교체 용액으로 SPE 카트리지를 두 번 청소한 다음(1.3단계) 실온에서 800 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다(15mL 튜브에 넣음). 그들은 각각 10-20 번 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>수동 SPE<ol><li>매번 1mL의 순수 메탄올과 2 x 1mL의 PBS로 카트리지( 재료 표 참조)를 사전 조정한 다음 실온에서 1분 동안 800 x g 에서 원심분리합니다(15mL 튜브에 넣음).</li>
		<li>그런 다음 샘플(4.7단계)을 SPE 카트리지에 로드하고 실온에서 600 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>그런 다음 아래에 언급된 대로 세탁 주기를 적용하십시오.<ol><li>1 mL의H2O를 3회 첨가한다(각각 실온에서 800 x g 에서 1분 동안 원심분리).</li>
			<li>0.1 mol / L HCl 1 mL를 5 회 첨가 (각각 실온에서 800 x g 에서 1 분 동안 원심 분리).</li>
			<li>1mL의 MeOH를 2회 첨가한다(각각 실온에서 800 x g 에서 1분 동안 원심분리).</li>
		</ol></li>
		<li>그런 다음 아르기닌과 그 유도체를 3 x 1mL의 대체 용액으로 용출합니다(이어서 실온에서 800 x g 에서 1분 원심분리). 알림: 교체 용액은 아르기닌 및 유도체의 용리액 역할을 하며 카트리지 세척에도 사용됩니다(모든 물질은 용출 전 또는 교체 용액의 기본 pH 값에서 세척됨). 그러나 시간이 지남에 따라 오염을 방지하려면 재사용을 제한해야합니다 (5.1 단계 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>로봇 SPE 참고: 여기에서 피펫팅 로봇(피펫팅 바늘, 바늘용 세척 스테이션, 시약 공급, 샘플 및 용리액 위치로 구성된 주요 부품, 재료 표 참조)에는 SPE 컬럼용 카트리지 홀더가 제공됩니다. 다른 악기의 경우 나열된 모든 것을 완벽하게 갖추고 있는지 확인하십시오.<ol><li>PTFE 밀봉 (그림 2D)을 사용하여 상청액 (4.7 단계)을 유리 바이알에 직접 채우고 충분한 시약 (각각 100mL, 즉 대체 용액, 99 %의 MeOH, PBS, H 2 O 및 0.1 mol / L HCl), 용출을위한 5mL 튜브 및 로봇 바늘 용 세척 용액 (일반적으로 H2O).</li>
		<li>수동 SPE에 대해 설명된 단계를 정확하게 기반으로 로봇의 소프트웨어에서 응용 프로그램 또는 방법을 사용합니다(단계 5.2). 알림: 세부 사항은 기기 공급업체마다 크게 다를 수 있으므로 프로그래밍은 해당 로봇의 소프트웨어 설명서를 참조하십시오. 피펫팅 로봇은 일반적으로 원심분리 대신 카트리지에 공기 압력을 가하여 작동하며, 이것이 주요 차이점입니다. 프로토콜이 설정되고 처음으로 실행되는 경우 최적의 작업 흐름을 확인하기 위해 대조군(예: 알려진 농도의 L-아르기닌)을 포함합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. NMR의 최종 준비
<ol><li>암모니아와 H2O를 제거하기 위해 건조를 완료하기 위해 밤새 샘플을 동결 건조시킵니다.</li>
	<li>각 샘플을 500μL의 NMR 완충액에 용해시키고(단계 1.4) NMR 튜브로 옮깁니다. 중요한 것은 부피가 모든 튜브에서 동일해야 하며 샘플이 균질해야 한다는 것입니다(응집되는 경향이 있는 잔류물과 지질이 없음). 참고 : NMR 분광법의 세부 사항은이 방법 검토를 넘어서서 다른 곳에서 더 자세히 설명됩니다27. 여기에서는 주요 요구 사항과 단계 만 설명합니다. 아르기닌과 그 대사 산물의 정량화는 600MHz NMR 분광계에서 수행됩니다 ( 재료 표 참조). 원칙적으로 아르기닌과 메틸화 아르기닌의 NMR 신호가 신호 중첩 없이 충분한 감도로 검출될 수 있는 경우 다른 NMR 분광계/NMR 전계 강도를 사용할 수 있습니다. 펄스 시퀀스가 그에 따라 설정되는 경우 1H-스펙트럼을 기록할 수 있는 z축 그래디언트를 가진 모든 프로브 헤드를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>CPMG(카-퍼셀-메이붐-길) 펄스 시퀀스33,34(cpmgpr1d, 512 스캔, 600MHz NMR에서 fid 73728, 11904.76Hz 스펙트럼 폭의 크기, 재활용 지연 4초)를 사용하여 물 신호 억제를 사용하여 1D 스펙트럼을 기록합니다.</li>
	<li>이 실험에서는 가상 디커플링으로 1H스칼라 커플링을 제거하여 신호 중첩을 줄입니다. 특정 질문 및/또는 복잡한 샘플 또는 매트릭스(예: 1H-13C-헤테로핵 단일 양자 일관성(HSQC) 스펙트럼27)에 대해 추가로 기록합니다. 참고: 메틸화 아르기닌의 1H NMR 신호가 다른 대사체(예: 라이신)의 1H NMR 신호와 부분적으로 겹칠 수 있는 보다 복잡한 매트릭스의 경우 1H호모 핵 J-분해 스펙트럼(JRES)35이 필요합니다.</li>
	<li>알려진 농도(예: 100μmol/아르기닌)의 표준물질의 각 피크 강도를 통합하여 절대 정량화를 수행합니다. 참고: 일반적으로 ADMA, SDMA 및 MMA( 재료 표 참조)는 아르기닌에 대한 비율로 보고됩니다. 이는 별도의 정규화(예를 들어, 세포 수, 조직 질량, 단백질 농도)가 수행될 필요가 없다는 상당한 이점을 갖는다. 이 경우 아르기닌은 내부 표준으로 사용되며 상대적 정량화는 생물학적으로 관련된 정보를 얻기에 충분합니다.</li>
	<li>SDMA 및 MMA의 분화를 위해, 샘플을 다시 동결건조하여D2O(이전에 NMR 완충액에 재현탁된 경우)를 제거한 다음, 중수소화 디메틸설폭사이드(d6-DMSO)로 대체하여 메틸 공명27의 분해능을 가능하게 합니다. 따라서 파스퇴르 피펫으로 NMR 튜브에서 샘플을 흡입하고 동결 건조하여 500μL의 d 6-DMSO에 용해시킵니다.</li>
</ol>

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<li>Stryeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentrations+of+Citrate%2C+Tyrosine%2C+2-+and+3-+Hydroxybutyrate+are+associated+with+increased+3-month+mortality+in+acute+heart+failure+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6743(2019).</li>
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<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+human+hepatocellular+tumors+undergo+a+global+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming.</a> Cancers. 13 (8), (2021).</li>
<li>Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation%3A+Cellular+functions+and+methods+of+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).</li>
<li>Habisch, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroectodermally+converted+human+mesenchymal+stromal+cells+provide+cytoprotective+effects+on+neural+stem+cells+and+inhibit+their+glial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation.</a> Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).</li>
<li>Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+ultrasensitive+luminescence+assay+for+protein+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).</li>
<li>Hevel, J. M., Price, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+direct+measurement+of+methyltransferase+activity+in+about+30min%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min.</a> Methods. 175, 3-9 (2020).</li>
<li>Altincekic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+detection+of+arginine+methylation+in+highly+repetitive+protein+motifs+of+low+sequence+complexity+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).</li>
<li>Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FUS+about+arginine+methylation+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD.</a> The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

다음 섹션에서는 메서드 자체에 중점을 둡니다. 아르기닌 메틸화의 생물학적 의미는 소개 섹션에 설명되어 있습니다.
첫째, 다른 강성의 조직은 샘플 용해의 조정이 필요할 수 있습니다 : 세포 배양 (박테리아, 효모 등 포함)의 세포와 뇌, 젊은 간, 평활근 등과 같은 조직은 신속하게 균질화 될 수 있습니다. 높은 강성 조직 (노인 피험자의 간, 동맥, 뼈 등 포함)의 경우 균질화를 두 번 수행해야합니다 (3.2.3 단계 참조). 그럼에도 불구하고,이 과정은 일부 불용성 잔류 물이 남아 있더라도 더 자주 계속되어서는 안됩니다. 대신, 샘플을 10,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 추가 분석을 위해 상청액을 수집해야 합니다(샘플 분해를 최소화하기 위해).
샘플이 동결되는 각 단계(초기에는 MeOH를 첨가한 후, 각각 3.3, 3.4 또는 3.5단계) 또는 동결건조 후(단계 4.4 및 6.1), 샘플은 추가 처리...

지난 20 년 동안 아르기닌 잔기의 메틸화는 단백질의 필수적인 번역 후 변형으로 인식되었습니다. 그것은 전사 조절, 신호 전달 등과 같은 기본적인 생물학적 과정에 영향을 미칩니다1. 아르기닌 메틸화 조절에 관여하는 주요 단백질은 단백질 아르기닌 메틸 전이 효소 (PRMT)2. 아르기닌의 주요 유도체는 ω- (NG, NG)- 비대칭 디메틸 아르기닌 (ADMA), ω- (NG, NG)- 대칭 디메틸 아르기닌 (SDMA) 및 ω-NG- 모노 메틸 아르기닌 (MMA)2입니다.
PRMT는 S- 아데노 실 -l- 메티오닌을 사용하여 메틸기를 단백질 결합 아르기닌1의 말단 구아니디노 그룹 (두 개의 동등한 아미노기 포함)으로 전달합니다. 두 가지 주요 효소를 구별 할 수 있습니다 : 유형 I 및 유형 II 효소는 MMA를 형성하기 위해 첫 번째 메틸화 단계를 촉매합니다 (따라서 대칭을 잃습니다). 이 단계에 따라 I형 효소(예: PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8)는 MMA를 기질로 사용하여 ADMA를 형성하는 반면, II형 효소(주로 PRMT5 및 PRMT9)는 SDMA를 생성합니다. PRMT1은 포유동물 세포3으로부터 단리된 최초의 단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라제였다. 그럼에도 불구하고 PRMT는 비포유류 척추동물, 무척추동물 척색동물, 극피동물, 절지동물, 선충류자포동물5, 식물6 및 효모7과 같은 균류를 포함한 원생동물과 같은 다른 동물에서 진화적으로 보존되었습니다.4 많은 경우, PRMT 중 하나의 녹아웃은 생존력 상실로 이어져 전사, 번역, 신호 전달, 세포 사멸 및 액체-액체 상 분리 (막이없는 세포 기관의 형성을 의미 함)와 같은 기본적인 세포 과정에 관여하는 메틸화 아르기닌 종의 필수적인 역할을 밝혀냅니다. . 차례로, 이것은 암 11,12,13, 다발성 골수종 14, 심혈관 질환 15, 바이러스 병인, 척수성 근위축증16, 당뇨병 17, 및 노화1을 포함하는 생리학 및 질병 상태에 영향을 미칩니다. 혈류 내의 증가된 ADMA 수준, 예를 들어, 단백질 분해로 인한 폐(18)로부터 유래된 것은 내피 기능장애, 만성 폐 질환(19) 및 심혈관 질환(20)의 다른 증후군과 관련이 있는 것으로 생각된다. PRMT의 과발현은 종양 형성을 가속화하는 것으로 밝혀졌으며 나쁜 예후와 관련이 있습니다21,22. 또한, PRMT6 및 PRMT7의 절제는 세포 노화 표현형23을 유발한다. 현저한 ADMA 및 PRMT1 감소는 WI-38 섬유아세포의 노화 동안 발견되었다24.
문제는 (patho) 생리적 과정에서 메틸화가 어떻게 작용하는지 이해하는 것이 단백질 아르기닌 메틸화를 식별하고 정량화하는 것입니다. 현재 접근법의 대부분은 항체를 사용하여 메틸화 된 아르기닌을 검출합니다. 그러나, 이들 항체는 여전히 문맥-특이적이고, 아르기닌 메틸화 단백질25,26의 상이한 모티프를 인식하지 못할 수 있다. 설명된 프로토콜에서, 전술한 모든 아르기닌 유도체는 핵자기 공명(NMR) 분광법, 즉 단독으로, 조합하여, 또는 대부분의 경우에서와 같이, 진핵 세포(예를 들어, 효모, 마우스, 또는 인간 기원으로부터) 및 조직(27) 및 혈청(28)과 같은 복잡한 생물학적 매트릭스 내에서 신뢰성 있게 정량화될 수 있다. 단백질 및 이러한 복합 매트릭스의 경우, 단백질 가수분해29는 아르기닌, MMA, SDMA 및 ADMA와 같은 유리(변형된) 아미노산을 생성하기 위한 전제 조건이다. 고체상 추출(SPE)30은 관심 화합물의 농축을 가능하게 합니다. 마지막으로, 1H-NMR 분광법은 아르기닌과 아르기닌의 모든 주요 메틸 유도체의 병렬 검출을 허용합니다. NMR 분광법은 진정으로 정량적이고 재현성이 높으며 강력한 기술이라는 장점이 있습니다31,32. 최종 NMR 측정은 나중에 많은 샘플이 수집되고 준비되면 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 자체 NMR 분광기가 필요하지 않기 때문에 주로 샘플 준비에 중점을 둡니다. 대부분의 생화학 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 그러나 NMR 분광법 측정을 수행해야 하는 몇 가지 힌트가 이 작업에서 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>15mL 튜브</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimethylsilyl) 프로피온산-2,2,3,3-d4 나트륨 염(TSP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>5mL 튜브, 둥근 바닥</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>암모니아 용액 32%</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 600MHz NMR 분광계, TXI 프로브 헤드</td><td>장착 Bruker</td><td>- </td><td></td></tr><tr><td>원심분리기, 냉장, 예: 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform &ge; 연 99%</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr> SpeedVac 시스템 <tr><td>중수소 산화물 (D<>sub2O)</td>용 Cryocool Thermo Scientific SCC1 열전달 유체<td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>건조 챔버</td><td>바인더</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>DURAN 배양 튜브, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>Edwards 딥 진공 오일 펌프 RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>SpeedVac 시스템의 일부</td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL 튜브</td><td>Greiner Bio One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Gilson 피펫팅 로봇 GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td></td><td></td>26150008</tr><tr><td>L-아르기닌</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>메탄올 &ge; 99%</td><td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 물 아파라투스</td><td>Millipore ZIQ7000T0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL 카트리지</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td>https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/</td></tr> <tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Lonza</td><td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 조직 균질화 Bertin</td><td> 기기</td><td>P000669-PR240-A</td><td>https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/</td></tr> <tr><td>Precellys tubes (pulping tubes)</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Precellyse 1.4 mm 지르코늄 산화물 비드</td><td>VWR International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Reacti-Therm/ReactiVap 가열, 교반 및 증발 모듈</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18820</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브용 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 로터, FA-45-30-11</td><td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant 냉장 냉각 트랩</td><td>Thermo Scientific</td><td>15996161</td><td>SpeedVac 시스템의 일부</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac 진공 농축기 SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>SpeedVac 시스템의 일부; 장착 1.5 ml 튜브용 로터 포함</td></tr><tr><td>, PTFE 밀봉 유리 바이알용 스크류 캡, DN9</td><td>Dr. R. Forche 크로마토그래피</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>Seasand</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>쇼트 스레드 유리 바이알 1.5 mL, ND9</td><td>Dr. R. Forche 크로마토그래피</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨(NaN3)</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4)VWR</td><td></td> <td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0 (Software)</td><td>Bruker-https://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-monomethylarginine (MMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-NG'-대칭 디메틸아르기닌 (SDMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

핵자기공명분광법에 의한 아르기닌 메틸롬 탐구

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

단백질 결합 아르기닌은 일반적으로 많은 단백질에서 메틸화되며 물리 화학적 특성, 다른 단백질 또는 핵산을 포함한 다른 분자와의 상호 작용을 변경함으로써 기능을 조절합니다. 이 연구는 비대칭 및 대칭 디메틸아르기닌(각각 ADMA 및 SDMA) 및 모노메틸 아르기닌(MMA)을 포함하여 아르기닌과 그 유도체를 정량화하기 위한 쉽게 구현할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 생물학적 체액, 조직 또는 세포 용해물로부터 단백질을 분리한 후, 균질화, 단백질의 침전 및 단백질 가수분해를 위한 간단한 방법이 설명된다. 가수분해물에는 다른 아미노산, 지질 및 핵산과 같은 많은 다른 성분이 포함되어 있기 때문에 고체상 추출(SPE)을 사용한 정제 단계가 필수적입니다. SPE는 원심분리기 또는 피펫팅 로봇을 사용하여 수동으로 수행할 수 있습니다. 현재 프로토콜을 사용하는 ADMA의 감도는 약 100nmol/L입니다. 아르기닌의 검출 상한은 SPE 포화로 인해 3mmol/L입니다. 요약하면, 이 프로토콜은 생물학적 샘플 준비에서 NMR 기반 검출에 이르는 강력한 방법을 설명하며, 아르기닌 메틸롬을 연구할 때 성공적인 작업을 위한 귀중한 힌트와 함정을 제공합니다.

일상적으로, 2D J-분해능(JRES), 사실상 분리된 NMR 스펙트럼의 1H 1D투영이 당사 실험실(36)에서 피크 할당 및 정량화를 위해 사용된다. 도 3은 본 SPE 프로토콜을 사용하여 정제된 효모 단백질 가수분해물의 대표적인 JRES 스펙트럼을 나타낸다. 농도는 매우 다르지만 두 물질은 세포 매트릭스에서 분리되고 정량화 될 수 있습니다. 각각의 화학적 이동에서 특정 메틸 (-CH3) 또는 메틸렌 (-CH2-) 그룹의 양성자 수를 기준으로 1H-NMR 분광법은 정확한 정량화를 허용합니다. 프로토콜(단계 0)에서 지적한 바와 같이, 아르기닌과 비교한 메틸-아르기닌 유도체의 상대적 정량화는 주로 생물학적 과정, 예를 들어 유전자의 녹다운/과발현, 영양소의 변화 또는 억제제 처리와 같은 조절에 대한 반응으로서 아르기닌 메틸화의 변화를 관찰하는 데 적합합니다...

본 프로토콜은 1H-NMR 분광법에 의한 유리 및 단백질 결합 아르기닌 및 메틸 아르기닌의 제조 및 정량 측정을 설명합니다.

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

이 프로토콜은 아르기닌 메틸화의 수준과 역학을 정량화하는 것을 가능하게합니다. 이 변형은 중요한 조절 역할을하며 질병에 대한 바이오 마커 역할을 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 세포, 배지에서 조직 및 생체 유체에 이르기까지 거의 무제한의 매트릭스에 대한 간단한 워크 플로우를 제공한다는 것입니다.아르기닌 메틸화는 많은 인간 암에서 상승하며 아르기닌 방법 전이 효소의 첫 번째 억제제는 임상 시험에서 테스트됩니다. 이 방법은 환자의 계층화 및 위험 평가에 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Hansjorg Habisch가 될 것입니다.액체 샘플의 경우 200 마이크로 리터의 샘플에 400 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 메탄올을 첨가 한 다음 섭씨 영하 20도에서 30 분 동안 배양합니다. 이 샘플을 섭씨 4도에서 30 분 동안 10, 000G에서 원심 분리합니다. 상청액을 옮기고 1.5 밀리리터 튜브에 펠릿을 모으십시오.고체 물질의 경우 600 마이크로 리터의 66 % 메탄올 물을 30-60 밀리그램의 조직 또는 세포 펠릿이 들어있는 펄프 화 튜브에 첨가하십시오. 연조직을 20초 동안 1회 균질화하고 뻣뻣한 조직을 20초 동안 2회 균질화하고 그 사이에 5분 간격으로 균질화한다. 즉시 샘플을 얼음 위에 놓고 모든 용해물을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴 다음 배양하십시오.이어서, 샘플을 10, 000 G에서 30분 동안 원심분리한다. 섭씨 4도에서 1.5 밀리리터 튜브에서 상청액을 선택하고이 상청액을 사용하여 단백질 가수 분해를 진행합니다. 각 튜브의 캡을 자릅니다.그런 다음 각 샘플에 500 마이크로 리터의 9 몰 염산을 첨가하십시오. 마지막으로 튜브를 유리관에 넣습니다. 캡으로 단단히 닫고 적절한 밀봉을 보장하고이 튜브를 부분적으로 모래로 채워진 유리 비커에 넣으십시오.샘플을 건조 챔버에서 섭씨 110도에서 16시간 동안 가수분해한다. 샘플을 냉각하고 고진공 원심 분리기를 사용하여 밤새 동결 건조하십시오. 다음날, 완전히 건조 된 펠릿을 0.1 몰 염산 1 밀리리터에 녹입니다.각 튜브에 50 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 펠렛을 완전히 용해시킵니다. 전체 부피를 새 튜브로 옮기고 샘플을 10분 동안 원심분리합니다. 조심스럽게 새 튜브에 이상성 액체의 상부 단계를 수집하십시오.수동 용 플라스틱 튜브 또는 로봇 고체상 추출용 유리관을 사용하십시오. 수동 고체상 추출의 경우 모든 실행에서 카트리지를 사전 컨디셔닝한 후 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 샘플을 SPE 카트리지에 로드하고 실온에서 2분 동안 600G로 원심분리합니다.카트리지를 1 밀리리터의 물로 3 번 세척 한 다음 1 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 0.1 몰 염산 1 밀리리터로 5 회 세척 한 다음 실온에서 800G에서 1 분간 원심 분리합니다. 메탄올 1 밀리리터로 카트리지를 두 번 씻은 다음 1 분 동안 원심 분리합니다.아르기닌과 그 유도체를 1 밀리리터의 3 X 교체 용액과 원심 분리기를 추가하여 단일 15 밀리리터 튜브에 1 분 동안 두 번 용리시킵니다. 로봇 고체상 추출의 경우 용출액 수집용 튜브와 이상성 액체의 상부 위상이 포함된 유리관을 로봇의 각 위치에 배치합니다. 수동 SPE에 대해 설명된 단계에 따라 소프트웨어에서 애플리케이션 또는 방법을 사용합니다.암모니아와 물을 제거하기 위해 샘플을 밤새 동결 건조하여 완전히 건조시킵니다. 균질해질 때까지 각 샘플을 500 마이크로리터의 NMR 버퍼에 용해시킵니다. 그런 다음 동일한 양의 균질 샘플을 각 NMR 튜브로 옮깁니다.SPE 프로토콜을 사용하여 정제된 효모 단백질 가수분해물의 J-RES 스펙트럼이 여기에 표시됩니다. 다른 특징적인 화학적 이동은 L- 아르기닌과 ADMA를 3.25 및 3.02ppm으로 구별 할 수 있습니다. 두 물질은 세포 매트릭스에서 분리되고 정량화 될 수 있습니다.각각의 화학적 이동에서 특정 메틸 또는 메틸렌 그룹의 양성자 수를 기반으로 하나의 H 핵 자기 공명 분광법으로 정확한 정량화가 가능합니다. 이 접근법을 사용하면 SDMA와 MMA의 1H 핵자기 공명 화학적 이동을 2.76ppm SDMA 및 2.74ppm MMA의 특징적인 화학적 이동으로 분리하고 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜을 수행 할 때 피펫으로 수용성 분획을 함유 한 2 상 액체의 상부 단계를 조심스럽게 수집하여 새 튜브로 옮깁니다.수동 SPE에는 1.5밀리리터 튜브를 사용하거나 로봇 SPE에는 클래스 유리를 사용하십시오. 클로로포름과 그 내용물을 흘리지 마십시오. 아르기닌 및 메틸화 아르기닌 종을 함유하는 용출액은 NMR 분광법을 사용하여 분석된다.이것은 이러한 종의 절대량을 산출합니다. 우리의 기술은 현재 아르기닌 메틸화의 병태 생리 학적 역할을 해부하는 것을 목표로하는 수많은 기초 연구 프로젝트에 사용되고 있습니다. 또한, 우리는 단백질 아르기닌 메틸화를 여러 인간 질병의 바이오 마커 후보로 평가하고 있습니다.

exploring-arginine-methylome-nuclear-magnetic-resonance

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

환원적으로 13C- 메틸화 된 N- 말단 라이신의 α- 및 ε- 디메틸 아민 핵 자기 공명 신호를 할당하는 두 가지 방법이 설명됩니다. 한 가지 방법은 환원성 메틸화 반응의 pH 유도 선택성을 활용하고, 다른 방법은 아미노펩티다아제를 사용하여 N 말단 라이신을 선택적으로 제거합니다.

의 NMR 공명 확인하는 방법<sup&gt; 13</sup환원 메틸을 단백질에&gt; C-디메틸 N-말단 아민

단백질 아르기닌 메틸화, 즉 효소의 클래스에 의해 촉매. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 (PRMTs)는 단백질 내의 아르기닌에 메틸기 (들)의 첨가의 효소 과정이다. 체외 메틸화 분석은 공지 또는 신규 PRMT 기판의 메틸화 상태를 평가하기위한 가장 신뢰할 도구이다.

체외 메틸화 분석에서 단백질 아르기닌 메틸화를 공부합니다

SPOT 방법으로 합성된 펩타이드 어레이는 단백질 라이신 메틸전이효소(PKMT)의 기질 특이성을 분석하고 PKMT의 기질 스펙트럼을 정의하여 생물학적 역할을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 펩타이드 어레이를 합성하고, PKMT로 메틸화하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

DNA 메틸화는 다양한 자극에 대한 반응으로 유전자 발현의 역동적인 변화를 허용할 뿐만 아니라 안정적인 수준의 유전자 발현을 유지할 수 있습니다. DNA 메틸화의 유전자 특이적 변화와 이러한 변화가 유전자 발현에 미치는 영향을 연구할 수 있는 기술에 대해 자세히 설명합니다.

유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

이 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 재구성에 대해 설명합니다. 동시에, 비대칭 번역 후 개질은 뉴 클레오 히스톤 premodified 복사를 사용한 후 발생 될 수있다. 이러한 제제는 즉시 고해상도 NMR 분광법을 이용하여 두 자매 히스톤 동시에, 수정 누화 메커니즘을 연구하는데 사용될 수있다.

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

이러한 프로토콜은 세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라아제(PRMT) 제품군의 개별 구성원의 효소 활성을 평가하는 데 사용되는 방법론을 제공한다. 내인성 및 외인성 바이오마커, 메틸-아르기닌 인식 항체 및 억제제 툴 화합물을 이용한 PRMT 활성 평가에 대한 상세한 지침이 설명되어 있다.

세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제 1-9 활성을 연구하는 정량적 방법

여기에서는 용액에서 단백질-글라이칸 상호 작용을 특성화하는 것을 목표로 하는 일련의 NMR 실험의 획득, 처리 및 분석을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 가장 일반적인 리간드 기반 및 단백질 기반 방법론이 요약되어 있으며, 이는 의심할 여지 없이 구조 당생물학 및 분자 인식 연구 분야에 기여합니다.

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

여기서는 도트 블롯을 이용해 전반 m⁶A 수치를 반정량적으로 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 총 RNA를 추출, 변성, 나일론 막에 점상화하고, 항-m⁶A 항체로 탐침하며, 화학발광으로 시각화합니다. ImageJ 그레이스케일 분석으로 정량화된 신호 강도는 상대적인 메틸화 풍부도를 반영하여 연구에 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

글로벌 N6-메틸라데노신 RNA 변형 수준을 검출하기 위한 도트 블롯 분석

후속 샘플 용해를 통한 동적 핵 분극은 생물학적 시스템의 신진대사에 대한 실시간 연구를 가능하게 했습니다. 과분극[1-13C]피루브산은 in vitro에서 전립선 암종 세포주에서 젖산 탈수소효소 활성을 연구하는 데 사용되었습니다.

과분극 (13) C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

학습하세요 핵자기공명분광법을 이용한 아르기닌 메틸화 정량 분석 방법을 세포와 조직 등 다양한 생물학적 샘플에 적용하여 질병 바이오마커 연구에 활용하는 기술입니다.

핵자기공명분광법에 의한 아르기닌 메틸롬 탐구

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